CN103468620B

CN103468620B - 一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用

Info

Publication number: CN103468620B
Application number: CN201310444753.7A
Authority: CN
Inventors: 段春华; 牛赡光; 刘幸红; 王清海; 郑香军; 周峰; 田龙军
Original assignee: Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Shandong Academy of Forestry
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-09-26
Also published as: CN103468620A

Abstract

本发明公开了一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用，属于生物防治植物病害领域。该菌株为微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）ACT033，保藏编号CGMCC No.8125。本发明还公开了一种采用该新的微白黄链霉菌菌株ACT033制备的能够高效防治黄瓜霜霉病的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的微白黄链霉菌菌株ACT033具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该微白黄链霉菌菌株ACT033制备的生物防治制剂，不仅能够防治黄瓜霜霉病，还能有效提高作物产量。

Description

一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用

技术领域

本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治黄瓜霜霉病的微白黄链霉菌，以及采用该微白黄链霉菌制备的生物防治制剂。

背景技术

植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。

链霉菌属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是一类菌丝体呈分枝状的好氧革兰氏阳性细菌，广泛分布在自然界的各种环境中，尤其是土壤中，因此具有很强的根际定植能力。链霉菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，链霉菌的生防作用主要是由其产生的抗生素实现的，具有高效、低残留、与环境友好等优点。现已筛选出的抗生素中，有80%以上是由放线菌产生，而其中的90%以上是由链霉菌产生。由于链霉菌是重要的天然抗生素来源的微生物类群，因此从土壤中分离具有农用活性的链霉菌是目前微生物农药开发的一个重要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一株用于高效防治黄瓜霜霉病的新的放线菌——微白黄链霉菌ACT033。该菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明的另一个目的是提供一种采用该新的微白黄链霉菌菌株ACT033制备的能够高效防治黄瓜霜霉病的生物防治制剂。

本发明所提供的菌株为微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）ACT033，是从沿海滩涂土壤中分离获得的，已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.8125。其分子生物学特性如SEQ No.1所示。

本发明微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）菌株ACT033的培养方法或繁殖方法包括：

（1）普通培养保存采用高氏一号培养基，配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2-7.4；

（2）实验室液体培养采用小米培养基，配方为：小米10g，加入到1000mL蒸馏水中煮沸30min后过滤，加入葡萄糖10g，氯化钠2g，蛋白胨3g，碳酸钙2g，蒸馏水补足至1000ml，pH调至7.2～7.4；

（3）固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为70：30的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。

（4）大量发酵培养配方：同（3）中固体培养基配方

本发明还提供一种用于防治黄瓜霜霉病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的微白黄链霉菌菌株ACT033。

并且，本发明还提供了一种用于防治黄瓜霜霉病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向黄瓜霜霉病的植物施用上述微白黄链霉菌菌株ACT033或者上述生物防治制剂。

本发明还提供了上述微白黄链霉菌菌株ACT033或者上述生物防治制剂在防治黄瓜霜霉病中的用途。

本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）制备所述微白黄链霉菌菌株ACT033的种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；

（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。

所述制备方法具体包括以下步骤：

（1）将所述微白黄链霉菌菌株ACT033的孢子移植到PDB液体培养基或者小米液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；

（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8～9d。

其中，步骤（1）中的所述PDB液体培养基包含去皮马铃薯0.2g/mL，葡萄糖0.02g/mL，剩余为蒸馏水；

步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为70：30的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水；

步骤（3）中的大量发酵培养基同步骤（2）的固体培养基。

实验表明，本发明的微白黄链霉菌菌株ACT033具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该微白黄链霉菌菌株ACT033制备的生物防治制剂，不仅能够防治黄瓜霜霉病，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、微白黄链霉菌（S.albidoflavus）ACT033的分离与纯化

本发明的微白黄链霉菌（S.albidoflavus）ACT033是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

（1）链霉菌的分离：土样的采集，在沿海滩涂不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，取100μL10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取高氏一号培养基上的不同形态的微生物菌落于高氏一号培养基上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化链霉菌菌株，分别编号保存。

（2）黄瓜炭疽病高效拮抗链霉菌的筛选

①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在黄瓜炭疽病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察链霉菌对病原菌的抑制作用。

②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的链霉菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的链霉菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。

本发明人通过大量筛选工作得到一株微白黄链霉菌（S.albidoflavus）ACT033。实验证明，该微白黄链霉菌在防治黄瓜霜霉病、炭疽病中显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。

2、菌株鉴定

（1）微生物学特性：在高氏合成1号培养基上培养时，气丝初肉色，后变灰色。基丝棕色，可溶色素褐色。在PDA培养基上培养时，气丝灰色，粉状。基丝初黄色，后为棕色。可溶色素棕色。孢子丝螺旋形，2—5圈，有时6—9圈。孢子球形、卵圆形，表面带短刺(一人报道带疣至光滑)。

（2）分子生物学特性

该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下（SEQ No.1）：

GGGGGCGGCAGCTACCATGCAGTCGACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTGG

CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAA

ACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTGCCGCATGGTGGATGGTGTAAAGCTCCGG

CGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAG

GCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG

GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTG

ATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAG

GGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAG

CAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCT

CGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAG

TCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG

AAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATAC

TGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA

CGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGC

TAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAA

TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAG

AACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTG

GTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA

GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGG

GGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGT

CATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCT

GCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTC

TGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGG

TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACA

CCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGAGCTTCGAAGTGATATGACT

实施例2

1、微白黄链霉菌ACT033发酵过程

小米液体培养基：配方为小米10g，加入到1000mL蒸馏水中煮沸30min后过滤，加入葡萄糖10g，氯化钠2g，蛋白胨3g，碳酸钙2g，蒸馏水补足至1000ml，pH调至7.2～7.4。

