CN103421699A - 用于预防坏死性肠炎的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预防坏死性肠炎的组合物及其用途，本发明属于生物医药领域。本发明的一种组合物包括选自一种或几种经分离的乳酸杆菌菌株，其中该乳酸杆菌菌株选自于由植物乳杆菌PM-A0087菌株（寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50523）、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株的菌株（寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50525）和双歧乳杆菌PM-A0218菌株（寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50524）所组成的群。本发明还公开了含有上述乳酸杆菌菌株任一者或其组合的组合物在制备预防坏死性肠炎药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸杆菌菌株及由其制备得到的组合物，本发明还涉及所述组合物在制备预防坏死性肠炎药物中的用途。本发明属于生物医药领域。
背景技术
坏死性肠炎（Necrotizing Enterocolitis,NEC）好发于早产儿肠道，是一种常见且死亡率高的肠道疾病。出生体重少于1500公克的早产儿约有12%的坏死性肠炎发生率，其症状包括食欲不振、体重下降、腹涨、血便、腹膜炎、败血症与休克等，严重时会导致死亡。目前已知的相关致病因子包括早产、肠壁缺血/缺氧、细菌感染及肠道喂食等，但真正的病因仍不清楚。
坏死性肠炎的治疗方式包括禁食、支持疗法、抗生素与外科手术等。然而，手术对于早产新生儿的危险性甚高，抗生素治疗虽可抑制肠道内致病菌生长，但同样也会伤害肠道中其它益生菌，破坏肠道内的菌相平衡。因此，目前极需要一种安全且有效预防或治疗坏死性肠炎的药物或食品。
发明内容
本发明非预期性地发现了新颖益生菌菌株，将该益生菌菌株中的一种或几种进行组合，发现经口服给予后能帮助早产儿的肠道维持健康，并进一步预防坏死性肠炎的发生。
一方面，本发明提供了一种经分离的乳酸杆菌菌株，其中该乳酸杆菌菌株选自于由寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50523的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PM-A0087菌株；寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50525的长双歧乳杆菌(Bifidobacterium longum)PM-A0101菌株的菌株；和寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50524的双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)PM-A0218菌株所组成的群。
另一方面，本发明亦提供一种组合物，其包含寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50523的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PM-A0087菌株；寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50525的长双歧乳杆菌(Bifidobacterium longum)PM-A0101菌株的菌株；和寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50524的双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)PM-A0218菌株，其中之一或其组合。
又一方面，本发明亦提供一种组合物用于制备预防坏死性肠炎的药物的用途，其中该组合物包括有效量的本发明的乳酸杆菌组合物与医药上可接受载体。
应了解前述的发明内容和下列实施方式仅为例示和说明，并非为本发明的限制。
附图说明
参照附图，将更能了解前述的发明内容以及实施方式。
在图中：
图1为纯化的植物乳杆菌PM-A0087菌株在显微镜下观察的菌相；
图2为纯化的长双歧乳杆菌PM-A0101菌株在显微镜下观察的菌相；
图3为纯化的双歧乳杆菌PM-A0218菌株在显微镜下观察的菌相；
图4为肠坏死的判断级别的切片结果：
(A)肠坏死0级：无肠坏死现象，肠道中上皮细胞及绒毛组织完整；(B)肠坏死1级：轻度肠坏死，少部份绒毛组织出现不完整；(C)肠坏死2级：中度肠坏死，绒毛组织出现大面积破损坏死；(D)肠坏死3级：重度肠坏死，绒毛组织已完全消失，肠粘膜组织严重坏死；
图5为以植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株单独或组合喂食的新生小鼠与对照组在肠坏死级数的比较图，*及**表示具显著性（*为p<0.05；**为p<0.01）。
菌株保藏信息：
