CN103451169B - 一种调控木材发育的相关基因及其应用 - Google Patents
一种调控木材发育的相关基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种调控木材发育的相关基因及其应用。具体地，本发明提供了一种新的PtMAN6多肽或其编码序列，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2所示，所述编码序列如SEQ？ID？NO:1所示。本发明还提供了PtMAN6基因及其编码的蛋白的用途，它们可降低木质部次生细胞壁合成和/或降低结晶纤维生物质的积累；过量表达PtMAN6可以在植物中富集降解甘露聚糖类半纤维素的甘露聚糖水解酶，同时由于PtMAN6的调控作用，转基因植株中木质素含量降低，结晶纤维素降低，大大降低了木质纤维素乙醇生产和造纸工业中的成本；PtMAN6基因的启动子具有特异的导管细胞定位功能，能精确调控基因在木质部导管细胞中的表达。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体地，本发明涉及一种调控木材发育的相关基因及其应用。
背景技术
随着社会经济发展和人口的不断增加，人类对能源的需求越来越多，由于化石能源是有限的，石油等产品的价格不断上涨，对经济的稳定持续发展造成威胁。
可再生的生物质能是理想的替代能源之一，生物乙醇是目前最有前景和最主要的生物质能源。自20世纪70年代中期的石油危机以来，以美国和巴西为主的一些国家开始积极推行生物乙醇发展计划，本世纪以来，全球生物乙醇产量迅速增加。早期多利用粮食作物如玉米等作为原料生产乙醇，导致粮食价格上涨，与国家的粮食安全存在矛盾，不能进行大规模生产。近年来，欧美等国大量投入开展以木质纤维素为原料的生物乙醇生产技术和工业实践，同时积极培育适合本国的能源作物。我国也在积极的开展木质纤维素乙醇发酵的研究。
木质纤维素乙醇生产主要有四步：1预处理，破坏木质纤维素的结构，去除阻碍糖化和发酵的木质素等物质；2酸或酶水解纤维素和半纤维素成单糖；3用发酵菌将六碳糖和五碳糖发酵成乙醇；4蒸馏脱水纯化乙醇，使其达到作为能源的要求。其中第1、2步的生产成本过高，效率很低，严重限制了纤维生物质能源的发展，导致木质素生物乙醇生产成本居高不下。
此外，木质纤维素在造纸工业中也有广泛应用。目前主要有两大类造纸制浆工艺：机械法制浆和化学法制浆。机械法制浆通过机械分离纸纤维，不去除其中的木质素，可以得到高的纸浆产量，但是由于木质素的存在导致其可漂白率低，生产的纸张在光下易发黄。化学法制浆利用化学物质移除细胞壁中的木质素，可得到长而柔韧的纸纤维，从而可生产高品质的纸张。纸浆的漂白是制浆造纸工业另外一道重要工序，主要是通过化学物质进一步去除纸浆中的木质素或改变木质素发色基团，从而提高纸浆的白度和白度稳定性。传统的漂白剂多为含氯漂白剂，废水中含有具有强烈致癌性的有毒物质，对环境污染很大。
因此本领域还没有一种适于生产生物燃料和造纸的木材植物，因此迫切需要研究调控木材发育的相关基因，并开发适用于生产可再生能源和造纸的木材品种。
发明内容
本发明的目的就是提供一种调控木材发育的相关基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种PtMAN6多肽或PtMAN6多肽的编码序列，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示，所述PtMAN6多肽的编码序列如SEQIDNO.:1所示。
在本发明的第二方面，提供了PtMAN6多肽或其编码序列的用途，所述用途任选自下组的一种或多种：
(1)降低木质部次生细胞壁的合成；
(2)降低结晶纤维生物质的积累；
(3)降低木质素（较佳地降低植物茎部木质素）的含量。
在另一优选例中，所述的PtMAN6多肽选自下组：
(I)具有SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的多肽；
(II)将如SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的由(1)衍生的多肽；或
(III)氨基酸序列与SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的同源性≥90%(较佳地≥95%，更佳地98%)由(1)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的PtMAN6多肽的编码序列选自下组：
(i)编码具有SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(ii)序列如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示的多核苷酸；
(iii)核苷酸序列与SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；
(iv)如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；或
(v)与(i)-(iv)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在本发明的第三方面，提供了一种改良植物性状的方法，所述的改良植物性状选自下组：(1)降低植物木质部的次生细胞壁合成；(2)降低植物结晶纤维生物质的积累；(3)降低植物木质素（较佳地降低植物茎部木质素）的含量；
所述方法包括步骤：提高所述植物中PtMAN6多肽或其编码序列的表达或活性。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：将PtMAN6多肽的编码序列导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。
在另一优选例中，所述的植物为杨柳科植物，较佳地为杨树。
在本发明的第四方面，提供了一种启动子元件，所述的启动子元件是植物PtMAN6基因的启动子，并且所述启动子元件具有植物木质部导管细胞特异启动的功能。
在另一优选例中，所述的启动子元件不具有植物木质部形成层细胞特异启动的功能。
在另一优选例中，所述的启动子元件选自下组：
(a)具有如SEQIDNO.:3所示序列的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:3所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且具有植物木质部导管细胞特异启动功能的多核苷酸；
(c)如SEQIDNO.:3所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有植物木质部导管细胞特异启动功能的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的本发明第四方面所述的启动子元件。
在另一优选例中，所述外源基因选自下组：
抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。
