CN103392920A - 一种大豆皮的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆皮的发酵方法。采用复合微生物法发酵大豆皮，并经过单因素试验的筛选，确定出复配微生物法发酵大豆皮饲料的最佳氮源、无机盐及最佳添加比例。其方法包括大豆皮发酵培养基的制备、发酵菌种扩增培养基的制备、发酵菌种扩增、接种四个步骤。本发明首先根据国家规定发酵饲料的常用菌种设计了一种用于发酵大豆皮的菌种组合，其最佳菌种组合为草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌。本发明的方法能够使发酵饲料的粗蛋白营养水平达到16.04%、粗纤维达到22.09%，脲酶为零；与其它单一底物的方法相比，粗蛋白提高了52.83%，粗纤维降低了40.13%。大大提高了粗蛋白含量，增加了发酵效率、提高了生产效益，降低了饲料成本。

Description

一种大豆皮的发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵饲料技术领域，具体涉及一种大豆皮的发酵方法。

背景技术

大豆皮大豆外层包被的物质，颜色为米黄色或浅黄色，其占整个大豆体积的10%，重量的8%。研究表明大豆皮的主要成分是细胞壁和植物纤维，其粗纤维含量为38.0%，粗蛋白10.0%，钙0.53%，磷0.18%，木质素含量低于2.0%。作为大豆制油工艺的副产品，大豆皮可由油脂加工热法脱皮或压碎筛理两种加工方法所得。

2012年度全球大豆产量为2.786亿吨/年；大豆皮是现代制油工艺中的一个副产品，约占大豆重量的8%，由此预计全球大豆皮产量达到0.223亿吨/年。我国是大豆生产国，年产量在1500万吨以上。随着我国大豆榨油工业的发展和对豆粕需要量的增加，我国每年需要进口大量的大豆，2011～2012年均进口大豆为5700多万吨，大豆加工能力为6500～7800万吨/年左右，预计产生500～576万吨/年的大豆皮。而且大豆皮价格低，为1.4～1.6元/kg，而玉米和小麦麸价格分别为2.5元/kg和1.7元/kg左右。我国是一个人口众多、粮食和饲料资源极其缺乏的国家，因此，大豆皮作为一种新的饲料资源开发利用具有重要经济价值和市场前景。

然而，由于大豆皮其含有大量的脲酶、胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子，因此，目前在畜禽利用上受到了一定的限制，仅少量应用于牛、羊粗饲料中，大部分只是用作肥料，并没有将其科学的开发和利用。并且，大豆皮的加工多采用传统的烘烤及高温蒸煮等方法以消除大豆皮抗营养因子，导致制备的产品耗能高、适口性差。

随着生物工程技术的不断进步，目前使用的大豆皮利用技术将逐渐被新工艺、新技术所取代，工艺向着更加降耗节能、绿色环保方向发展，更加注重产品的质量、适口性和生物资源的综合优化利用。由于考虑到环保、节能和成本等问题，若采用微生物发酵法处理大豆皮，与传统的蒸煮法相比，生产出的产品蛋白含量高、抗营养因子含量少、富含有益菌，环境污染小，是一种更为科学的加工方法。

然而。到目前为止，国内外对于大豆皮加工利用没有进行系统的研究，大豆皮发酵技术也很不够成熟，致使大豆皮产品的蛋白质增加量少，纤维素降解率低，饲料转化率差，导致此项技术无法进行大规模推广。为此，深入研究最佳复合菌群发酵大豆皮技术，对进一步提高其营养利用价值，扩大其在饲料中的应用范围，以廉价的发酵饲料替代常规饲料具有重要的经济和社会价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆皮的发酵方法，即采用复合微生物菌群来发酵大豆皮，以填补目前该领域技术的空白。

申请人通过长时间的研究，经过各种因素的筛选，确定出复和菌群的发酵大豆皮饲料的最佳工艺条件。

本发明的大豆皮的发酵方法，具体包括如下步骤：

1）原材料处理：将大豆皮和麸皮混合后用粉碎机粉碎，粒度为40目；

2）复和菌群的制备：将乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌和草酸青霉菌进行扩大培养后制成复合菌群；