植物乳杆菌PM-A0087菌株于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL）(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.)，寄存编号为NRRL-B50523。
长双歧乳杆菌PM-A0101菌株于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL）(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.)，寄存编号为NRRL-B50525。
双歧乳杆菌PM-A0218菌株于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL）(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.)，寄存编号为NRRL-B50524。
具体实施方式
本发明详细说明如下。在本发明中，参考文献的资料将详列于实施例中。为更佳了解本发明，本文中所使用的术语将另加以详细说明。
本发明系提供具有预防坏死性肠炎功效的新颖菌株，其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PM-A0087菌株，长双歧乳杆菌(Bifidobacterium longum)PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)PM-A0218菌株。
本文在此所称的“坏死性肠炎”一词是指一种急性、局部或慢性肠道的溃烂而导致肠道组织坏死的疾病，主要发生于早产儿。本文在此所称的“预防坏死性肠炎”一词是指在早产儿出生后喂食本发明的益生菌组合物，能显着性地防止坏死性肠炎的发生，或减缓坏死性肠炎的严重程度以降低死亡率。
根据本发明，从发酵植物（如，泡菜）经筛检分离程序不可预期地分离出一种新颖的植物乳杆菌PM-A0087菌株，属兼氧性革兰氏阳性菌株，其特性为不具触酶、氧化酶及运动性，不产生内孢子，于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50523。
根据本发明，从婴儿粪便经筛检分离程序不可预期地分离得到一种新颖的长双歧乳杆菌PM-A0101菌株，属厌氧性革兰氏阳性杆菌株，其特性为不具触酶、氧化酶及运动性，不产生内孢子，于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50525。
又，根据本发明，从人类肠道经筛检分离程序不可预期地分离得到一种新颖的双歧乳杆菌PM-A0218菌株，属兼养性革兰氏阳性杆菌株，其特征为不具有触酶、氧化酶及运动性，不产生内孢子，生长于厌氧环境下，于2011年7月15日寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50524。
同时，本发明亦提供一种组合物，其包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)PM-A0087菌株，长双歧乳杆菌(Bifidobacterium longum)PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)PM-A0218菌株之一或其组合。本发明的组合物具有预防坏死性肠炎的活性。
根据本发明，本发明的组合物中植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例及菌数并无需特定，可依所需任意组合；菌数比例较佳为1∶1∶1，各乳酸杆菌的菌数较佳为0.1~10x 109CFU/ml。在本发明的一个较佳具体实施例中，本发明的组合物中植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例为1∶1∶1，且各乳酸杆菌的菌数约为1x 109CFU/ml。在本发明的另一个具体实施例中，植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例为1∶1∶1，且各乳酸杆菌的菌数各为1.5x 109CFU/ml。
根据本发明的一个具体实施例，本发明的组合物可以口服投与，并制备为任何适当的形式。举例来说，适合口服投与的固体形式，如：丸状、胶囊、颗粒、锭剂和粉末，或是液体形式，如：饮料、糖浆、溶液、以及悬浮液。本发明的组合物可添加一种或多种常用于口服配方的载体或赋形剂做成组合物，或视需要添加例如表面活性剂、溶解剂、稳定剂、乳化剂、浓缩剂、色素、甜味剂、风味添加剂以及防腐剂等。
根据本发明的一个具体实施例，本发明的组合物可制备为食品，包括但不限于乳品、发酵乳制品、饮料、运动饮料、营养添加物或保健食品、糖果或是胶体。
另一方面，本发明提供一种组合物用于制备预防坏死性肠炎的药物的用途，其中该组合物包括有效量的本发明的组合物与医药上可接受载体。