在本发明的第六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：本发明第四方面所述的启动子元件、基因ORF序列、和终止子。
在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第四方面所述的启动子元件、或本发明第六方面所述的表达盒。
在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第七方面所述的载体、或其染色体整合有外源的本发明第四方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第六方面所述的表达盒。
在本发明的第九方面，提供了第四方面所述的启动子元件、第五方面所述的构建物、或第六方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在植物木质部导管细胞的表达。
在本发明的第十方面，提供了一种在植物木质部导管细胞特异性表达外源基因的方法，包括步骤：
(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的第四方面所述的启动子元件；
(b)将步骤(a)中的构建物导入植物木质部导管细胞，获得转化的木质部导管细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示35S:PtMAN6过表达载体结构。
图2显示35S:PtMAN6-GFP过表达载体结构。
图3显示35S:PtMAN6AS反义表达载体结构。
图4显示MAN6G瞬时表达载体结构。
图5显示MAN6sG瞬时表达载体结构。
图6显示了各种转基因植株表型。图6A显示WersternBlot检测转基因植株结果；图6B显示过量表达PtMAN6（OE），野生型（WT），反义表达PtMAN6（AS）植株的表型，标尺为20厘米；图6C-图6E显示转基因植株叶柄机械强度，过量表达植株（图6D，OE）相对于野生型（图6C，WT）及反义表达植株（图6E，AS）叶柄变软，箭头示叶柄，标尺为10厘米；图6F-图6H分别显示图6C-图6E中植株茎杆叶柄中木质素的沉积，叶柄经徒手切片，间苯三酚染色，红色显示木质素的沉积，标尺为500微米。
图7显示转基因及野生型杨树茎中木质素沉积及木材组分的变化结果。图7A)-图7C)：野生型（图7A），PtMAN6OE（图7B），及PtMAN6AS（图7C）植株中14节茎的徒手切片间苯三酚染色，红色显示了木质素沉积，箭头标示髓细胞中木质素的积累；图7D-图7F：分别是图7A-图7C中黑框部分的放大图，箭头标示导管细胞中木质素的积累；图7G-图7I：紫外检测野生型（图7G），PtMAN6OE（图7H），及PtMAN6AS（图7I）植株中12节切片，木质化的细胞自发荧光较强，呈蓝色，木质化较弱的细胞，自发荧光较弱呈紫色，箭头标示未成熟的导管细胞；图7J为转基因植株木材中ABSL木质素的比较结果，过表达PtMAN6植株（OE）中木质素显著降低；图7K为转基因植株木材中结晶纤维素的比较，过表达PtMAN6植株（OE）中结晶纤维素显著降低；图7L为转基因植株未成熟导管细胞的面积改变结果，所测导管为图G-I中箭头标示的导管；统计学分析采用T检验，*代表p<0.05，**代表p<0.01，图7A-图7C中标尺为500μm；图7D-图7I中标尺为100μm，图7J-图7L误差线指的是统计的标准误。
图8显示1.5年生转基因杨树木材的高度及周长分析结果，其中，图8A显示过量表达PtMAN6杨树（OE），反义表达PtMAN6的杨树与野生型（WT）杨树的树干高度没有明显差异；图8B显示OE、AS与WT杨树的树干基部的周长没有明显差异，统计学分析采用T检验。
图9显示了PtMAN6的酶活性分析；其中，图9A为PtMAN6的最适pH测定结果，底物为溶于pH范围为3.0-8.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的1%AZCL-glactomannan悬浮液，WT和PtMAN6分别指从野生型及过表达植株成熟叶片中提取的酶蛋白（下同）；图9B显示PtMAN6的最适反应温度测定结果，底物为溶于pH5.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的1%AZCL-glactomannan悬浮液；图9C显示PtMAN6去糖基化处理结果，Werstern杂交分析植物中提取的PtMAN6（第一泳道），及EndoHf处理0.5小时（第二泳道）及1小时（第三泳道）的PtMAN6，M：预染的蛋白质标记物；图9D为糖基化影响酶活性结果，与对照（control）相比，PtMAN6经EndoHf去糖基化2小时，酶活性约降低为原来的50%。
图10显示杨树中PtMAN6基因的定量PCR分析结果。分别从1年生杨树的木质部，韧皮部，幼叶，老叶以及茎顶端组织提取RNA进行定量RT-PCR分析，以杨树中Actin基因作为内参。
图11显示PtMAN6的免疫定位分析结果；其中，图11A和图11B为1年生野生型杨树第六节间的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11B是图11A中黑框部位的放大图；图11C为1年生野生型杨树第六节间的纵切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11D和图11E为1年生野生型杨树茎顶端组织的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11E是图11D中黑框部位的放大图；图11F为阴性对照，1年生野生型杨树第六节间的横切图，未能检测到任何定位信号。
图12显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜。图12A和图12B显示拟南芥根中稳定表达PtMAN6-GFP蛋白，该蛋白定位于质膜；图12C和图12D，30%蔗糖质壁分离拟南芥根细胞，显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜；图12E为用于瞬时表达的载体；图12F为亚细胞组分的Werstern检测，M为标示蛋白分子，1为胞质组分，2为膜组分；图12G和图12H用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中MAN6G载体；图12I和图12J显示用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中MAN6sG载体；图12K和图12L用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中CK的载体；A，C，G，I，K为GFP荧光图片；B，D，H，J，L为明场图片，标尺为50μm。
图13显示过量表达PtMAN6的植株中次生壁形成相关转录因子的相对表达水平。RNA提取自1年生杨树木质部，野生型的表达被定义为1，杨树Actin基因作为内参。
