CN103370414A - 降低恶性神经胶质瘤中下调肾细胞癌的表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症，特别是恶性神经胶质瘤的新型组合物和治疗方法。该组合物包含反义寡核苷酸或RNA或编码它们的载体，其降低肿瘤细胞中下调肾细胞癌（DRR）的表达，和抑制恶性神经胶质瘤细胞入侵。

Description

降低恶性神经胶质瘤中下调肾细胞癌的表达的方法

相关申请

本申请要求2010年5月18日提交的美国临时申请NO.61/345,751的优先权，其全部内容包括在此以供参考。

技术领域

本发明涉及用于治疗恶性神经胶质瘤的新药物组合物和方法。

背景技术

神经胶质瘤起源于脑的支撑细胞，称为神经胶质。可将这些细胞再分成星形胶质细胞、室管膜细胞和少突神经胶质细胞。神经胶质瘤是最常见的初级脑癌（原发脑癌）且为其中最具破坏性的人类恶性肿瘤。肿瘤的分级是从最低的1级至最高的4级，多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforme）（GBM）是神经胶质瘤的最高等级和最致命的类型。高等级的神经胶质瘤或GBM是最常见的初级恶性脑肿瘤，并且是最具破坏性的，占所有初级脑肿瘤的19%。

在儿童中看到良性的神经胶质瘤，称为毛细胞型星形细胞瘤（pilocyticastrocytomas），且通过完全外科切除术很好地治疗，病人一般维持完全的预期寿命。相反，高等级的或恶性的神经胶质瘤，称为星形细胞瘤、少突神经瘤或神经胶母细胞瘤，是通过脑入侵表征的成人肿瘤。不同于不侵袭正常的脑的良性神经胶质瘤，恶性神经胶质瘤是高度入侵的。通常，甚至在完全的外科切除之后，高等级的神经胶质瘤也几乎总是重新长出来。

可进一步将恶性的神经胶质瘤分成低等级和高等级。低等级恶性神经胶质瘤是高度地入侵的但是具有低的增殖率，经常在临床表现之前入侵多个脑叶。随着时间的过去，低等级的恶性神经胶质瘤可发生遗传改变，其增加它们的增殖率并将它们变成更高等级（Louis,D.N.et al.,Cancer Cell1:125-128,2002）。

患有高等级的神经胶质瘤的病人的预后通常较差。恶性的神经胶质瘤是所有成功地治疗的癌症中最具挑战性的，因为他们的特征不仅是积极的增殖和扩张，而且是它们的远距离脑组织的积极入侵。在每年诊断的具有恶性神经胶质瘤的约10,000美国人中，约一半在诊断之后存活1年，25%存活两年。具有恶性的星细胞瘤的那些约存活三年。多形性胶质母细胞瘤在诊断之后，具有少于12个月存活的更坏的预后。标准的治疗包含外科切除术，之后是化学治疗和放射治疗。不幸地，这种多峰方法（multimodalapproach）仍然转变成只有12至14个月的平均存活。不能治愈神经胶质瘤。

一种管理这种破坏性的癌症的期望的方法将是抑制恶性的神经胶质细胞（MGC）入侵。在局部的环境中维持MGC会留下进一步开放的治疗选项。然而，当前没有可用于抑制脑癌入侵的治疗策略。

在恶性神经胶质瘤入侵中牵涉了很多分子，然而，相关过程的分子机制还不是很清楚。当前细胞入侵的理解是来源于不同的细胞类型和环境的研究的组合。细胞入侵涉及细胞过程的延长、通过焦点粘连（focaladhesion）（FA）形成的联接、形成容纳移动的细胞的空间的细胞外基质的降解、细胞体向前的迁移、和细胞后FA的释放（Friedl and Wolf，Nat RevCancer3:362-74,2003）。这种多步过程需要调整的细胞表面受体、信号通路、细胞骨架元件、FA成分、和细胞外基质降解酶的作用（Burridge andChrzanowska-Wodnicka,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.12:463-519,1996;Lauffenburger and Horwitz,Cell84:359-369,1996;Ridley etal.,Science302:1704-9,2003）。在这种方案内，近来的研究指出肌动蛋白/微管（MT）动力学在细胞前膜突出和细胞后收回中的重要性（Palazzo and Gundersen,Sci.STKE2002PE31,2002;Rodriguez et al.,Nature Cell Biology7:599-609.2003）。细胞后收回需要调节的FA解体和肌动蛋白/MT系统在过程中扮演重要的角色。

虽然正常的生理条件和癌症中的细胞运动之间存在很多类似处，认为MGC利用另外或可替换的机制（Beadle et al.,Mol Biol Cell.19:3357-68.2008）。近来的研究表明，MDC利用类似于神经祖细胞运动的细胞运动模式侵袭脑的致密物质（dense substance）。

