CN103467497A - 以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物及其合成方法和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物及其合成方法和其用途，本发明铜配合物的化学式为C₂₄H₂₆Cu₂N₆O₈S₂。本发明以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体与金属铜盐合成了该双配体铜（Ⅱ）金属配合物，并通过实验所得该配合物对肿瘤细胞体外活性则普遍较好，特别是人胃癌细胞MGC-803，人肝癌细胞BEL-7404，效果显著；并且对正常细胞HL-7702细胞毒性较顺铂低，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

Description

以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物及其合成方法和其用途

技术领域

本发明涉及金属配位化学，特别是以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的铜金属配合物，以及这种金属配合物的合成方法及其用途。

背景技术

铂抗肿瘤制剂如顺铂，卡铂，奥沙利铂都取得了极大的成功，但是它具有固有的局限性，如阻力，严重的毒性和其它副作用。这些缺点使无机化学家试图寻找更有效的，毒性较低的，特定靶向的，非共价键的抗癌药物。最近，因钌和铜的配合物的重要生理活性和氧化性质引起了广大研究人员兴趣，有望成为替代顺铂成为新一代的抗癌药物。对于以铜为金属配位中心，并与协调配体配位的铜希夫碱而言，铜希夫碱表现出抗菌活性和抗恶性细胞增生活性。众所周知，一些抗肿瘤药物通过绑定、修改和裂开DNA发挥他们的作用，基本上以三种作用模式：1、静电作用2、沟面键合作用3、插入作用。在过去的几十年里，铜配合物与DNA结合方式已经被广泛研究。铜配合物的作用机制也被广泛研究，铜配合物的细胞毒性可能是其与DNA键合或者切断DNA导致细胞周期阻滞和细胞凋亡或者生成活性氧作用使细胞死亡。

牛磺酸作为膳食补充剂和功能性食品和饮料中的配料，引起化学家的重视。然而,一些牛磺酸希夫碱配合物已经被报道,有抗病毒、抗癌和抗菌活性。据报道，基于牛磺酸的希夫碱表现出各种各样的配位方式。而芳环堆积的相互作用可以稳定希夫碱金属配合物的稳定性，这种芳环堆积也能够使药物与DNA稳定作用。单一配体的铜金属配合物抗癌活性一般不如双配体或多配体协同作用的铜金属配合物抗癌活性；因此，我们选择了水杨醛缩牛磺酸和咪唑两种配体合成了以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物，而以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物的合成及其药理活性尚未有公开的报道。

目前，对于已知化合物的结构修饰和改造，合成高效，低毒的抗肿瘤有效试剂是当今研究和开发新药的热点，特别是生物无机化学，配位化学之间的学科交叉应用，许多具有抗肿瘤活性的金属配合物如顺铂，二烃基锡衍生物已经被合成并且一些已经用于临床。在这种情况下，有望把具有显著抗癌活性的以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体双配体的铜（Ⅱ）金属配合物用于临床试验，这是极有意义的工作。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，而提供一种以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物，以及这种金属配合物的合成方法和其用途。

一种以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的铜金属配合物，所述金属离子为铜（Ⅱ）离子，作为第一配体的水杨醛缩牛磺酸的化学式为C₉H₉NO₄SK₂，结构式为：

水杨醛缩牛磺酸在结构上，因含有较强配位能力的N,O与合适的空间构型，可以作为金属离子良好的螯合配体。

作为第二配体的咪唑的化学式为C₃H₄N₂,结构式为：

咪唑在结构上具有大π键共轭体系，较强配位的氮原子和很小的空间位阻，可作为金属离子良好的单齿或桥连配体。

本发明以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的铜（Ⅱ）配合物的化学式为C₂₄H₂₆Cu₂N₆O₈S_2，结构式为：

合成时，铜形成五配位双核结构：每个铜原子分别有水杨醛提供一个氧原子配位，牛磺酸提供两个桥连氧原子和一个氮原子配位，咪唑提供一个氮配位；两个铜原子通过牛磺酸提供的桥连氧原子形成双核结构。

本发明以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物的合成方法为溶液法，具体定量合成步骤如下：

  1）将20mmol(2442.4mg)牛磺酸和20mmol（1122.0mg）氢氧化钾溶解于20ml的乙醇中，搅拌15min，制得溶液,可溶的牛磺酸的钾盐更容易与水杨醛发生反应；