图14显示了过量表达PtMAN6的植株中与次生壁组分合成基因的表达改变。图14A显示过量表达PtMAN6的植株中，木质素单体合成途径的基因以及木质素聚合相关基因受到抑制；图14B显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的纤维素合成基因CesA8的表达受到抑制；图14C显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的木聚糖合成基因GT43B的表达受到抑制。RNA提取自1年生杨树木质部，野生型的表达被定义为1，杨树Actin基因作为内参。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种新的PtMAN6多肽或其编码序列，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示，所述编码序列如SEQIDNO.:1所示。此外，本发明还提供了植物中的PtMAN6基因及其编码的蛋白的用途，它们可以用于调控木质部的次生细胞壁合成和调控纤维生物质的积累；过量表达PtMAN6可以在植物中富集降解甘露聚糖类半纤维素的甘露聚糖水解酶，同时由于PtMAN6的调控作用，该转基因植株中木质素含量降低，结晶纤维素含量降低，从而降低了木质纤维素乙醇生产和造纸的成本；此外，PtMAN6蛋白具有特异的导管细胞定位功能，其基因启动子能精确调控基因在木质部导管细胞中的表达。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明多肽”、“本发明蛋白”、“PtMAN6多肽”、“PtMAN6蛋白”、或“半纤维素甘露糖水解酶”可以互换使用。在一个优选例中，是指具有SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的多肽，或其活性片段，或衍生物。
本发明的PtMAN6多肽优选来源于植物，较佳地来源于杨柳科，杨属、柳属、或钻天柳属等。
如本文所用，术语“本发明基因”、“PtMAN6基因”可以互换使用，都是指来源于一种编码半纤维素甘露糖水解酶的核苷酸序列及其衍生序列。在本发明的一个优选例中，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示。
本发明的PtMAN6基因优选来源于植物，较佳地来源于杨柳科，杨属、柳属、或钻天柳属等。
如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的PtMAN6多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有调控木质部次生细胞壁合成和纤维生物质积累活性和功能的PtMAN6蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然PtMAN6蛋白相同的生物学功能或活性的多肤。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明还包括与本发明的PtMAN6多肽或蛋白具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
表1
本发明包括PtMAN6蛋白质类似物与天然PtMAN6蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
本发明还提供了编码PtMAN6多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酞胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。
应理解，虽然本发明的PtMAN6基因优选来自杨树，但是来自其它植物的与杨树PtMAN6基因高度同源(如具有80%以上，如85%,90`%,95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的PtMAN6核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还提供包括本发明的基因的重组载体及其应用。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
本发明的所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括（但并不限于）：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明提供了PtMAN6多肽或其编码序列的用途，所述用途任选自下组：
降低木质部次生细胞壁的合成、降低结晶纤维生物质的积累、降低木质素（较佳地降低植物茎部木质素）的含量。
所述的PtMAN6多肽选自下组：(I)具有SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的多肽；(II)将如SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的由(1)衍生的多肽；或(III)氨基酸序列与SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的同源性≥90%(较佳地≥95%，更佳地98%)由(1)衍生的多肽。
所述的PtMAN6多肽的编码序列选自下组：(i)编码具有SEQIDNO.:2或SEQIDNO.:17所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(ii)序列如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示的多核苷酸；(iii)核苷酸序列与SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)的多核苷酸；(iv)如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:16所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；或(v)与(i)-(iv)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：将PtMAN6多肽的编码序列导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。
本发明还提供了一种改良植物性状的方法，所述的改良植物性状选自下组：
(1)降低植物木质部的次生细胞壁合成；(2)降低植物结晶纤维生物质的积累；(3)降低植物木质素的含量；所述方法包括步骤：提高所述植物中PtMAN6多肽或其编码序列的表达或活性。
本发明还提供了一种种改良的植物，与野生型植物相比，所述植物中木质素和/或结晶纤维素的含量下降10%以上，较佳地下降20%以上，更佳地下降50%，最佳地下降100%以上。
所述的植物为杨柳科植物，较佳地为杨树。