最初从患有肾细胞癌症的病人的染色体3短臂克隆“下调肾细胞癌（DRR1）”基因（也称为TU3A，此处可替换地称为DRR、DRR-1和DRR1）（Wang et al.,Genes Chromosomes&Cancer27:1-10,2000）。Wang等人报道，基因显示在肾细胞癌（RCC）细胞系，以及在初级肿瘤（原发肿瘤）中的重要的表达损失，以及基因到DRR阴性细胞系中的转染导致生长抑制，表明DRR作为肿瘤抑制剂的角色。还不清楚DRR基因产物的功能。基因序列预测144个氨基酸的蛋白质，具有核定位信号和卷绕结构域（coiled domain）。通过van den Boom等人（van den Boom et al.,Int.J.Cancer119:2330-2338,2006）报道了，如与扩散的星形细胞瘤比较，降低了神经胶母细胞瘤中的DRR1基因表达，也表明了DRR1基因表达的下调在神经胶质瘤发展中的假设性作用。

需要脑癌入侵的抑制剂和需要神经胶质瘤的治疗的新治疗方法，以及需要DRR的抑制剂。

发明内容

此处，我们报道蛋白质的鉴定，“下调肾细胞癌”或“DRR”，作为脑癌治疗的新的治疗靶标。这里，我们显示，DRR是脑癌入侵的新调节剂。在体外和体内入侵试验中，DRR驱动MGC入侵，DRR与肌动蛋白和微管（MT）的相互作用是焦点粘连（FA）解体（去组装）和细胞入侵不可缺少的。此外，在正常的人类脑神经胶质中不表达DRR，但是在恶性的神经胶质瘤的入侵成分中高度地表达DRR，这表明恶性神经胶质瘤中的DRR表达和入侵之间的强烈的相关性。这些发现是新的和未预料到的，特别是考虑到识别DRR作为肿瘤抑制剂的角色的先前报道（Wang et al.,Genes Chromosomes&Cancer27:1-10,2000;van den Boom et al.,Int.J.Cancer119:2330-2338,2006）。

总之，我们的发现识别了DRR作为脑癌入侵的新调节剂和在神经胶质瘤的治疗中作为治疗干预的靶标。

因此，此处提供治疗神经胶质瘤的组合物和方法，包括可有效降低肿瘤细胞中DRR表达的核酸分子。本发明的核酸分子包含，例如，治疗RNAs或治疗寡核苷酸如反义寡核苷酸、反义RNAs、或编码反义寡核苷酸或反义RNAs的载体。

在实施例中，此处提供用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的方法，包括将包括SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的治疗性反义分子提供给肿瘤细胞，其中反义分子降低肿瘤细胞中的DRR的表达。

在另一个实施例中，提供用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的反义分子，包括SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物。

在还有的另一个实施例中，提供用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的方法，包括向肿瘤细胞提供DNA分子，其中所述DNA分子包括编码SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列或其片段或衍生物的序列，其适于降低肿瘤细胞中的DRR的表达。在某些实施例中，将DNA分子插入到适于治疗分子的生产的表达载体中，例如本发明的反义寡核苷酸或RNA。例如，表达载体可包括编码SEQ IDNO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的序列。

此处也提供了治疗癌症的方法，包括将此处描述的反义分子或编码它们的载体给予需要其的受试者。也提供了延迟癌症的发展的方法，其包括将此处描述的反义分子或编码它们的载体给予需要其的受试者。

在某些实施例中，可结合一种或多种选自由外科切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和基因疗法组成的组的癌症疗法使用此处描述的反义分子和/或载体。

在某些实施例中，肿瘤细胞是神经胶质瘤细胞（glioma cell），如恶性的神经胶质瘤细胞（malignant glioma cells）或神经胶母细胞瘤细胞（glioblatoma cells）。

在实施例中，提供了用于癌症的治疗的药物组合物，包括本发明的反义分子，或编码本发明的反义分子的载体，和药学上可接受的载体。在一个实施例中，癌症是神经胶质瘤，具体地是恶性的神经胶母细胞瘤。

在另一个实施例中，提供了包括本发明的药物组合物和其使用说明的试剂盒。此处提供的试剂盒可进一步包括用于同时地、单独地（分开地）或连续地（顺序地）给予受试者的适于治疗神经胶质瘤和/或适于延迟其发展的第二活性化合物。

本发明也提供用于增强用于神经胶质瘤治疗的癌症疗法的功效的方法，包括将本发明的反义分子或编码所述反义分子的载体给予需要其的受试者，和同时地、单独地或顺序地给予第二癌症疗法。例如，第二癌症疗法可以是外科切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和/或基因疗法。

此处进一步提供的是用于在需要其的受试者中抑制恶性神经胶质瘤细胞入侵的方法，包括向肿瘤细胞提供本发明的反义分子、或其片段或衍生物，其中反义分子降低肿瘤细胞中的DRR的表达。在实施例中，在受试者中，通过向肿瘤细胞提供包括编码SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16或其片段或衍生物的序列的DNA分子，抑制恶性神经胶质细胞入侵，其中DNA编码适于降低肿瘤细胞中的DRR的表达的反义分子。