根据本发明，本发明的组合物中植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例较佳为1∶1∶1，各乳酸杆菌的菌数较佳为0.1~10x 109CFU/ml。在本发明的一个较佳具体实施例中，本发明的组合物中植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例为1∶1∶1，且各乳酸杆菌的菌数约为1x 109CFU/ml。在本发明的另一个具体实施例中，植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株，以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数比例为1∶1∶1，且各乳酸杆菌的菌数各为1.5x 109CFU/ml。
本发明由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不受限于该用于展示的实施例。
实施例1：植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的筛检分离
植物乳杆菌PM-A0087菌株
将市售泡菜放入50ml离心管中，加入些许无菌去离子水后分别滴入如下不同分离目的的各式培养基：
(1)MRS-封：分出乳酸杆菌-兼性厌氧环境；
(2)MRS-不封：分出球菌-好氧环境；
(3)MRS+半胱胺酸（Cysteine）-封(厌氧)：分出乳酸杆菌的B菌-兼性厌氧环境；
(4)LBS-封：分出乳酸杆菌-兼性厌氧环境；
(5)LBS+冰醋酸-封(厌氧)：分出乳酸杆菌-兼性厌氧环境；
(6)TS-不封：分出芽孢杆菌-好氧环境；
(7)LB-不封：分出大肠菌(E.Coli)；
(8)BCP-封：分离出蓝色菌群(colony)非乳酸菌；
(9)BCP-不封：分离出黄色菌群(colony)是乳酸菌。
以灭菌吸管将样品再滴入各式培养基的第一区，本次1个样本共有九片(MRS-封及不封、MRS+半胱胺酸-封(厌氧)、LBS-封、LBS+冰醋酸-封(厌氧)、TS-不封、BCP-不封)，再用接种环过火后将第一区液体涂开至第二区，接种环过火后再涂至第三区及第四区。将部份样品液体行革兰氏染色确定目前产品内菌种多少样。翌日后取以上培养皿，将不同菌相的菌落用黑色细字笔圈出两个以上较相同的菌落，去镜检后，将以上已知的菌种的菌落以它适合的培养皿再涂四区培养，一直重复至纯化菌种为止。
MRS培养基配方如下(g/L)，最终pH 6.5±0.2：
蛋白(Proteose peptone)，10.0g
牛肉萃取物，10.0g
酵母萃取物，5.0g
右旋糖，20.0g
聚山梨糖醇酯80，1.0g
柠檬酸胺，2.0g
乙酸钠，5.0g
硫酸镁，0.1g
硫酸锰，0.05g
磷酸二钾，2.0g
洋菜胶，15g
二次水，1000mL
图1为纯化的菌种在显微镜下观察的菌相，其为外观呈短杆的革兰氏阳性菌，编号为PM-A0087，寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50523。
长双歧乳杆菌PM-A0101菌株
自新生儿采集的粪便(2.05g)放入50ml离心管中，加入些许无菌去离子水后分别滴入如上述的培养基，并以与分离植物乳杆菌PM-A0087相同的纯化步骤得到一纯化菌株。
图2为纯化的菌种在显微镜下观察的菌相，其系为外观呈短杆及Y字型的革兰氏阳性菌，编号为PM-A0101，寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50525。
双歧乳杆菌PM-A0218菌株
自新生儿采集的粪便(6.34g)放入50ml离心管中，加入些许无菌去离子水后分别滴入如上述的培养基，并以与分离植物乳杆菌PM-A0087相同的纯化步骤得到一纯化菌株。
图3为纯化的菌种在显微镜下观察的菌相，其系为外观呈短杆及Y字型的革兰氏阳性菌，编号为PM-A0218，寄存于美国农业研究菌种保藏中心（NRRL），寄存编号为NRRL-B50524。
实施例2：包含植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株其一及组合的组合物用于预防坏死性肠炎的效果。
菌株培养
植物乳杆菌PM-A0087菌株以MRS培养基在37℃下培养，长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双歧乳杆菌PM-A0218菌株以MRS培养基添加5%半胱胺酸在厌氧环境、37℃下培养。培养三天后，将各乳酸菌株自培养箱取出，然后将养菌管中的菌液反复抽吸完全打散，测定吸光值并依所测的数值预估菌数，并将植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别调整至1.5x 109CFU/ml。
保存及喂食前处理
经调整菌数的各乳酸菌分别取1ml分装至1.5ml离心管中然后进行离心，以3000rpm转速离心10分钟，离心后去除上清液。于4℃冷藏30分钟后，移至-20℃冷冻保存。喂食前，将植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株以及双歧乳杆菌PM-A0218菌株从-20℃冰箱取出，均匀混合至1ml牛奶中备用。
致病菌株的制备
取出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）与大肠杆菌Escherichia coli冻菌管。将接菌环烧红冷却后，沾取冻菌管内菌液，在LB洋菜胶上划四区，放入37℃培养箱培养18小时。各取5mL生理食盐水到三管透明玻璃试管中，并以无菌棉棒沾取LB洋菜胶上长出的菌落，放入玻璃试管中与5mL生理食盐水均匀混合。菌液混合均匀后，以目视方式与2号比浊管比较浊度，将试管中的菌液调整至相同浊度。将调整好的菌液，以2∶2∶3的比例混合均匀，分装至1.5mL离心管中，4℃冷藏备用。