如本文所用，术语“本发明启动子”、“木质部导管特异表达的启动子”、“木质部导管特异定位的启动子”可互换使用，指来源于植物，较佳地来源于杨柳科，杨属、柳属、或钻天柳属等的PtMAN6的启动子元件，本发明的一种典型的启动子元件序列如SEQIDNO.:3所示。
如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
本发明提供了一种木质部导管特异表达特异性表达的启动子，所述启动子来源于植物，较佳地来源于杨柳科的PtMAN6基因。一种优选的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.:3所示。
本发明的启动子能够高效、专一地在木质部导管细胞中表达，而在形成层细胞中没有任何表达，本发明的启动子可以用于特异性改善植物木质部导管细胞特性。
在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
本发明还包括与本发明的优选启动子序列(SEQIDNO.:3)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动木质部导管细胞表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于杨柳科的PtMAN6基因启动子，但是来源于其它类似的植物(尤其是与杨树同属于一科或属的植物)的、与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。
如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。所述的“植物木质部导管细胞特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在植物木质部导管细胞中表达。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，可以为RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。
所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。
所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB-pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。
本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下列元件：启动子、基因ORF序列、和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQIDNO.:3所示或与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95%，较佳地≥98%，更佳地≥99%。
本发明还提供了一种包括本发明的启动子和/或基因表达盒的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、果树等。
本发明的主要优点在于：
（1）本发明人首次发现植物中的PtMAN6基因及其编码的蛋白可降低木质部的次生细胞壁合成和降低结晶纤维生物质的积累。
（2）PtMAN6基因的启动子具有特异的导管细胞定位功能，能精确调控基因在木质部导管细胞中的表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料和方法
1.植物材料与生长环境
杨树基因克隆自毛果杨（Populustrichocarpa），表达载体都转入市售的南林895品种中，杨树幼苗培养在人工气候室玻璃温室，27℃自然光照，两年生树苗移植农场自然气候种植。
用于转化的拟南芥为哥伦比亚型，种植于人工气候室22℃，12小时光周期培养。
2.基因克隆
PtMAN6的基因组序列从JGI数据库下载（USDepartmentofEnergy,JointGenomeInstitute(JGI),http://www.phytozome.net/poplar）。
用CTAB法从毛果杨发育的木质部提取RNA，并用RNase-free的DNaseI去除DNA污染。
用引物5’TGAATGGCTAATGGTGGCAAAGA3’（SEQIDNO.:4）及5’TCAGGAGCCGATGGTCCATAAAA3’（SEQIDNO.:5）通过RT-PCR的方法克隆PtMAN6的部分cDNA序列，然后用5’RACE的方法克隆该基因的5’端（kit，Invitrogen）。用引物5’CTGACTCAATACTATGGATACCC3’（SEQIDNO.:6）及5’CTTCCTTTTCCTGTTGTGACCGA3’（SEQIDNO.:7）克隆PtMAN6的全长编码序列。
3.基因表达分析
基因表达分析采用定量RT-PCR的方法，设计基因特异的引物去扩增特定的基因片段（100-300bp）。1μg总RNA用PrimerScriptTM反转录试剂盒（大连宝生物）反转录成第一链cDNA.定量PCR采用SYBRgreen法在MyiQTMReal-TimePCR仪（伯乐，美国）上检测。以杨树中PtActin基因作为内参基因。
4.抗体制备
通过PtMAN家族基因的序列比对，在PtMAN6的非保守区选择了两个小肽段，EQFKTMVEEVDNH(37位至49位氨基酸，SEQIDNO.14)及ELNDVEEDEWL（61位至71位氨基酸，SEQIDNO.15），通过人工合成，注射入兔中产生多克隆抗体（委托艾比玛特公司完成）。抗体经Western检测在木质部总蛋白中只能检出单一条带。单克隆抗体Anti-GFP及anti-Actin购买自艾比玛特（中国上海）公司。
5.载体构建与植物转化
5.135S:PtMAN6及35S:PtMAN6AS载体构建：
全长PtMAN6的CDS序列用如下引物5’CTTTCTAGACTGACTCAATACTATGGATACCC3’（XbaI）（SEQIDNO:10）及5’CTGCTCGAGCCGATCAACTACTTTTACAAATC3’（XhoI）（SEQIDNO.:11）或：
5’CTTCTCGAGCTGACTCAATACTATGGATACCC3’（XhoI）（SEQIDNO.:12）及5’CTGTCTAGACCGATCAACTACTTTTACAAATC3’（XbaI）（SEQIDNO.:13）扩增，用相应的酶切割扩增片段，将其亚克隆至市售的pBI121载体骨架中。
5.2瞬时表达载体构建：
全长PtMAN6的CDS序列或者其前31个氨基酸序列被亚克隆至pA7载体与载体上EGFP融合。这两个载体分别命名为MAN6G或MAN6sG。
5.335S:PtMAN6-GFP载体构建：
将MAN6G上CaMV35S启动子，PtMAN6-GFP及NOS终止子一起亚克隆至pCAMBIA2300载体。
5.4植物转化
稳定表达，先将载体转化入GV3101农杆菌菌株，制备工程菌。
拟南芥转化采用通用的农杆菌介导的浸花法。
杨树转化采用通用的叶盘法。
6.杨树中内切-1,4-β-甘露聚糖酶的提取及酶活测定