在实施例中，提供用于诊断或预后受试者的神经胶质瘤的方法，包括在受试者的神经胶质瘤细胞中测量DRR表达，其中DRR表达指示细胞的入侵。在另一个实施例中，提供用于显现受试者中入侵的神经胶质瘤细胞的方法，包括使神经胶质瘤细胞与特异性地结合DRR蛋白质或mRNA的分子接触，和测量细胞中的DRR蛋白质或mRNA水平，其中表达DRR的细胞是入侵的（invasive，扩散的）。

在还有的另一个实施例中，提供了用于受试者中入侵的神经胶质瘤的诊断或预后的试剂盒，包括DRR RNA或蛋白质特异的可检测地标记的探针、用于检测探针与DRR RNA或蛋白质的结合的报告装置（reportermeans），和它的使用的说明。

在实施例中，提供了用于治疗癌症的方法，包括将治疗核酸，例如，反义分子，其降低DRR的表达，或编码所述治疗分子的载体给予需要其的受试者。在某些实施例中，延迟癌症的发展，抑制恶性细胞入侵，和/或抑制恶性神经胶质细胞入侵。在实施例中，癌症是神经胶质瘤，优选地是恶性神经胶质瘤，更优选地是神经胶母细胞瘤。在实施例中，降低DRR的表达的治疗的寡核苷酸与DRR mRNA、或其片段或衍生物互补或特异性地杂交。

应该理解，本发明不倾向于限于此处引用的具体的治疗核酸；更确切地，预期在本发明的组合物和方法中使用任何降低DRR表达的核酸。具体地，包含，与DRR区域互补，或特异性杂交的治疗寡核苷酸（例如，反义RNA、反义寡核苷酸、适配体（aptamers）或核酶（ribozyme）），例如，DRR mRNA的区域、片段、部分或衍生物，和其降低DRR的表达。此处也包括编码本发明的治疗性寡核苷酸的DNAs或载体。此处也包含，核酸适配体，其是采取通过蛋白质核酸相互作用识别（结合）DRR的独特的三维空间结构的序列。

附图说明

已经一般性描述了本发明的特性，现在将参考附图以示例方式示出其一个或多个实施例，其中：

图1显示DRR作为入侵调节剂的验证，其中：（A）功能遗传筛选试验的图示和概况；（B）显示混合的肿瘤球状体，其含有WT神经胶质细胞（细胞示踪剂（cytotracker）红色标签）和显示DRR^＋的高度入侵的DRR过度表达的细胞（DRR⁺，透明的）；实心环形划分WT细胞的入侵前部，和虚线环形划分DRR^＋细胞的入侵前部；（C）显示对照混合的肿瘤球状体，其显示相等的WT细胞示踪剂红色标记的细胞和WT未标记的细胞的入侵，证明细胞示踪剂红色标记不影响入侵；（D）显示入侵的定量分析；（E）显示WT-（红色条形）和DRR⁺-（空条形）细胞的最大入侵的量化；数据是平均±s.e.m.（每一个细胞系n＝14）；星号，p<0.001；（F）显示从DRR^-细胞产生的肿瘤球状体，其中环形划分入侵前部；（G）显示从WT细胞产生的肿瘤球状体，其中环形划分入侵前部；（H）显示（F）中的插图的高的放大倍率图像，显示DRR^-细胞具有圆形的细胞形状；（I）显示（G）中的插图（inset）的高放大倍率图像，显示WT细胞具有拉长的细胞形状；（J）显示比较DRR^-细胞和WT细胞的细胞入侵的量化；计算入侵大于400μm的细胞；数据是平均±s.e.m.（每一个细胞系n＝8）；星号，p<0.001；（K）显示DRR表达对细胞形状的影响的量化，显示DRR表达促进拉长的细胞形状；（L）显示植入到鼠脑中的DRR⁺细胞，显示拉长的细胞形状和侵入到胼胝体（cc）中的DRR^＋细胞，其中箭头形符号指示已经入侵胼胝体的MGC，箭头描绘肿瘤边界，插图中的箭头形符号指示肿瘤植入位点，标尺＝100μm；（M）显示植入到小鼠脑中的DRR^-细胞，显示圆形细胞形状和没有显示朝向胼胝体的证据，其中箭头描绘肿瘤边界和插入物中的箭头形符号指示肿瘤植入位点，标尺＝100μm；和（N）显示DRR⁺、WT、和DRR^-细胞的细胞增殖的量化。

图2显示DRR在神经细胞和人类神经胶质瘤中表达但是不在正常的神经胶质中表达。在低（A和B）和高（C和D）放大倍率下，正常的人类脑的DRR免疫标记显示，在皮层内发现DRR，但是在白质中没有发现DRR（wm）。神经胶质标记GFAP的表达不与DRR重叠（A-D）。DRR不在皮层的神经元分子层（ml）中表达（C）。高的放大倍率成像显示，DRR在神经细胞（E）中高度地表达但是不在白质中表达（F）。大鼠脑培养同样地显示，DRR表达与神经细胞中的神经细胞标记MAP2重叠（G-I），但是不与神经胶质中的神经胶质标记GFAP重叠（J-L）。在（M）中，评价每一个等级的八个恶性神经胶质瘤中的DRR表达。等级2和等级3神经胶质瘤（左边画面，顶部和底部）均一地表达高水平的DRR。相反，只有等级4神经胶质瘤的入侵外周肿瘤（PT）部分均一地表达DRR（右边画面，底部）。中心的肿瘤（CT）部分展示可变的DRR表达，5个阴性和3个肿瘤阳性（右边画面，顶部和中间）。H&E:苏木精和曙红，Ki-67：揭示中心肿瘤区域中的高水平的增殖的细胞分裂的标记。