大量固体发酵培养基配方（质量百分含量）：

固料：玉米粉70%，麸皮30%

无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5%，硫酸镁0.04%，硫酸铵4%，剩余为水。

固液比为1:1.8（质量比）

微白黄链霉菌（S.albidoflavus）ACT033大量固体发酵过程：

①菌种种子液培养：将微白黄链霉菌（S.albidoflavus）ACT033从试管斜面中挑取少量细菌，移至小米液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。

②固体生产菌种的培养：将种子液按10%的比例接种到固体培养基（500mL三角瓶）中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。

③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室（30℃和相对湿度85%以上）中发酵培养8～9d，即可得微白黄链霉菌ACT033原粉。活性菌≥0.5亿/克。

实例3防治黄瓜霜霉病毒力测定报告

本发明是山东省林业科学研究院研制的一种新型杀菌剂，它能利用微白黄链霉菌ACT033孢子液达到黄瓜霜霉病的目的，同时在自然界中能完全降解，对生态环境没有不良副作用。对研制的0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033发酵液（水剂，上述步骤（1）的种子液）防治黄瓜霜霉病进行了毒力测定，并计算出EC₅₀，现在报告如下：

1材料与方法

1.1材料

a.供试菌种：黄瓜霜霉病由山东省农科院植物保护研究所提供。

b.黄瓜品种：为鲁黄瓜10号，山东省农科院蔬菜研究所提供。

c.供试药剂：0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033发酵液。

1.2试验方法与地点

a.培养土准备：取大田熟土，在160℃干燥箱中灭菌2h后取出，将大块土壤压碎，经过20目筛子过筛后装在花盆（直径25cm，高30cm）中备用。

b.将山东密刺黄瓜种催芽后播在盛有灭菌土的花盆中，在温室中培养，每盆播7粒种子，出苗后定5株苗，待黄瓜长至一片真叶时进行诱导处理。

c.处理方法：将0.2亿/克微白黄链霉菌水剂添加蒸馏水配成500、600、700、800、900、1000倍6个浓度药液，并用不加药剂的蒸馏水为对照，共设6个处理。根据中国农业科学院蔬菜花卉研究所李宝聚方法，采用喷雾法进行0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂抗病性试验，间隔期为4天，次数为2次。在第2次后1天接种新鲜的黄瓜霜霉病菌，接种浓度为10³个孢子囊/毫升，每个处理5株苗，5次重复，接种后保湿培养，在接种后7天调查发病情况，根据病情指数计算防治效果。并在诱导后连续观察植株的要害情况。

d.地点：济南市仲宫镇春季黄瓜大棚内。

1.3调查与计算方法：

a.病叶分级标准：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的6%～10%；

5级：病斑面积占整个叶面积的11～25%；

7级：病斑面积占整个叶面积的26～50%；

9级：病斑面积占整个叶面积的50%以上。

b.计算方法：

式中：CK₀---空白对照施药前病情指数；

CK₁---空白对照区施药后病情指数；

pt₀---药剂处理区施药前病情指数；

pt₁---药剂处理区施药后病情指数。

根据上述结果，采用最小二乘计算出EC₅₀值。

2结果与分析

由于目前黄瓜霜霉病菌尚未有离体进行毒力测定的成熟方法，而是采用黄瓜苗期活体接种进行测定，尤其像生物产品进行病害防治的农药更应该采用该法。参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所李宝聚等防治黄瓜霜霉病毒力测定试验，并加以改进，获得比较满意效果。

由试验结果可以看出，0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂500-1000倍喷施黄瓜苗后，能够对黄瓜产生抗病性，并预防霜霉病菌的侵染，且随着浓度的增高，抗病效果越好，在试验浓度梯度范围内呈其浓度对数与防治效果几率值呈线性回归关系。结果见表1。

表10.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂对黄瓜抗霜霉病的防治效果

用最小二乘法对浓度对数（X）与防治效果几率值（Y）进行回归分析，得出回归式Y=11.9121-2.3745X（R=-0.9893），据此得出EC₅₀为814.70倍，由于使用的农药为制剂0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂，则应用上述方法0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂使用后对黄瓜抗霜霉病的EC₅₀为1.4729×10^-3g/100mL，即0.01473μg/mL。

3小结

本试验为避免因药害产生误差，从500倍开始试验，结果本试验EC₅₀为0.01473μg/mL，考虑样本数不同，所以浓度对数与防治效果几率值对数呈显著直线关系。因此，确定0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂对黄瓜霜霉病EC₅₀为0.01473μg/mL，即按照上述方法用0.2亿/克微白黄链霉菌ACT033水剂对黄瓜进行防治，则对霜霉病抑制中浓度为0.01473μg/mL。

Claims

1.微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）菌株ACT033，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.8125。

2.权利要求1所述的微白黄链霉菌菌株ACT033在防治黄瓜霜霉病中的用途。

3.一种用于防治黄瓜霜霉病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括权利要求1所述的微白黄链霉菌菌株ACT033。

4.一种用于防治黄瓜霜霉病的生物防治方法，其特征是，向黄瓜霜霉病的植物施用权利要求1所述的微白黄链霉菌菌株ACT033或者权利要求3所述的生物防治制剂。