将新鲜的杨树组织用液氮快速的研磨成细粉，然后加入1.5倍体积预冷的酶蛋白提取缓冲液在冰上放置1小时，10000g4℃离心30min，然后上清通过Miracloth过滤，然后通过10KD的超滤管浓缩纯化。纯化的蛋白用BCA试剂定量。
利用比色法进行酶活性测定。不溶的底物AZCL-galactomannan购买自Megazyme（爱尔兰），1%（w/v）的底物溶于0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液（pH3.0-8.0）或0.1M醋酸钠缓冲液（pH5.0）制成悬浮液。取100μl上述底物悬浮液加入20μg纯化的酶蛋白（或BSA对照），用相应的buffer补齐至体积为200μl，然后置于特定的反应温度反应2h，期间一直保持摇动使反应体系均匀，100℃5min终止反应，12000g离心5min，并于590nm测吸光度的改变，酶活性以A590nmmg-1min-1表示，结果至少要三次独立重复。
7.PtMAN6去糖基化
用于Western分析，纯化的PtMAN6先经过100℃变性10min，然后根据说明书加入EndoHf酶（NewEnglandBiolabs）37℃处理30min或1h，样品在100℃失活10min中，取20μl进行SDS-PAGE检测。
用于酶活检测，从过量表达PtMAN6植株或者野生型植株提取的60μg酶蛋白直接加入6000单位的EndoHf酶37℃处理2h，取20μg处理的蛋白进行酶活性分析，每个样品重复三次。
8.植物切片分析
木质素沉积检测：1年生杨树茎或叶柄徒手切片，然后用1%的间苯三酚（溶于12%盐酸）处理5min，然后立刻显微镜观察。
木质素自发荧光以及导管面积测量：FAA（5%甲醛，5%乙酸，70%乙醇）固定茎段，石蜡包埋，10μm切片脱水后直接紫外观察。用ImageJ软件统计导管面积，Student’st检验统计结果。
9.本发明中研究的杨树基因在NCBI中的登陆号为：
PtMAN6XM_002323644，PtrPAL(XM_002326150)，
PtrC4H1(EU603304)，Ptr4CL3(XM_002297663)，
PtrHCT1(EU603313)，PtrC3H1(XM_002308824)，
PtrCCoAOMT1(XM_002313089，EU603307)，
PtrCCR2/7(EU603310，XM_002303809)，
PtrCAld5H1(EU603312)，PtrCOMT2(XM_002317802,EU603317)，
PtrCAD1(EU603306)，PtrLAC17(XM_002317469)，
PtrCesA8(XM_002316779)，PtrGT43B(JF518935)，
PtrWND1A(HQ215847，XM_002317023)，
PtrWND1B(HQ215848)，PtrWND2A(HQ215849)，
PtrWND3A(XM_002322362)，PtrWND3B(XM_002318252)，
PtrWND4A(XM_002329829)，PtrWND5A(XM_002310261)，
PtrWND6A(XM_002327206)，PtrMYB3(XM_002299908)，
PtrMYB20(XM_002313267)，PtrMYB28(XM_002307154)，
Pt-IAA8(XM_002302315)，PtrXCP1(XM_002328102)，
PtrACT1(XM_002298674)。
实施例1PtMAN6的基因表达序列及启动子的克隆
1.序列信息
PtMAN6完整的CDS序列如下：
atggatacccacaagagggtatttgggttcaagatcattttcttagtgtccgtttttatt60
cttcttaatgaaagttcaaaatgcagcagctctggtgttatggatgatgaacaatttaaa120
acaatggtggaggaagtagacaatcatctaccatcttctagctcaagtcaaggggtttat180
gagttgaatgatgtggaagaagatgaatggctaatggtggcaaagaaaggaaaccagttt240
gtgatcaatgaccaacctttctatgtcaatggatttaacacatactggctgatggtgttt300
gctgctgatcaatctaccagaggaaaggtcactgaggttttccaaaaagcatcctcagtt360
ggtctatcagtttgcaggacttgggcttttaatgatggtcaatggagagctcttcaaaaa420
tctccaggtgtttatgatgaagatgttttcaaggccctggattttgtggtcagtgaagca480
aataagtacaagatcaggctcatattatcattggctaacaattgggatgcatatggtgga540
aaagcacaatatgttaaatggggaaaagcttctggccttaatttgacatctgatgatgat600
ttcttctctcatccaactctcagaagctactacaaggctcatgtcaaggcggtattgaat660
agagtcaatacgatcacaaacataacctacaaggatgaccctacaatatttgcttgggag720
ctgatgaatgaacctcgatgcacctcagatccctctggcgataaactgcagtcatggata780
acagacatggcagtatatgtgaagagcatggacgcaaagcacttagtagagattggattg840
gagggattttatggaccatcggctcctgatagggctcagttcaatccaaactcgtatgct900
acgcaagttggaaccgactttatcaggaaccatcaggttcttggtgttgattttgcttct960
gttcacatatatgcagactcctggatttcgcaaacaattacggattctcatatccaattc1020
accaagtcatggatggaagctcacatagaggatgctgagaaatatctgggaatgccggtt1080
gtgttcgctgagtttggtgtatcttcaaaagatcctggatacaactcatcattccgcgac1140
acactaattaacacagtgtacaagaccctcttgaactcaaccaagagaggtgggagtgga1200
gctgggagccttctgtggcagcttttccctgacgggacagactacatggatgatggatat1260
gcaattgttctatcaaaatctccttccacaacaaacatcatttccctccattcaacacga1320
gtcgcaatcgtcaattccatgtgttcatggaaatgcaaatggggctgcaagaagaggaat1380
cctttagaggcattcctctaccatgatgatttgtaa1416