图3显示，DRR与肌动蛋白细胞骨架联合和与LC2相互作用。（A）显示，转染的DRR沿着肌动蛋白应力纤维和焦点粘连定位。箭头指示在FA位点上的表达。利用毒伞素（phalloidin）标记肌动蛋白。非-肌动蛋白结合的DRR^△PEPE，和非-LC2结合的DRR^△HRE广泛地在细胞质中表达。它们不定位于肌动蛋白或FA。也可在细胞核中发现DRR^△HRE。（B）显示FLAG-DRR和MYC-LC2沿着肌动蛋白应力纤维、板状伪足（lamellipodia）和膜褶边（membrane ruffle）的共定位。（C）显示异源地表达的FLAG-DRR和来自神经胶质细胞的MYC-LC2的免疫共沉淀。MYC-LC2与FLAG-DRR发生免疫共沉淀，但是当保守的N-末端HRE序列，DRR^△HRE突变时，不与FLAG-DRR^△PEPE发生免疫共沉淀。

图4显示，DRR与肌动蛋白和LC2的联合是细胞入侵所需的。（A）在3D胶原质基质中，显示WT、DRR⁺、DRR^△PEPE和DRR^△HRE的3D入侵试验。（B）显示示意细胞入侵的球状体边缘的较近视图。星号指示DRR^△PEPE细胞中的球状体边缘。（C）在24、48、和72h之后，细胞入侵的定量分析。

图5显示，DRR促进焦点粘连动力学。利用GFP-桩蛋白（GFP-paxillin）转染DRR^＋和WT细胞，利用共聚焦录像显微镜以1分钟时间间隔成像170分钟。（A）显示利用GFP-桩蛋白转染的DRR⁺细胞。代表性的细胞显示动态的膜突出和FA装配和解体。箭头形符号指示强大的FA装配和解体的区域。框，b和c，代表在（B）和（C）中的高放大倍率区域。（D）显示利用DFP-桩蛋白转染的WT细胞。有代表性的细胞显示膜突出的缺失和稳定的FA。没有识别在成像时间间隔上装配或解体的FA。

图6显示，DRR促进焦点粘连解体。使DRR^-、DRR⁺（A）和DRR^ΔPEPE（B）缺乏（饥饿，starve）24小时，未处理或利用10μm诺考达唑（nocodazole）处理4h。然后将MT解聚剂洗涤指定的时间，以便洗掉。DRR表达促进FA解体，而DRR缺乏导致更稳定的FA。

图7显示，DRR组织肌动蛋白和微管细胞骨架。在固定之前，使DRR⁺（A）和DRR^-（B）细胞在FN（10μg/ml）上生长48小时。然后标记细胞的MT（绿色）、肌动蛋白（红色）和粘着斑蛋白（vinculin）（蓝色）。插图代表指出描绘的框的更高的放大图。箭头形符号指示，在DRR^＋细胞中MT靶向FA，然而，在DRR^-细胞中MT不能到达FA。标尺＝20μm。（C）总结DRR在细胞骨架组织和入侵中的作用的工作模型。我们提议，利用LC2、DRR担当肌动蛋白-MT交联剂。DRR将MT靶向FA，促进它们的解体、细胞后收缩、和细胞入侵。

图8显示，DRR^-和DRR⁺稳定细胞系中的DRR蛋白质表达。（A）显示，与野生型细胞比较，在DRR^＋细胞系中显示增加的DRR表达和在DRR^-细胞系中显示降低的DRR表达的蛋白质印迹。（B）显示，植入到小鼠脑中显示放大的细胞形状的和侵入胼胝体（cc）中的DRR⁺细胞。箭头形符号指示，MGC已经侵袭胼胝体。（C）显示，植入到小鼠脑中显示圆形的细胞形状的DRR^-细胞和没有显示向胼胝体入侵的证据。箭头描绘肿瘤边界。标尺（bar）＝100μm。

图9显示，DRR调节迁移的细胞的形态学。在2D迁移试验中评价迁移的DRR⁺、WT和DRR^-细胞的形态学。在10小时时间间隔上捕获的有代表性的图像显示，DRR⁺细胞沿长的薄突出延伸，而WT和DRR^-细胞利用宽的片层（lamella）迁移。

图10显示，人类皮层中的DRR表达。在（A）中，在高的放大倍率下的正常的人类脑皮层的DRR免疫标记显示，DRR不在神经细胞分子层中表达（ml）。在（B）中，邻近的部分GFAP免疫标记显示，星形胶质细胞（星形细胞）在DRR阴性的分子层中（箭头）出现。