3）将制备好的复合菌群加入到以粉碎后的大豆皮和麸皮作为主要营养物质的培养基中进行大豆皮的发酵。

所述的步骤2）中的复合菌群，其中乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌和草酸青霉菌的菌种数量比为2：1：2：1;

所述的步骤3）中的培养基中大豆皮和麸皮的质量比为9:1；且大豆皮和麸皮在培养基中的浓度为90%。

培养基中还添加有氮源和无机盐；所述的氮源为氯化铵和尿素，其在培养基中的添加量分别为2.0%和1.5％；

所述的无机盐为磷酸氢二钠和碳酸钙，其添加量分别为0.2%和0.3%。

本发明的方法首先配制了一种复合微生物菌群，可以有效的对大豆皮进行发酵；另外，本发明对发酵的培养基进行了配合添加氯化铵作为氮源；添加磷酸氢二钠和碳酸钙作为无机盐。通过添加氮源和无机盐能促进菌种的生长，从而提高发酵饲料的蛋白含量和降低纤维素含量。其发酵效果优于传统的未添加氮源和无机盐的发酵。并且，该发明的工艺可以有效增加产品生产效率、提高产品质量，增加产品利用价值，满足了如今饲料行业廉价和安全需求，为大豆皮的科学利用提供了更加科学的方法。

附图说明

图1：无机氮源的不同添加量对发酵产物中真蛋白及纤维含量的影响图；

图2：无机盐对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响图；

图3：温度对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响图；

图4：发酵时间对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响图；

图5：料水比对发酵产物粗蛋白及纤维含量的影响图；

图6：料层厚度对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

本发明的制备方法，包括如下的步骤：

1）原材料处理：将大豆皮和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按大豆皮和麸皮的比例为9:1，料水比为3：1混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加大豆皮45g，麸皮5g，蒸馏水12.5ml，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。

2）复合菌群的制备：

本发明经过了长期的研究确定了一种用于发酵大豆皮的菌种组合，其复合发酵菌株由草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌和产阮假丝酵母菌组成，通过上述四种菌株之间的复配作用来有效的降解大豆皮。

A、选用菌株的性状描述：

选用的草酸青霉能够产生高活力降解纤维素的纤维素酶和果胶酶；其中纤维素酶能将大豆皮中的纤维素降解为糖，供其它菌种生长所需营养；分解的果胶酶是一个多酶复合体系，能够作用于植物饲料（包括大豆皮）细胞壁中胶层，使细胞壁变薄，相邻细胞壁消失，细胞壁排列疏松，破坏细胞壁的结构，使营养物质与消化酶充分接触，提高动物内源酶（如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等）的活性；并水解果胶中以α-1,4糖苷键结合的半乳糖醛基，产生还原糖；从而提高机体对饲料中纤维、蛋白质、钙、磷等营养物质的利用率；另外，磷的吸收率增加，可以有效降低畜牧场磷的排泄量，减少环境污染，有利于保护生态。

选用的纳豆芽孢杆菌是发酵食品级纳豆用的菌株，对大豆有很强的发酵能力，且发酵之后有清香味；纳豆芽孢杆菌具有较强的产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等解酶的活性，同时还具有降解植物性饲料中非淀粉多糖酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，促进动物对营养物质的消化吸收；纳豆芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；纳豆芽孢杆菌的芽孢可刺激产生免疫反应，增强机体的免疫力。

选用的乳酸菌能调节发酵饲料的适口性；乳酸菌进入肠道后会形成优势菌种，从而抑制病菌的繁殖，并且自身可以产生多种抑菌物质，可以抑制或杀死病原微生物，从而增强机体免疫功能，增加机体抵抗力，最终改善动物的消化和生长性能。

选用的产阮假丝酵母菌能在有糖的培养基中快速增值，是常用的单细胞蛋白饲料；酵母菌是畜禽动物的长居微生物之一，也是优势菌群。在饲料中添加酵母菌可刺激动物肠道中益生菌的数量增加，改善动物肠道中的微生物环境；酵母菌的细胞壁由特殊的酵母纤维组成，主要是由甘露聚糖和葡萄糖组成。甘露聚糖能增强能增强机体的免疫力；酵母菌可以抑制黄曲霉毒素的中毒作用机理，对黄曲霉毒素有解毒作用。