（SEQIDNO.:1）
或
atggatacccacaagagggtatttgggttcaagatcattttcttagtgtccgtttttatt60
cttcttaatgaaagttcaaaatgcagcagctctggtgttatggatgatgaacaatttaaa120
acaatggtggaggaagtagacaatcatctaccatcttctagctcaagtcaaggggtttat180
gagttgaatgatgtggaagaagatgaatggctaatggtggcaaagaaaggaaaccagttt240
gtgatcaatgaccaacctttctatgtcaatggatttaacacatactggctgatggtgttt300
gctgctgatcaatctaccagaggaaaggtcactgaggttttccaaaaagcatcctcagtt360
ggtctatcagtttgcaggacttgggcttttaatgatggtcaatggagagctcttcaaaaa420
tctccaggtgtttatgatgaagatgttttcaaggccctggattttgtggtcagtgaagca480
aataagtacaagatcaggctcatattatcattggctaacaattgggatgcatatggtgga540
aaagcacaatatgttaaatggggaaaagcttctggccttaatttgacatctgatgatgat600
ttcttctctcatccaactctcagaagctactacaaggctcatgcggtattgaatagagtc660
aatacgatcacaaacataacctacaaggatgaccctacaatatttgcttgggagctgatg720
aatgaacctcgatgcacctcagatccctctggcgataaactgcagtcatggataacagac780
atggcagtatatgtgaagagcatggacgcaaagcacttagtagagattggattggaggga840
ttttatggaccatcggctcctgatagggctcagttcaatccaaactcgtatgctacgcaa900
gttggaaccgactttatcaggaaccatcaggttcttggtgttgattttgcttctgttcac960
atatatgcagactcctggatttcgcaaacaattacggattctcatatccaattcaccaag1020
tcatggatggaagctcacatagaggatgctgagaaatatctgggaatgccggttgtgttc1080
gctgagtttggtgtatcttcaaaagatcctggatacaactcatcattccgcgacacacta1140
attaacacagtgtacaagaccctcttgaactcaaccaagagaggtgggagtggagctggg1200
agccttctgtggcagcttttccctgacgggacagactacatggatgatggatatgcaatt1260
gttctatcaaaatctccttccacaacaaacatcatttccctccattcaacacgagtcgca1320
atcgtcaattccatgtgttcatggaaatgcaaatggggctgcaagaagaggaatccttta1380
gaggcattcctctaccatgatgatttgtaa1410
（SEQIDNO.:16）
PtMAN6蛋白的氨基酸序列如下：
MDTHKRVFGFKIIFLVSVFILLNESSKCSSSGVMDDEQFKTMVEEVDNHLPSSSSSQGVY60
ELNDVEEDEWLMVAKKGNQFVINDQPFYVNGFNTYWLMVFAADQSTRGKVTEVFQKASSV120
GLSVCRTWAFNDGQWRALQKSPGVYDEDVFKALDFVVSEANKYKIRLILSLANNWDAYGG180
KAQYVKWGKASGLNLTSDDDFFSHPTLRSYYKAHVKAVLNRVNTITNITYKDDPTIFAWE240
LMNEPRCTSDPSGDKLQSWITDMAVYVKSMDAKHLVEIGLEGFYGPSAPDRAQFNPNSYA300
TQVGTDFIRNHQVLGVDFASVHIYADSWISQTITDSHIQFTKSWMEAHIEDAEKYLGMPV360
VFAEFGVSSKDPGYNSSFRDTLINTVYKTLLNSTKRGGSGAGSLLWQLFPDGTDYMDDGY420
AIVLSKSPSTTNIISLHSTRVAIVNSMCSWKCKWGCKKRNPLEAFLYHDDL471
（SEQIDNO.:2）
或
MDTHKRVFGFKIIFLVSVFILLNESSKCSSSGVMDDEQFKTMVEEVDNHLPSSSSSQGVY60
ELNDVEEDEWLMVAKKGNQFVINDQPFYVNGFNTYWLMVFAADQSTRGKVTEVFQKASSV120
GLSVCRTWAFNDGQWRALQKSPGVYDEDVFKALDFVVSEANKYKIRLILSLANNWDAYGG180
KAQYVKWGKASGLNLTSDDDFFSHPTLRSYYKAHAVLNRVNTITNITYKDDPTIFAWELM240
NEPRCTSDPSGDKLQSWITDMAVYVKSMDAKHLVEIGLEGFYGPSAPDRAQFNPNSYATQ300
VGTDFIRNHQVLGVDFASVHIYADSWISQTITDSHIQFTKSWMEAHIEDAEKYLGMPVVF360
AEFGVSSKDPGYNSSFRDTLINTVYKTLLNSTKRGGSGAGSLLWQLFPDGTDYMDDGYAI420
VLSKSPSTTNIISLHSTRVAIVNSMCSWKCKWGCKKRNPLEAFLYHDDL469
（SEQIDNO.:17）
克隆的PtMAN6启动子序列如下：
tgaggaccgaaatgagagaaaaaaacatatgagcgaaaacccttggtcaatagttctgaa60
ttttgttgatcttgaggataaaagtgtatttttactgtccaaataatttgaaaaagacta120
atatacccccaaataattttttaatgaccaataaacatcttgaaaagaccaaactaccct180
tatcataaagccttctattataaaattataatcttattatagcaatccacagtcaattat240
aactagtgttacaatgaaaaaccctctccctagtccctatatttcatgttaattgatatt300
gttaataattggcagaacacaggtgcgcacgagtcttaataataaatctcattcaaggtt360
tgggtaattgttttattaggtcaactttaaaattatattgttttttatttaaaaattact420
caaccatgtgtcacttggatttgactccatcaactagtcaatgggatttgattaaaacaa480
