CN103468644B - 产生抗人d-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用ELISA法克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。并利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以D-二聚体作为检测抗原，进行抗体配对试验，获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。杂交瘤细胞株分泌相应的单克隆抗体，能进行配对和检测天然血清，初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。

Description

产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人D-二聚体的单克隆抗体。

背景技术

D-二聚体（D-dimer）是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。具体而言，血浆中纤维蛋白原在凝血酶（thrombin)、FactorXIIIa（转谷酰胺酶）和钙离子的作用下，去掉血纤肽A、B，暴露出新的结合位点，自发聚集形成非共价结合的纤维蛋白束；纤维蛋白束再在FactorXIIIa的作用下，形成γ-γ的异肽键，将聚合形式以共价键的方式稳定下来，称为交联纤维蛋白，即血栓的基本骨架；交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下，降解为不同大小的交联纤维蛋白降解产物，其最小结构（DD/E，也有文献认为是DD）因为含有两个由异肽键共价交联的D片段而称为D-二聚体。

近年来，D-二聚体作为体内交联纤维蛋白水解的标志性产物，其临床诊断价值已得到普遍认同。它以其高度的敏感性和阴性预示能力，在深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）的排除、弥散性血管内凝血（DIC）的诊断及溶栓治疗效果监测等方面具有很好的临床应用价值。

目前实验室中检测D-二聚体都是基于免疫学的方法，包括免疫层析（胶体金）方法、双向测流免疫测定法、化学发光酶联免疫法和免疫比浊测定法（包括免疫散射比浊法和免疫投射比浊法，每一种又有乳胶凝集增强和普通的两种类型）。所有这些方法都需要高质量的D-二聚体特异性抗体，上述部分方法只用一种抗体即可工作，部分方法需要两种抗体进行配对后才能实现测定。目前D-二聚体检测所用抗体全部来自于国外，国内尚未见到相关抗体报道和销售，客观上影响了国内公司在D-二聚体检测试剂上的研发，在一定程度上导致了目前国内D-二聚体检测试剂市场基本上被欧美公司全部占据的局面。

发明内容

本发明根据临床病人在凝血-纤维蛋白溶解过程中血液成分的相关变化，以纯化的天然D-二聚体为免疫原，通过改良的杂交瘤技术，获得杂交瘤细胞株，分泌D-二聚体特异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体能够配对用于D-二聚体的免疫检测。该抗体对将有助于D-二聚体免疫检测试剂的研发。

本发明提供的两株产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明将其命名分别为1C6（细胞保藏号CCTCCNO：C2013138），培养物名称：杂交瘤细胞株1-C6（IgG1）和1D10（细胞保藏号CCTCCNO：C2013139），培养物名称：杂交瘤细胞株1-D10(IgG2b)。保藏单位为中国典型培养物保藏中心（ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏日为2013年9月5日。

杂交瘤细胞株1C6和1D10均由纯化的D-二聚体免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。

本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1C6所产生的单克隆抗体。

本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1D10所产生的单克隆抗体。

本发明还提供一种用于检测D-二聚体的试剂盒，其包含杂交瘤细胞株1C6和/或1D10所产生的单克隆抗体。

本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法，其主要包含步骤：

1）用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠；

2）通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合，利用间接ELISA法进行正向和负向筛选，克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

具体地，步骤1）包含：将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。2周后，追加免疫一次。

具体地，步骤2）包含：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，以聚乙二醇为融合剂，形成融合细胞，将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置CO₂中在37℃培养；用间接ELISA法进行筛选，筛选时，先用纤维蛋白原及其降解产物包被，进行负向筛选，去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞；然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。

上述的单克隆抗体可用于制备检测人D-二聚体的制剂。

本发明利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以D-二聚体作为检测抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。

本发明通过杂交瘤技术，制备了抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10，分泌相应的单克隆抗体，能进行配对和检测天然血清，初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1表示单克隆抗体1C6的ELISA鉴定，其中上行为包被D-二聚体抗原，中行为包被D-单体，下行为包被纤维蛋白原及其降解产物；每一行中左边第1孔为阴性对照，第2到12孔为抗体倍比稀释，从1:1000、1:2000、…….到1:10⁶。

图2表示单克隆抗体1D10的ELISA鉴定，其中上行为包被D-二聚体抗原，中行为包被D-单体，下行为包被纤维蛋白原及其降解产物；每一行中左边第1孔为阴性对照，第2到12孔为抗体倍比稀释，从1:1000、1:2000、…….到1:10⁶。