本发明所用的乳酸菌为嗜酸乳酸菌，其一种菌株编号为ACCC10637、纳豆芽孢杆菌的编号为CGMCC1.1086、产阮假丝酵母菌的编号为CICC32835。但在本发明的发明思路下，可以选用其它的菌株。

对于草酸青霉菌种，该菌由青岛农业大学优质水禽研究所从鹅肠道中分离获得的，具有对纤维素很高降解能力，已经过中国科学院微生物研究所鉴定并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（微生物保藏编号：CGMCC No.2260）。上述4种菌种组方使用能够最大提高发酵大豆皮的蛋白含量和降低纤维素含量，并且能够完全降解抗营养因子。

本发明选择的上述四种发酵菌种复合应用，具有增加发酵饲料的营养物质含量、提高动物适口性与营养利用率、降解大豆皮中有毒有害物质和良好的动物生产中的益生作用。

B、发酵菌种扩增培养基的制备：

草酸青霉扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，微温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖20.0g溶解后，摇匀，纱布滤清，调节PH值使灭菌后为6.4±0.2，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。培养温度为30℃，培养时间为18h～24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

乳酸菌扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入蛋白胨10.0g，牛肉浸取物（牛肉膏）10.0g，酵母提取液（酵母膏或酵母粉）5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二胺2.0g，吐温-801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，用10%盐酸调节pH6.2～6.4，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。接种后培养温度为42℃，兼性厌氧，培养温度为18h～20h，培养结束后，从培养箱中取出放在4℃的冰箱中保存。

纳豆芽孢杆菌扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入蔗糖10g、大豆蛋白胨10g、NaCl5g，放在火上加热。待完全溶解后，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。接种后培养温度为37℃，培养时间为18h～24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

产阮假丝酵母菌扩增培养基配制方法：取250g干麦芽，将干麦芽磨碎，粒度为100目，放入大烧杯，加入1000ml蒸馏水，在64℃～66℃水浴锅中糖化3h～4h。将糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如果浑浊不清，用鸡蛋白澄清。方法是，将一个鸡蛋中的蛋白取出加水20ml，调匀用玻璃棒搅拌至生泡沫为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后，用8层纱布过滤。滤液调节PH为7.0～7.2，糖度用糖度计测量并加蒸馏水稀释到5⁰Be，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。培养温度为25℃～28℃，培养时间为24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

3）制备好的复合菌群加入到以粉碎后的大豆皮和麸皮作为主要营养物质的培养基中进行大豆皮的发酵。

将扩增好的草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌菌液分别用无菌水稀释到1×10⁷个／ml，接种到发酵培养基上，培养基中添加尿素和氯化铵作为氮源，其添加量为1.5%或2.0%；同时添加磷酸氢二钠和碳酸钙作为无机盐，其添加量分别为0.2%、0.3%培养基上接种5ml的菌液。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h完成发酵。

实施例1：复合菌种发酵大豆皮饲料氮源和无机盐的筛选试验

原材料处理：将市售的大豆皮和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按大豆皮和麸皮的比例为9:1，料水比为3：1混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加大豆皮45g，麸皮5g，蒸馏水12.5ml，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。

将扩增好的草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌菌液分别用无菌水稀释到1×10⁷个／ml，接种到发酵培养基上，每个培养基中分别添加尿素、氯化铵、硝酸铵、草酸铵作为氮源其添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（及为0.5g、0.75g、1.0g、1.25g），每一个培养基上分别接种5ml的菌液。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，在固态发酵试验中，尿素、氯化铵、草酸铵、硝酸铵这四种氮源加入均可以提高发酵产物真蛋白的含量；但在等氮量的情况下，尿素、氯化铵对发酵产物的真蛋白含量的增幅高于其他氮源。当尿素和氯化铵添加量为2.0%时发酵产物的真蛋白含量较大，比未发酵的底物分别提高了82.18%和80.90%,粗纤维相比降低了37.05%和37.97%。另外发现，混合菌种对草酸铵及硝酸铵铵都几乎不能利用，发酵产物的真蛋白含量没有明显的增加，而且不能随草酸铵及硝酸铵添加量的增加而增加，说明混合菌株基本不能利用草酸铵及硝酸铵作为氮源。尿素添加量为1.5%时，真蛋白含量可达12.62%，当尿素添加量超过2.0%时，虽然真蛋白含量略有提高，但尿素残留量也随之明显上升，发酵产物有明显的刺鼻性气味，氯化铵虽然效果很好但是价格较贵。综合考虑以上情况，确定大豆皮发酵饲料中较合适的氮源为尿素且添加量为1.5％。见附图1。