ccttcaagaatggcagtagcctctctaacaacaggggtgcaataattcgataaaaacaag540
aaaaacaagaaaaatcctgaacttttgggtgacaattctagcaaggcccagatagaaata600
gaaaaataccagagccatgcaagatgagtgcttcataatgggccaacaaaaatagttcta660
aaaaaaaaaaactgggctaagatacaacattttgcatggtagacttttttttttttcatt720
ataaaaaaacaagggatcgaaatctaagcttctgatggctgaattcagctcatatcttcc780
ctgaaaattttgaatttcaagtttgattaatccaatgttaggtttttgattcaataaaaa840
caaagcaaaatgatgcaaaaatataaactctcgaagccataccaggatacataatgatat900
caaatacgttgttatgattaaagcaggacctcagattccttgggagctaccttttgctac960
ttcaaagttaaagatagttttttccagttgaatttcaagtttgattaatccaatgttaat1020
gggaactttgagactgcaacagagcacagatatgttaatttgacccaaaaacaggacaga1080
aacaaaaagcatatgatagttgataaatcagacaggttatgtgtttggacaatcaaaggt1140
tgccaggctacttaacaggattttttctaggtctgccatatatatatgaaacattcaagt1200
taagcttgcaacagatcagcttagttctgctcacctgcttaccagctccaatatacttct1260
tcaatctcctactctccagattgctttttgcagagaaatggcatgcatcgatttcgtctt1320
tctttccatggatttatttcttccgtgtttgtctatgtatatgtgtgtgtagagaccaat1380
ctagtttgttggttttaggacatgtcaacatgttcttcaagaaagatgcagtgaccttga1440
agtaatgtcagtgtcatctgaactacaagttatctaggtttaaaagggtctcattttctt1500
gtaggacccttaaaacttaccttaggagtcatacctgaagccttgtttaagtatgcaact1560
agacctaggtctgtagcttttgcttgtgtatatccatctatgtatctgtgtttggaagaa1620
aagaaaatggcagagaaagtataagaattgaaattttcttggatttaaagccatggtgta1680
gatcccctcttcaacactcttcttgcatatcacagtttctgctacagccttagatggcca1740
tgcatataaatatggggggtccagtgaagaggggtgtgcaacccttggtttgctgactca1800
at1802
（SEQIDNO.:3）
2.载体构建
2.1过量表达载体
35S:PtMAN6载体图谱见图1；35S:PtMAN6-GFP载体图谱图2。
2.2反义表达载体
35S:PtMAN6AS图谱见图3。
2.3瞬时表达载体
MAN6G瞬时表达载体见图4，MAN6sG瞬时表达载体见图5。
实施例2过表达PtMAN6，使木材木质素和结晶纤维素的含量降低
Western检测证明PtMAN6过表达（OE）载体及反义（AS）表达载体成功转入杨树，并且在植物体内能够表达，进一步发挥作用（图6A）。
转基因植株分析表明，相对于野生型植株，OE植株叶柄和茎杆变软（图6B，6C和6D），而AS植株则相反（图6B，6C和6E），说明PtMAN6参与调控茎杆的机械强度。进一步切片分析表明，OE植株叶柄中木质素的含量降低（图6F-H）。同样茎中木质素沉积也降低（图7A-I）。成熟木材的木质素及结晶纤维素含量测定进一步证明PtMAN6功能，过表达该基因，导致木材中木质素和结晶纤维素含量降低（图7J，7K）。
实施例3转基因杨树的生物质没有明显改变
本实施例测定了杨树的生物质，结果表明，相对于野生型，1.5年生转基因杨树木材的高度及周长都没有显著变化（图8）。
图8显示1.5年生转基因杨树木材的高度及周长分析结果，其中，图8A显示过量表达PtMAN6杨树（OE），反义表达PtMAN6的杨树（AS）与野生型（WT）杨树的树干高度没有明显差异；图8B显示OE、AS与WT杨树的树干基部的周长没有明显差异，统计学分析采用T检验。
实施例4转基因植物木材单糖组分改变
本实施例测定了杨树木材中各种单糖的组分，结果表明，转基因植物中木材单糖组分有很大的改变。与野生型植株（WT）相比，过表达PtMAN6-GFP的杨树品系（PtMAN6OE）木材中次生细胞壁富集的单糖组分，如木糖和甘露糖含量降低，而相应的初生细胞壁富集单糖含量升高；反义表达杨树品系（PtMAN6AS）中单糖组分改变的趋势与PtMAN6OE品系木材相反，具体结果见表1。
单糖组分通过GC–MS测量，单位为μgmg-1AIR。表中PtMAN6OE和PtMAN6AS分别表示过表达PtiMAN6-GFP及PtiMAN6反义载体的转基因杨树。统计学分析采用T检验，*代表p<0.05，**代表p<0.01(n=4)。
实施例5过量表达PtMAN6的杨树富集半纤维素酶β-1,4-内切甘露聚糖酶
本实施例测定了杨树植株中的β-1,4-内切甘露聚糖酶活性，结果表明，与野生型相比，在PtMAN6过表达植株中，大量富集了β-1,4-内切甘露聚糖酶（图9），该酶最适反应pH值为5.0，最适反应温度为50℃，糖基化对维持PtMAN6的水解活性至关重要。
图9显示了PtMAN6的酶活性分析。其中，图9A为PtMAN6的最适pH测定结果，底物为溶于pH范围为3.0-8.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的1%AZCL-glactomannan悬浮液,WT和PtMAN6分别指从野生型及过表达植株成熟叶片中提取的酶蛋白（下同）；图9B显示PtMAN6的最适反应温度测定结果，底物为溶于pH5.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的1%AZCL-glactomannan悬浮液；图9C显示PtMAN6去糖基化处理结果，Werstern杂交分析植物中提取的PtMAN6（第一泳道），及EndoHf处理0.5小时（第二泳道）及1小时（第三泳道）的PtMAN6，M：预染的蛋白质标记物；图9D为糖基化影响酶活性结果，与对照（control）相比，PtMAN6经EndoHf去糖基化2小时，酶活降低为原来的50%。
实施例6PtMAN6基因可作为木质部导管细胞标记基因