实验动物模式
将怀孕21天的史-道二氏（SD）大鼠母鼠以二氧化碳麻醉50秒。用酒精喷拭母鼠肚子后，剖开母鼠肚子并剪开心脏使其死亡。接着以镊子夹住胎盘，再以小剪刀迅速将新生小鼠外膜与脐带剪开取出新生小鼠。用棉棒轻压脐带剪开处避免大量出血死亡，并擦拭新生小鼠全身粘液，避免阻塞呼吸道死亡。称重并放入37℃保温箱中饲养(控制湿度40~50度)。用棉棒轻推新生小鼠的肚子，帮助排便及排尿。
随机方式分为对照组与实验组，实验组依实验组别分为五组，于出生后3小时喂食50μL致病菌。出生后6小时分别喂食50μL牛奶或添加乳酸菌的牛奶。喂完后将新生小鼠放入充满100%氮气盒子60秒后，再放入4℃冰箱10分钟，进行造症，每12小时造症一次。出生后9小时两组皆喂食50μL致病菌，出生后12小时喂食50μL牛奶或添加乳酸菌的牛奶，以此方式进行喂食致病菌与添加乳酸菌的牛乳。经过24小时后，会产生坏死性肠炎征状，如：血便、呼吸不顺、食欲不振、体重下降等。当发现新生仔鼠快死亡时，采集整段小肠与大肠，放于包埋盒，再置于装有20mL 4%三聚甲醛的检体盒中，进行组织切片后判读肠道坏死程度。
结果与统计
如图4示，依据切片结果将坏死性肠炎分为0级(无坏死)、1级(轻度)、2级(中度)、3级(重度)四个等级，各组小鼠的切片判读结果整理于表1中。依据判读结果用SPSS12.0统计软体以无母数曼-惠特尼（Mann-Whitney）检定，显著性p值<0.05判定为具有显著差异，结果如表2所示。
表1
表2
结果如表1、表2及图5所示，喂食本发明乳酸菌之一或其组合的组合物的实验组早产仔鼠，相较于对照组皆有较好的预防坏死性肠炎效果，且具差异显著性（p<0.05）。而在实验组中，喂食本发明的两种或三种乳酸菌组合物的早产仔鼠，相较于对照组具有坏死性肠炎较低的发生率，且具差异显著性（p<0.05）。此外，相较于单独喂食含有单一乳酸菌的早产仔鼠，亦具坏死性肠炎较低的发生率，且疾病发生的严重程度亦被降低，且具差异显著性（p<0.01）。
所属技术领域的技术人员应了解，在不悖离其广泛的发明概念下，上述具体实施例可做改变。因此应了解，本发明并不受限于本文中所揭示的特定具体实施例，而意欲涵盖在权利要求所定义的本发明的精神和范畴内的修改。
Claims (13)
1.一种经分离的乳酸杆菌菌株，其中该乳酸杆菌菌株选自于由
寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50523的植物乳杆菌PM-A0087菌株；
寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50525的长双歧乳杆菌PM-A0101菌株的菌株；和
寄存于美国农业研究菌种保藏中心，寄存编号为NRRL-B50524的双歧乳杆菌PM-A0218菌株所组成的群。
2.一种组合物，包括如权利要求1所述的乳酸杆菌菌株任一者或其组合。
3.如权利要求2所述的组合物，其具有预防坏死性肠炎的活性。
4.如权利要求2所述的组合物，包括植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株组合的菌数比例为1∶1∶1。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为0.1~10x 109CFU/ml。
6.如权利要求5所述的组合物，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为1x 109CFU/ml。
7.如权利要求5所述的组合物，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为1.5x 109CFU/ml。
8.如权利要求2所述的组合物，其为食物、饮料、或是药物。
9.一种组合物用于制备预防坏死性肠炎的药物的用途，其中该组合物包括有效量的如权利要求2所述的组合物与医药上可接受载体。
10.如权利要求9所述的用途，其中该组合物包括植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株，该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株组合的菌数比例为1∶1∶1。
11.如权利要求10所述的用途，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为0.1~10x 109CFU/ml。
12.如权利要求11所述的用途，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为1x 109CFU/ml。
13.如权利要求11所述的用途，其中该植物乳杆菌PM-A0087菌株、长双歧乳杆菌PM-A0101菌株和双叉乳杆菌PM-A0218菌株的菌数分别为1.5x 109CFU/ml。
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