图11显示，在多种神经胶质瘤细胞系中，DRR调节焦点粘连动力学和入侵。对照U343或U343-DRR-细胞（A）和对照C6或C6-DRR-细胞（B）共标记肌动蛋白（毒伞素）和FA（粘着斑蛋白）。对照细胞含有少量的FA而具有降低的DRR表达的细胞含有大量的FA。标尺＝20μm。在3D入侵试验中，U343（C）、C6（D）、和U87（E）神经胶质瘤细胞中降低的DRR表达导致入侵的显著减少。

图12显示，内源性DRR在恶性的神经胶质细胞中的定位。利用抗-DRR抗体免疫标记野生型U251细胞显示沿着肌动蛋白应力纤维、FA、膜褶边、和核中的定位。

图13显示跨物种DRR-肌动蛋白联合需要的区域内的氨基酸序列的比较。

图14显示，识别应力纤维定位需要的DRR区域的截短分析。将dsRed融合到DRR的全长和截短形式的C-末端上。在WT U251中表达DRR-dsRED融合蛋白，和检验应力纤维定位。这些数据显示，应力纤维定位需要氨基酸62-100和108-120。

图15显示，利用RNA干扰的DRR降低导致对焦点粘连动力学的特异性的靶向影响。（A）显示，靶向DRR的表达GFP-RNAi的U251细胞，（B）显示，如通过免疫标记DRR识别的（箭头形符号），DRR援救瞬时表达DRR的细胞，和在（C）中，通过免疫标记粘着斑蛋白显示FA。在DRR^-细胞中，可通过表达DRR援救DRR⁺FA显型（降低的FA大小和增加的FA数目）。

图16显示，DRR表达的降低抑制人类神经胶质瘤入侵。外科手术切除人类高等级的神经胶质瘤和立即将其放置在培养基中。在两周之后，利用对照GFP载体或DRR-RNAi（载体也含有GFP）转染它们。从这些细胞产生肿瘤球状体，和植入到胶原质基质中。在植入后1至14天，捕获明视野（上面的泳道）和荧光图像（下面的泳道）。非-转染的肿瘤（A）和对照GFP-转染的肿瘤（B）容易地侵袭，而DRR-RNAi转染的肿瘤（C）不能侵袭。（D）显示来自球状体边缘的入侵距离的量化，其中D指示天数，GFP是绿色荧光蛋白和GBM是神经胶母细胞瘤（高等级的神经胶质瘤）。

图17显示，不同的DRR反义寡核苷酸在降低DRR表达中的功效的比较。利用指出的DRR反义（反义4（SEQ ID NO:14）、反义5（SEQ IDNO:15）或反义6（SEQ ID NO:16））转染DRR⁺细胞；非靶向对照反义（Ctl反义）转染DRR^＋细胞；或剩下的未转染（未转染的）。在转染后72小时，裂解细胞和利用12%SDS-PAGE分析。利用抗-DRR抗体检测DRR表达水平。作为负载对照，包含微管蛋白的蛋白质印迹。

图18显示，当降低DRR表达时，肌动蛋白细胞骨架和焦点粘连的改变。利用非-靶向对照反义（ctl反义）、指出的DRR反义（反义G4（SEQID NO:14）、反义G5（SEQ ID NO:15）或反义G6（SEQ ID NO:16））转染DRR⁺细胞，或剩余的未转染（未转染的）。在72小时，固定细胞，复染色、和通过共聚焦显微镜方法分析，从而显现粘着斑蛋白（左列；绿色）和肌动蛋白（右列；红色）。

图19显示，利用体外划痕试验，检验在DRR表达的降低之后，DRR⁺细胞迁移的程度。未转染（CTL）DRR⁺细胞或利用非-靶向对照反义（Ctl反义）转染或利用指出的反义（反义G4（SEQ ID NO:14）、反义G5（SEQID NO:15）或反义G6（SEQ ID NO:16））转染DRR⁺细胞。（A）：在0、24小时和48小时捕获来自划痕的图像；（B）：显示细胞迁移的定量分析；DRRCTL1和DRRCTL2代表未转染的、DRR⁺对照。绿色条（顶部的条）：48小时；红色的条（中心的条）：24h；蓝色条（底部条）：0h。

图20显示，利用体外3D入侵试验，在DRR表达的降低之后进行DRR⁺细胞入侵的分析。未转染DRR＋细胞（CTL）或利用指出的反义G6（SEQ ID NO:16）转染DRR⁺细胞。（A）：在0、24、48、72和96小时捕获细胞入侵的图像；G6(球体#1)和G6b(球体#2)是两个利用反义G6处理的单独的肿瘤。（B）：显示入侵的定量分析，其中绿色条（每一对条的左手边的条）指示CTL（对照）和红色的条（每一对条的右手边的条）指示反义G6（SEQ ID NO:16）。