本实施例用定量RT-PCR的方法分析PtMAN6基因在不同部位的表达，发现PtMAN6优势表达于木质部（图10）。进一步的免疫组化分析，发现PtMAN6特异定位于杨树未成熟的木质部导管细胞。在形成层细胞，木质部纤维细胞以及薄壁细胞中都不能检测到定位信号（图11）。因此该基因可以作为木质部导管细胞的标记基因。
图10显示杨树中PtMAN6基因的定量PCR分析结果。分别从1年生杨树的木质部，韧皮部，幼叶，老叶以及茎顶端组织提取RNA进行定量RT-PCR分析，以杨树中Actin基因作为内参。图11显示PtMAN6的免疫定位分析结果。其中，图11A和图11B为1年生野生型杨树第六节间的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11B是图11A中黑框部位的放大图；图11C为1年生野生型杨树第六节间的纵切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11D和图11E为1年生野生型杨树茎顶端组织的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图11E是图11D中黑框部位的放大图；图11F为阴性对照，1年生野生型杨树第六节间的横切图，未能检测到任何定位信号。
实施例7PtMAN6-GFP蛋白的定位
本实施例通过在拟南芥中稳定表达以及洋葱表皮细胞中瞬时表达PtMAN6-GFP，结果都表明PtMAN6蛋白定位于质膜，只转GFP的对照显示GFP信号遍布整个细胞，包括细胞核及胞质。
图12显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜。图12A和图12B显示拟南芥根中稳定表达PtMAN6-GFP蛋白，该蛋白定位于质膜；图12C和图12D，30%蔗糖质壁分离拟南芥根细胞，显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜；图12E为用于瞬时表达的载体；图12F为亚细胞组分的Werstern检测，M为标示蛋白分子，1为胞质组分，2为膜组分；图12G和图12H用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中MAN6G载体；图12I和图12J显示用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中MAN6sG载体；图12K和图12L用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中CK的载体；A，C，G，I，K为GFP荧光图片；B，D，H，J，L为明场图片，标尺为50μm。
实施例8PtMAN6负调控木材形成相关基因的表达
定量RT-PCR检测结果表明，在PtMAN6过量表达植株中，与木材形成相关的PtrWND（PtrWNDA-PtrWND6A）以及一些MYB转录因子（PtrMYB3、20、28）都发生下调（图13），与次生壁合成相关的木质素合成途径基因，纤维素合成基因（CesA8）及木聚糖合成基因（GT43B）的表达同样都有所下降（图14）。PtMAN6通过负调控这些基因从而影响了正常的细胞壁的加厚，进一步影响了木材材性。
图13显示了过量表达PtMAN6的植株中次生壁形成相关转录因子的相对表达水平。RNA提取自1年生杨树木质部，野生型的表达被定义为1，杨树Actin基因作为内参。
图14显示了过量表达PtMAN6的植株中与次生细胞壁成分合成相关基因的表达改变。图14A显示过量表达PtMAN6的植株中，木质素单体合成途径的基因以及木质素聚合相关基因受到抑制；图14B显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的纤维素合成基因CesA8的表达受到抑制；图14C显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的木聚糖合成基因GT43B的表达受到抑制。RNA提取自1年生杨树木质部，野生型的表达被定义为1，杨树Actin基因作为内参。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种PtMAN6多肽或PtMAN6多肽的编码序列的用途，其特征在于，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，或所述PtMAN6多肽的编码序列如SEQIDNO:1所示，所述用途为降低木质素的含量。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述降低木质素的含量为降低植物茎部木质素的含量。
3.如权利要求1所述的PtMAN6多肽或PtMAN6多肽编码序列的用途，其特征在于，所述用途还包括：
降低木质部次生细胞壁的合成。
4.如权利要求1所述的PtMAN6多肽或PtMAN6多肽编码序列的用途，其特征在于，所述用途还包括：
降低结晶纤维生物质的积累。
5.一种改良植物性状的方法，其中，所述的改良植物性状为：
降低植物木质素的含量；
其特征在于，包括步骤：提高所述植物中SEQIDNO:2所示的PtMAN6多肽或其编码序列的表达或活性。
6.如权利要求5所述的改良植物性状的方法，其中，所述的改良植物性状还包括：降低植物木质部的次生细胞壁合成。
7.如权利要求5所述的改良植物性状的方法，其中，所述的改良植物性状还包括：降低植物结晶纤维生物质的积累。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将SEQIDNO:2所示的PtMAN6多肽的编码序列导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物；并且，克隆所述PtMAN6多肽的编码序列的引物如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示。
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| Title |
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| ACCESSION:XM_002323644 Populus trichocarpa predicted protein mRNA;Tuskan,,G.A.,et al.;《GenBank》;20091204 * |
| The Endo-β-Mannanase gene families in Arabidopsis,rice and poplar;Joshua S.Yuan et al.;《Funct Integr Genomics》;20070131;第7卷(第1期);第3页左栏第3段、表1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103451169A (zh) | 2013-12-18 |
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