 2)将上述溶液逐滴滴入20ml加有20mmol水杨醛的乙醇溶液中，于45-50℃回流搅拌反应2-3h得黄色沉淀物，由于搅拌作用可使分子或离子之间能有更好的碰撞，接触，使反应进行得更充分，更完全；加热回流也使反应更快更完全；一般温度选择要考虑溶剂的熔沸点，反应物分解温度等，该反应温度为50℃，加热时间可视反应速度快慢而定，一般2至48小时，该反应较快，2-3小时即可；

 3)将上述所得黄色沉淀过滤后用乙醇和乙醚各洗2-3次，用以除去未反应的反应物和其它副产物；干燥后，得配体为纯净的黄色水杨醛缩牛磺酸结晶；

4)取Cu(OAc)₂·H₂O (1mmol, 199.65mg)溶于10ml乙醇，滴加到含有1mmol水杨醛缩牛磺酸配体的15ml水溶液中，于55-65℃回流搅拌4-5h，再加入固体配体咪唑（1mmol，68.07mg）,于55-65℃回流搅拌7-8h；该步骤中，水杨醛缩牛磺酸配体先与铜配位后，咪唑要再与铜配位相对较难，用加热回流和延长反应时间的方法使其配位；

   5)将反应后溶液过滤，滤液加入水：乙醇体积比为3:2的混合溶剂25ml，这是由于水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物浓度过大时常常为多晶状，不适合长出单晶，需要将反应产物稀释；

   6)混匀后，取10ml于25ml小烧杯中，保鲜膜封口，针扎15-20个孔于5-6℃挥发数日，得到以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物深绿色单晶；在常温挥发太快，也易形成多晶，为得到单晶，除需要以上步骤外，还需要将产物稀释液至于4℃挥发数日。所得金属配合物的结构可由元素分析，红外光谱，核磁共振，X单晶衍射等分析。最终确定了该配合物为不曾报道过的新化合物，并通过X单晶衍射得到了该化合物的结构。

本发明的另一目的，还提供以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物在制备抗肿瘤药物中的运用。

本发明的优点：本发明以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体与金属铜盐合成了该双配体铜（Ⅱ）金属配合物，该合成方法简单，易操作，成本低，所得配合物产率较高。并通过实验所得该配合物对肿瘤细胞体外活性则普遍较好，特别是人胃癌细胞MGC-803，人肝癌细胞BEL-7404，效果显著；并且对正常细胞HL-7702细胞毒性较顺铂低，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为实施例所得铜（Ⅱ）金属配合物的分子结构图；

图2为实施例所得铜（Ⅱ）金属配合物按a轴方向的晶胞堆积图；

图3为实施例所得铜（Ⅱ）金属配合物诱导人胃癌细胞MGC-803凋亡图；

图4为实施例所得铜（Ⅱ）金属配合物影响人胃癌细胞MGC-803周期图。

具体实施方式：

实施例：

合成以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物。

将20mmol(2442.4mg)的牛磺酸和20mmol（1122.0mg）的氢氧化钾溶解于20ml的乙醇中，搅拌15min，制得溶液；将上述溶液逐滴滴入20ml加有20mmol水杨醛的乙醇溶液中，于50℃回流搅拌反应2h得黄色沉淀物，所得黄色沉淀过滤后，用乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配体水杨醛缩牛磺酸；取Cu(OAc)₂·H₂O (1mmol, 199.65mg)溶于10ml乙醇，滴加到含有1mmol水杨醛缩牛磺酸配体的15ml水溶液中，于60℃回流搅拌4h，再加入固体配体咪唑（1mmol，68.07mg）于60℃回流搅拌8h；将反应后溶液过滤，滤液加入水：乙醇体积比为3:2的混合溶剂25ml；混匀后，取10ml于25ml小烧杯中，保鲜膜封口，针扎20个孔于4℃挥发数日，得到以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物深绿色晶体。

实验例：水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物的抗肿瘤活性实验。

1）细胞株与细胞培养

肿瘤细胞株MGC-803,BEL-7404,A549,SK-OV-3和正常细胞株HL-7702,均来自于the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)，细胞在37℃体积浓度为5%孵箱中，用加有10%胎牛血清和100μgmL^-1链霉素，100单位每毫升青霉素的DMEM培养基培养。

2）细胞生长抑制实验（MTT法）

注：MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-mtt.html' target='_blank'>二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt.html' target='_blank'>噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