②无机盐筛选试验

将扩增好的草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌菌液分别用无菌水稀释到1×10⁷个／ml，接种到发酵培养基上，每个培养基中分别添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸钙作为无机盐其添加量为0.1%、0.2%、0.3%（及为0.05g、0.1g、0.15g）。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，0.2％的Na₂HPO₄的添加效果最好，CP含量较其它组含量最高，比未发酵的混合底物提高了48.61%，粗纤维降低了38.75%；0.3%的K₂HPO₄效果仅次于Na₂HPO₄，CP含量比未发酵的混合底物提高了46.71%粗纤维降低了36.11%。Ca的添加同样能提高发酵产物的CP，且碳酸钙效果和成本都优于氯化钙，当添加量为0.3%时CP含量较其它组含量最高，比未发酵的混合底物提高了22.54%，粗纤维降低了29.04%。综合考虑以上情况，确定大豆皮发酵饲料中较合适的无机盐为0.2％的Na₂HPO₄和0.3%碳酸钙。见附图2。

实施例2：大豆皮饲料发酵工艺试验

原材料处理：将大豆皮和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按大豆皮和麸皮的比例为9:1，料水比为3：1混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加大豆皮45g，麸皮5g，蒸馏水12.5ml，碳酸钙0.15g、尿素0.5g、磷酸氢二钠0.1g，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。

①最佳发酵温度的选择

接种完之后，接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，分别将培养放在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h

试验结果表明，一开始随着温度的升高，发酵产物粗蛋白含量逐渐升高，在30℃达到最大比未发酵的混合底物提高了52.31%，粗纤维降低了39.51%。但继续升高温度，反而抑制了部分微生物的生长，使得粗蛋白含量反而有所下降。故在生产中采用30℃较为合适。见附图3。

②最佳发酵时间的确定

接种完之后，接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，将培养放在30℃的恒温培养箱中培养，试验选取培养时间分别为24h，36h，48h，60h，72h，84h的发酵产物，对其CP、NDF、ADF及CF含量进行测定，从而确定最适发酵时间。

试验结果表明，随着发酵时间的增长，发酵产物CP含量呈现先升后降的趋势，发酵72h发酵产物粗蛋白含量达到最高，比未发酵的混合底物提高了56.99%，粗纤维降低了41.31%。故在生产中发酵时间为72h较为合适,见附图4。

③最佳料水比的确定

将大豆皮和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按大豆皮和麸皮的比例为9:1，调节料水比为1:1、1:2、1:3、1:4、1：5（及分别加蒸馏水为25ml、16.66ml、12.5ml、10ml、8.33ml）混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加大豆皮45g，麸皮5g，碳酸钙0.15g、尿素0.5g、磷酸氢二钠0.1g，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。按重量比的10%将四个菌种接种到培养基上，接种完之后，将培养基放到培养箱中，培养温度为30℃，培养时间为72h。

试验结果表明，随着料水比的增加，CP含量先增加后降低，NDF、ADF及CF含量先降低后增加，在料水比为1:3的时候，发酵产物中的粗蛋白含量达到最高，比未发酵的混合底物提高了55.57%，粗纤维降低了39.22%。故在生产中料水比应为1:3。见附图5。

④最佳料层厚度的确定

将大豆皮和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按大豆皮和麸皮的比例为9:1，料水比为3：1混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加大豆皮95%，麸皮5%、碳酸钙0.3%、尿素1.5%、磷酸氢二钠0.1%g，调节料层厚度分别为25cm、35cm、45cm、55cm、65cm，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。按重量比的10%将四个菌种接种到培养基上。接种完之后，将培养基放到培养箱中，培养温度为30℃，培养时间为72h。