图21显示在DRR表达降低之后，人类神经胶母细胞瘤细胞中的肌动蛋白细胞骨架和焦点粘连的改变。利用脂质体2000（lipofectamine2000）试剂，以指出的反义（未转染的；Ctl反义；或反义G6（SEQ ID NO:16））转染GBM6细胞。在72小时，固定细胞，复染色，和通过共聚焦显微镜法分析，从而显现粘着斑蛋白（绿色；左列）和肌动蛋白（红色；右列）。

图22显示，利用体外划痕试验，检验在DRR表达降低之后，人类神经胶母细胞瘤细胞迁移的程度。利用指出的反义（反义G4（SEQ ID NO:14）、反义G5（SEQ ID NO:15）、或反义G6（SEQ ID NO:16）或非-靶向对照反义（CTL反义（反义G1/SEQ ID NO:11）））转染GBM6细胞。在0和24小时捕获划痕的图像。

具体实施方式

本发明涉及识别作为脑癌入侵的新调节剂的下调肾癌（此处称为DRR、DRR1或DRR-1），其在神经胶质瘤、特别是恶性神经胶母细胞瘤的治疗中，作为治疗干预的对象。具体地，此处提供用于抑制神经胶质瘤肿瘤细胞入侵和/或治疗神经胶质瘤的新型化合物、药物组合物和方法，包括降低神经胶质瘤肿瘤细胞中的DRR表达的分子。

因而，本发明提供化合物，具体地是，寡核苷酸和类似物质，用于调节编码DRR的核酸分子的功能或作用。在某些实施例中，通过提供特异性地与一种或多种编码DRR的核酸分子杂交的寡核苷酸完成这种调节。通常，将与它的靶核酸杂交的本发明的化合物统称为“反义”，因而，将DRR的抑制机制称为“反义抑制”。这样的反义抑制通常基于寡核苷酸链或片段的氢键结合类杂交，以便将靶RNA分子断裂、降解，或在其他况下使其不可操作。本发明与编码DRR或它的部分的靶向特异性核酸分子有关，如编码DRR的mRNA。

如此处应用的，“杂交”涉及寡聚化合物的互补链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及在互补的核苷或寡聚化合物链的核苷碱基之间的氢键结合，其可能是Watson-Crick、Hoogsteen或反转的Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成配对的互补的核苷碱基。可在多种环境下发生杂交。“互补的”如此处应用的，涉及在寡聚的化合物的两个核苷碱基之间精确的配对的能力。例如，如果在寡核苷酸（寡聚的化合物）的某位点上的核苷碱基，能够与靶核酸的某一位点上的核苷碱基形成氢键结合，所述靶核酸是DNA、RNA、或寡核苷酸分子，然后将寡核苷酸和靶核酸之间的氢键结合的位置认为是互补的位置。当通过可彼此氢结合的核苷碱基占据每一个分子中的足够数目的互补位置时，寡核苷酸和进一步的DNA、RNA、或寡核苷酸分子彼此互补。因而，“可特异性地杂交的”和“互补的”是用于在足够数目的核苷碱基上指示精确配对或互补的充分程度的术语，以便在寡核苷酸和靶核酸之间发生稳定的和特异性的结合。

当化合物与靶核酸结合，例如，DRR mRNA，干扰靶核酸的正常功能，从而引起活性的损失时，反义化合物是可特异性地杂交的，存在足够程度的互补，从而在期望特异性结合的条件下，例如，在体内试验或治疗处理的情况中的生理条件下，和在其中在体外试验的情况中进行试验的条件下，避免反义化合物与非-靶核酸序列的非-特异性的结合。

在本领域中应该理解，反义化合物的序列不需要与可特异性地杂交的它的靶核酸100%互补。此外，寡核苷酸可在一种或多种片段上杂交，以便干涉的或邻近的片段与杂交事件无关（例如，环形结构或发夹结构）。优选的是，本发明的反义化合物对于靶核酸内的靶区域包括至少70%的序列互补，更优选地是，它们对于靶核酸序列包括至少80%序列互补，至少85%序列互补，至少90%序列互补或至少95%序列互补。例如，其中反义化合物的20个核苷碱基中的18个与靶区域互补、因此将特异性地杂交的反义化合物，将表现90%的互补。在这个实例中，剩余的非互补的核苷碱基可与互补的核苷碱基簇集或互补的核苷碱基分散在剩余的非互补的核苷碱基之中，且不需要彼此邻近或者邻近互补的核苷碱基。同样地，在长度上具有4（四个）非互补的核苷碱基的18个核苷碱基的反义化合物将与靶核酸具有77.8%的总互补，因而将属于本发明的范畴，其中与靶核苷完全互补的两个区域侧接非互补的核苷碱基。可常规地利用本领域已知的BLAST程序（基本的局部比对搜寻工具）和PowerBLAST程序确定反义化合物与靶核酸的区域的百分比互补（Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Zhang and Madden,Genome Res.7:649-656,1997）。