图3表示单克隆抗体1C6的免疫印迹鉴定，其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹，右侧为变性电泳后的免疫印迹；每图中，DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原，DD-C为国内公司的D-二聚体抗原，第三和第四条分别为D片段（Dfragment）和E片段（Efragment）。

图4表示单克隆抗体1D10的免疫印迹鉴定，其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹，右侧为变性电泳后的免疫印迹；每图中，DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原，DD-C为国内公司的D-二聚体抗原，第三和第四条分别为D片段（Dfragment）和E片段（Efragment）。

图5表示HRP标记抗体的效价检测结果。其中上行为单克隆抗体1C6，下行为单克隆抗体1D10；包被抗原为D-二聚体，孔1、2和3是阴性对照，孔4为标记抗体1:1000稀释，孔5为1:2000，孔6为1:4000，……，孔12为1:256000。

图6表示D-二聚体ELISA检测体系的分析特异性鉴定，分别测定D-二聚体和各种相关抗原，横坐标为抗原浓度，单位为单位为μg/ml；纵坐标为450nm处吸光度。

图7表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线，横坐标为D-二聚体的浓度，单位为μg/ml；纵坐标为450nm处吸光度。

图8表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimerPlus试剂测定结果比较，横坐标为本发明中涉及方法的检测结果，纵坐标为Siemens公司的D-dimerPlus试剂测定结果，单位均为ng/mL。

具体实施方式

本发明以纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，腹水经HiTrapIgGPurificationHP亲和层析柱纯化，所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌D-二聚体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10，ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。

本发明建立了D-二聚体的ELISA检测体系：应用抗D-二聚体抗体1C6为捕获抗体，抗D-二聚体抗体1D10为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，能够准确检测血清中的天然D-二聚体，并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。

材料和来源

实验动物：Balb/C小鼠购自第三军医大学实验动物中心（中国重庆）。

细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

D-二聚体等抗原购自Abcam公司，HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。

纯化柱和填料购自美国GE公司。

其余试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1抗D-二聚体单克隆抗体的制备

1.D-二聚体单克隆抗体的制备

将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫（100μg/ml）。2周后，将D-二聚体与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫（100μg/ml）；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死小鼠取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。

融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0）以8:1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6%CO₂中在37℃培养。用间接ELISA法进行筛选。筛选时，先用纤维蛋白原及其降解产物包被，进行负向筛选，去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞；然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于6%CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。

采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡0.5mL，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×10⁵个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。

2.D-二聚体单克隆抗体的纯化

收集腹水后对其进行纯化，具体方案为：配置抗体纯化所需buffer：BindingBuffer（A液）20mmol/L磷酸钠，0.8mol/L(NH4)₂SO₄，pH7.5；ElutionBuffer（B液）：20mmol/L磷酸钠，pH7.5；RegenerationBuffer（C液）：20mmol/L磷酸钠，pH7.5，并按体积比30%加入异丙醇；在单抗腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用HiTrapIgGPurificationHP柱接入AKTAprime蛋白纯化仪，A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻于-20℃保存；用RegenerationBuffer使填料进行再生，然后用BindingBuffer进行平衡即可。

3.ELISA鉴定抗D-二聚体单克隆抗体

将纯化的D-二聚体抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入二抗，1:3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。结果如图1和图2所示，单克隆抗体1C6对D-二聚体效价达到1:50万，对D-单体的效价为1:8000，对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0；单克隆抗体1D10对D-二聚体效价为1:100万，对D-单体效价为0，对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0。

4.抗D-二聚体单克隆抗体的免疫印迹鉴定

1）将Marker3μl、D-二聚体抗原20μl、相关对照抗原20μl行SDS-PAGE。

2）电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。

3）将0.22μmPVDF膜先用无水甲醇处理20s，再用ddH₂O洗涤5min。然后再浸入TransferBuffer超过5min。同时将滤纸浸入TransferBuffer中。

4）转膜：从下至上依次排列：滤纸—PVDF膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18V恒压电转移1.5h。

5）转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH₂O清洗两遍，TBST洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。