试验结果表明，料层厚度在25cm～55cm的范围内，CP差异不显著，但均显著于料层厚度为65cm时的CP含量，同时试验过程中观察到：随着料层厚度的增加，菌种的生长速度减慢，产物的品质变差。当料层厚度大于55mm后，产物出现异味，同时其CP明显下降。当料层厚度为45cm时CP含量到达最高，比未发酵的混合底物提高了53.15%，粗纤维降低了39.49%。故在生产中调节料层厚度可选择45cm以内。见附图6。

实施例3：应用本发明确定的方法发酵大豆皮

采用复合菌株分别为：草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌；其按照体积分数的比例为2:1:2:1（发酵菌液中）；其按照重量分数的最佳接种量为10%；固态发酵培养基中大豆皮添加比例为81%，麸皮为9%；氮源为尿素和氯化铵，按重量分数添加比例为1.5%和2.0%；无机盐为磷酸氢二钠和碳酸钙，按重量分数添加比例为0.2%和0.3%，余量为水。最佳发酵时间为72h；最佳料层厚度为45cm。

通过5次验证试验，发酵大豆皮饲料主要营养成分如下：粗蛋白16.04%、粗纤维22.09%、酸性洗涤纤维29.60%、中性洗涤纤维37.90%、钙0.78%、磷0.36%、脲酶为零。所得CP含量比未发酵的混合底物依次提高了52.83%、51.58%、50.89%、49.99%、51.34%；CF含量比未发酵的混合底物依次降低了40.13%、39.40%、39.29%、38.90%、39.99%。与实施案例2的结果基本一致；表明，本发明的最佳工艺具有很好稳定性。在所确定的发酵工艺下，烘干前发酵产品呈黄绿色，烘干粉碎后呈灰黄色，有浓烈的酒香和酸香味，无霉味，含水量10%左右。

另外，饲养试验结果表明，饲粮中添加9%的发酵大豆皮饲养组生产性能最佳，2-4周龄饲粮中添加9%发酵大豆皮饲料，料肉比为2.65:1，与对照组比较（未添加发酵大豆皮饲料成分），体重增加9.57%,饲料转化率提高了7.5%，饲料成本降低6.3%；4-8周龄饲粮中添加9%发酵大豆皮饲料，料肉比为3.375:1，与对照组比较（未添加发酵大豆皮饲料成分），体重增加了12.2%，饲料转化率提高了11.1%，饲料成本降低7.9%。

本发明的复合菌株发酵大豆皮饲料的方法与其它单一底物发酵方法相比，能够使发酵产物的粗蛋白显著提高，粗纤维显著降低；大大增加了大豆皮的营养物质含量，提高了使用安全性和利用价值；其发酵产品各项指标填补了该领域空白；此项技术可以广泛应用于大豆皮发酵产品的进一步开发，拓宽了在动物饲粮中的广泛利用，具有广阔的市场开发前景。

Claims (7)

1.一种大豆皮的发酵方法，包括如下步骤：

1）原材料处理：将大豆皮和麸皮混合后用粉碎机粉碎，粒度为40目；

2）复和菌群的制备：将乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌和草酸青霉菌进行扩大培养后制成复合菌群；

3）将制备好的复合菌群加入到以粉碎后的大豆皮和麸皮作为主要营养物质的培养基中进行大豆皮的发酵。

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的步骤2）中的复合菌群，其中乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌和草酸青霉菌的菌种数量比为2：1：2：1。

3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的步骤3）的培养基中大豆皮和麸皮的质量比为9:1。

4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的步骤3）中大豆皮和麸皮在培养基中的浓度为90%。

5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的步骤3）的培养基中还添加有氮源和无机盐。

6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述的氮源为氯化铵和尿素，其在培养基中的添加量分别为2.0%和1.5％。

7.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述的无机盐为磷酸氢二钠和碳酸钙，其添加量分别为0.2%和0.3%。

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