在本发明中，短语“严格的杂交条件”或“严格的条件”涉及在其下，本发明的化合物将与它的靶序列杂交，但是与最小数目的其他序列杂交的条件。严格的条件是序列依赖的和在不同的环境中将是不同的，和在本发明的背景中，通过寡聚化合物的特性和成分和其中研究它们的试验确定在其下寡聚的化合物与靶序列杂交的“严格的条件”。杂交条件的非-限制性的实例是在含有50%甲酰胺、0.5%十二烷基硫酸钠和封闭试剂的6×SSC缓冲液中，在42℃进行16小时的杂交。然后在室温下，利用含有0.1%的SDS的1×SSC将膜洗涤两次，然后在室温下，利用含有0.1%的SDS的0.1×SSC洗涤，和最后在42℃，利用含有0.5%SDS的0.1×SSC洗涤。

反义药物一般是用化学方法修饰，从而设计良好药物性能的DNA或RNA的小片段（例如，12-21个核苷，或15-30个核苷）。反义药物在结合到（杂交到）靶RNA上和形成双链体之后起作用。这种双链或两股分子的形成，阻止RNA的正常机能和/或产生蛋白质。反义寡核苷酸通过许多可替换的机制，包括通过RNaseH募集破坏靶mRNA、干扰RNA加工或翻译、核输出、折叠或核糖体扫描，抑制mRNA翻译。一旦反义药物结合到它的靶RNA上，存在至少许多已知的可采用的反义机制。例如，治疗性分子可靶向非-编码的RNAs，如微小RNAs，其涉及细胞内的蛋白质生产的调节。微小RNAs是自然地存在的小RNA分子，其在细胞内部形成和似乎在控制过程中或基因表达的途径中具有重要的功能。几乎存在700个在人类基因组中已经识别的微小RNAs，认为这些微小RNA调节约三分之一的所有人类基因的表达。例如，其他反义药物可控制剪接，从而促进一个蛋白质对另一个的生产。

已知很多不同类型的反义寡核苷酸，其可用于本发明的组合物和方法。应该预期，任何已知的反义技术可用于靶向DRR和降低DRR表达，例如，将具有糖-修饰的核苷酸（例如，2’-O-修饰的核糖核苷或阿糖核苷（arabinonucleosides））和2’-脱氧核苷的交替片段的寡核苷酸，和/或具有糖-修饰的核苷酸和2’-脱氧核苷酸的交替片段的寡核苷酸，称为“altimers”和可用于反义寡核苷酸的制备。

例如，在PCT公开no.WO/2003/064441中描述altimers，因此其全部内容包括在此以供参考。在一个实施例中，本发明的治疗分子是包括含糖-修饰的核苷和2-脱氧核苷的交替片段的寡核苷酸的反义（分子），其中片段或单元各自独立地分别包括至少一个糖-修饰的核苷或2’-脱氧核苷。例如，寡核苷包括交替的第一和第二片段，其中第一片段包括至少一个糖-修饰的核苷，和其中第二片段包括至少一个2’-脱氧核苷。在实施例中，寡核苷包括至少2个每一个第一和第一片段，因此包括至少4个交替的片段。

在实施例中，寡核苷包括含磷酸酯的核苷间键合（internucleosidelinkage），因此是寡核苷酸。在实施例中，糖-修饰的核苷和/或2’-脱氧核苷包括磷酸酯，因此是糖-修饰的核苷和/或2’-脱氧核苷。因而在实施例中，本发明提供包括交替的阿拉伯糖核苷和2’-脱氧核苷的片段或单元的寡核苷酸，其中所述片段或单元每一个独立地分别包括至少一个阿拉伯糖核苷或2’-脱氧核苷。在实施例中，寡核苷包括至少2个阿拉伯糖核苷片段和至少2个2’-脱氧核苷片段，因此具有至少4个交替的单元。

在实施例中，糖-修饰的寡核苷能够采取DNA样构造。在实施例中，糖-修饰的核苷酸选自由阿糖核苷酸、α-L-锁定核酸（alpha-L-locked nucleicacids）、环己烯核酸、和缺乏带负电的2’-氧原子的核糖核苷酸组成的组。在实施例中，缺乏带负电的2’-氧原子的核糖核苷酸选自由2’-烷基-D-核糖和2’-SCH₃-D-核糖组成的组。

在实施例中，片段各自独立地包括约1至约6个阿糖核苷酸或2’-脱氧核苷酸。在进一步的实施例中，片段各自独立地包括约2至约5或约3至约4个阿糖核苷酸或2’-脱氧核苷酸。在进一步的实施例中，片段各自独立地包括约3个阿糖核苷酸或2’-脱氧核苷酸。