6）弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次15min。

7）加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次，每次15min。

8）加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。

9）1×TBST洗涤3次，每次15min。

10）用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在D-二聚体对应分子量处处均可见抗D-二聚体单克隆抗体结合清晰条带。结果如图3和图4所示。在7%非变性条件下，单克隆抗体1C6和1D10均能识别并结合两种不同来源的D-二聚体，不识别D-片段和E-片段，在7%变性条件下，两种单克隆抗体均不识别和结合这四种形式的抗原。。

实施例2双抗体夹心ELISA法检测D-二聚体

1.HRP标记抗体

本法是以NaIO_４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：

1）HRP酶的准备：称取10mgHRP酶，加2mL纯水配置为5mg/ml的HRP液体，按照每mgHRP酶加入34μL计算，加340μLNaIO₄，4℃避光放置，1h后，按照每mgHRP酶加入250μL的量加入乙二醇250μL，避光放置4℃，30min后转入透析袋中，用1mM醋酸缓冲液（pH4.0～4.4）透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。

2）抗体的准备：0.01M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜，并测定蛋白浓度。

3）标记：抗体与HRP酶按1:1（质量比）混合，加入1mol/LNa₂CO₃缓冲液（1:80），调解反应的pH为9.5，25℃反应2～3h。

4）终止：新鲜配制0.1mol/LNaH₄B（4mg/mL），按照每mgHRP酶加入47μL。4℃放置2h后，转入透析袋。用0.01mol/LPBS缓冲液（pH7.0～7.2）透析过夜，期间至少换液两次，避光。

5）HRP标记抗体的效价检测：将纯化的D-二聚体抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板，加入350μl/孔的1%BSA进行封闭，37℃，2h。洗板后将HRP标记好的待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴性对照孔。37℃孵育40min，弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。结果如图5所示，结果显示，1-C6和1-D10酶标抗体的效价均＞1:256000，满足应用要求。

6）分装保存：标记好的抗体用棕色EP管分装，并测定抗体效价。-20℃避光保存。

2.抗体配对及临床样本的检测

1）标本收集：

从第三军医大学第一附属医院收集临床血浆标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5mlEp管中，-80℃保存，并将病人基本信息录入电脑，做好编号。

2）标本检测：

选取单克隆抗体1C6作为捕获抗体，酶标单克隆抗体1D10作为检测抗体，D-二聚体校准品为测定对象，检测方法如下：a.包被酶标板：用包被液将抗体稀释为5μg/ml，每孔加100μl，4℃包被过夜。b.将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。c.封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1h，洗涤3遍，甩干。d.用抗体稀释液将D-二聚体校准品从50μg/ml开始倍比稀释，每孔加100μl，第一孔为空白对照，做标准曲线。检测临床标本时，每孔加标本100μl，37℃孵育1h。e.洗板3遍，甩干。f.将相对应的酶标二抗以1：5000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育30min。g.洗板5遍，甩干。h.每孔加入100μl底物显色液，室温避光显色5min。i.每孔加入50μl终止液，450nm处读取吸光度值，同时制作标准曲线，根据标准曲线确定临床样本中D-二聚体的含量。

具体请参照图6、图7和图8。图6显示基于单克隆抗体1C6和1D10建立的ELISA体系结果表明，新建的ELISA仅对D-二聚体反应，而对纤维蛋白原、FgDP-X和FgDP-Y没有反应，提示该检测体系具有良好的特异性。图7表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线，横坐标为D-二聚体的浓度，单位为μg/ml；纵坐标为450nm处吸光度。提示该检测体系在0-2μg/ml范围内线性良好。图8表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimerPlus试剂测定结果比较，横坐标为本发明中涉及方法的检测结果，纵坐标为Siemens公司的D-dimerPlus试剂测定结果，单位均为ng/mL。提示该检测体系与公认方法检测结果相关良好，具有很好的检测准确度。

同时请参照表1，其中对D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Simens公司的D-dimerPlus试剂测定结果进行了比较，结果表明，对于阴性标本，二者之间的符合率为97%，对于阳性标本，二者之间的符合率为84%，总体符合率为91%。

表1新建ELISA体系与公认试剂检测结果比较

	阴性结果	阳性结果	合计
				Siemens D-Dimer PLUS	140	112	252
1C6/1D10	136	94	230
				符合率（%）	97	84	91

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (6)

1.一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2013138。

2.一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2013139。

3.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

4.一种权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

5.一种用于检测人D-二聚体的试剂盒，其包含权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体。

6.权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。