将水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物以DMSO助溶后，使用完全培养基依次稀释成五个梯度，20倍于终浓度的工作液，各梯度之间除药物浓度不同外，助溶剂DMSO等含量均一致。再用直径为0.22um的微孔滤膜过滤除菌置于4℃保存。将对数期的肿瘤细胞株MGC-803, BEL-7404, A549, SK-OV-3和正常细胞 HL-7702，以每孔0.18ml分别接种于96孔板，细胞浓度约为0.4-0.5×10⁴/孔，培养12h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的受试化合物，每孔20ul，使终浓度分别为0μM，20μM，40μM，80μM 每个梯度设4个复孔，其中DMSO终浓度小于0.5%，同时设置相应的阴性对照组（培养液中只有细胞和等量DMSO，无药物），每组也设置4个复孔，药物作用48h后，倾去培养液，加入100μlDMSO，平板震荡器震荡10min，使结晶物充分溶解，空白对照组调零，用酶标仪以550nm/655nm双波长测定去除底光吸收值后的吸光度（A）值，以Bliss法分别计算化合物对肿瘤细胞株MGC-803,  BEL-7404, A549, SK-OV-3和正常细胞HL-7702的IC₅₀值，所有实验重复3次。实验结果见表1，可以看出该水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物对正常人类肝细胞HL-7702的细胞毒性低于顺铂；并且对肿瘤细胞MGC-803，BEL-7404的细胞毒性明显高于顺铂。

表1 配合物的细胞毒性

注：MGC-803为人胃癌细胞，BEL-7404为人肝癌细胞, A549为人肺癌细胞, SK-OV-3为人卵巢癌细胞，HL-7702为正常人肝细胞。

3）细胞凋亡实验分析

用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中，用加样器在平底6 孔板的各孔中加入 2ml 细胞悬液，每孔加 5×10³-100×10³个细胞，将培养板放至 CO₂培养箱中，于 37℃湿润环境中温育，待细胞贴壁，肿瘤细胞中加入上述制备的同样浓度的以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体双配体的铜（Ⅱ）金属配合物处理后，以吖啶橙和溴化乙锭联合对细胞进行染色，利用荧光倒置显微镜，定性检测以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体双配体的铜（Ⅱ）金属配合物诱导肿瘤细胞的凋亡情况。如图3所示，对照组为绿色，凋亡后为黄绿色，有凋亡小体出现，结果表明，配合物可以诱导人肿瘤细胞MGC-803的凋亡。

4）细胞周期实验分析

细胞流式仪测试用浓度为0,5μM,10μM,20μM水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜金属配合物作用MGC-803 48h后,PI染色的细胞；结果显示，如图4所示，配合物的浓度增加,S期数量从48.08%增加到63.19%,而G1和G2期明显减少，说明该铜配合物可能通过S期影响细胞周期，延迟或抑制细胞周期进程，凋亡细胞的比例从5到20μM，呈现剂量依赖性。

    体外抑制实验表明，所得的配合物对所试的肿瘤细胞体外活性则普遍较好，特别是人胃癌细胞MGC-803，人肝癌细胞BEL-7404，效果显著；并且对人正常细胞HL-7702细胞毒性较顺铂低，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。 

Claims (4)

1.一种以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物，其特征是：化学式为C₂₄H₂₆Cu₂N₆O₈S₂  结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物，其特征在于：所述金属离子为铜（Ⅱ）离子，作为第一配体的水杨醛缩牛磺酸的化学式为C₉H₉NO₄SK₂，结构式为：

作为第二配体的咪唑的化学式为C₃H₄N₂,结构式为：

。

3.权利要求1-2中所述的以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物的合成方法，其特征是包括步骤如下：

   1）将20mmol(2442.4mg)牛磺酸和20mmol（1122.0mg）氢氧化钾溶解于20ml的乙醇中，搅拌15min，制得溶液；

   2)将上述溶液逐滴滴入20ml加有20mmol水杨醛的乙醇溶液中，于45-50℃回流搅拌反应2-3h得黄色沉淀物；

   3)将上述所得黄色沉淀过滤后用乙醇和乙醚各洗2-3次，干燥后，得配体水杨醛缩牛磺酸；

   4)取Cu(OAc)₂·H₂O (1mmol, 199.65mg)溶于10ml乙醇，滴加到含有1mmol水杨醛缩牛磺酸配体的15ml水溶液中，于55-65℃回流搅拌4-5h，再加入固体配体咪唑（1mmol，68.07mg）于55-65℃回流搅拌7-8h；

   5)将反应后溶液过滤，滤液加入水：乙醇体积比为3:2的混合溶剂25ml；

   6)混匀后，取10ml于25ml小烧杯中，保鲜膜封口，针扎15-20个孔于5-6℃挥发数日，得到以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜（Ⅱ）金属配合物深绿色晶体。

4.权利要求1或3中所述的以水杨醛缩牛磺酸和咪唑为配体的双配体铜配合物在制备抗肿瘤药物中的运用。

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