在实施例中，上述-提及的寡核苷具有选自由下列组成的组中的结构：

a）(A_x-D_y)n    I

b）(D_y-A_x)n    II

c）(A_x-D_y)m-A_x-D_y-A_x    III

d）(D_y-A_X)m-D_y-A_x-D_y    IV

其中每个m、x和y是大于或等于1的各自独立的整数，n是大于或等于2的整数，A是糖-修饰的核苷酸和D是2’-脱氧核糖核苷酸。

在实施例中，上述-提及的糖-修饰的核苷包括选自由氟、羟基、氨基、氰基、叠氮基、-CH=CH₂、-C=CH、烷基、功能化的烷基、烷氧基和功能化的烷氧基基团组成的组的2’取代基。在实施例中，烷基基团是低级的烷基基团。在实施例中，低级的烷基基团选自由甲基、乙基和丙基基团组成的组。在实施例中，功能化的（官能化的）烷基基团选自由甲氨基、乙氨基和丙氨基基团组成的组。在实施例中，烷氧基基团选自由甲氧基、乙氧基和丙氧基基团组成的组。在实施例中，功能化的烷氧基基团是-O(CH₂)q-R，其中q＝2、3或4和-R选自由-NH₂、-OCH₃和-OCH₂CH₃基团组成的组。

在实施例中，糖-修饰的核苷酸是阿糖核苷酸。在进一步的实施例中，2’取代基是氟和阿糖核苷酸是2’-氟阿糖核苷酸（2'F-ANA；也简称为“FANA”）。

在实施例中，本发明的反义寡核苷包括一种或多种选自由下列组成的组的核苷酸间键合：a）磷酸二酯；b）磷酸三脂；c）硫代磷酸酯；d）二硫代磷酸酯；e）Rp-硫代磷酸酯；f）Sp-硫代磷酸酯；g）硼烷膦酸酯（boranophosphate）；h）亚甲基（甲基亚氨基）（3'CH₂-N(CH₃)-O5'）；i）3'-硫甲缩醛（3'-thioformacetal）（3′S-CH₂-O5'）；j）酰胺（3'CH₂-C(O)NH-5'）；k）甲基磷酸酯；l）氨基磷酸酯（3-OP(O₂)-N5'）；和m）（a）至（l）的任何组合。

在实施例中，反义寡核苷酸由约30或更少的核苷酸组成，在进一步的实施例中，约8至约25个核苷酸，和在还有的进一步的实施例中，约18个核苷酸。在实施例中，反义寡核苷具有约12个核苷酸、约15个核苷酸、约18个核苷酸、约20个核苷酸、约25个核苷酸、或约30个核苷酸。在另一个实施例中，反义寡核苷的长度是从约12至约30个核苷酸。

在实施例中，反义寡核苷酸具有结构Ⅰ，其中x＝1，y＝2和n＝9，因此具有结构：A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D。在实施例中，反义寡核苷酸具有结构II，其中x＝1，y＝1和n＝9，因此具有结构：D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有结构III，其中x＝2，y＝2和m＝3，因此具有结构：A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有结构Ⅳ，其中x＝2，y＝2和m＝3，因此具有结构：D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有结构Ⅰ，其中x＝3，y＝3和n＝3，因此具有结构：A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有结构Ⅱ，其中x＝3，y＝3和n＝3，因此具有结构：D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A-D-D-D-A-A-A。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有结构Ⅲ，其中x＝4，y＝3和m＝1，因此具有结构：A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A-D-D-D-A-A-A-A。在实施例中，上述提及的寡核苷酸具有所述结构Ⅳ，其中x＝4，y＝3和m＝1，因此具有结构：D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D-A-A-A-D-D-D-D。

在实施例中，反义寡核苷酸进一步包括含修饰的核苷的第三片段，其中，所述第三片段邻近（a）所述交替的第一和第二片段的5’末端，（b）所述交替的第一和第二片段的3’末端，或（c）（a）和（b）两者。

在实施例中，反义寡核苷酸进一步包括含修饰的核苷酸的第三片段，其中，所述第三片段邻近（a）所述交替的第一和第二片段的5’末端，（b）所述交替的第一和第二片段的3’末端，或（c）（a）和（b）两者。在实施例中，修饰的核苷酸是修饰的核糖核苷酸。在实施例中，修饰的核糖核苷酸包括在它的2’位置上的修饰。在实施例中，2’修饰选自由甲氧基、甲氧基乙基、氟和丙氨基基团组成的组。

在实施例中，反义寡核苷酸是包含交替的阿糖核苷酸（ANA）的片段的altimer，如2’F-ANA（或FANA）和DNA。如此处应用的“阿糖核苷酸”涉及包含阿拉伯呋喃糖的核苷酸。

优选地，在反义分子中，对靶RNA（例如，DRR）存在足够程度的互补，以便在其中期望特异性结合的条件下，如在体内试验或治疗处理的情况下，或在体外试验的情况下的生理条件下，在其中引导试验的条件下，避免反义分子与非靶序列的非-特异性的结合。用于反义结合的靶RNA不仅可包含编码蛋白质的信息，而且也包含关联的核糖核苷酸，例如，其形成5’-非翻译区、3’-非翻译区，5’帽子区和内含子/外显子连接核糖核苷酸。

本发明的反义分子（寡核苷或寡核苷酸）可包含含有糖间骨架键合的那些，如磷酸三脂、甲基磷酸酯、3’-3硫甲缩醛、酰胺、短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂环糖间键合、硫代磷酸酯和具有CH₂-NH-O-CH₂、CH₂-N(CH₃)-O-CH₂（称为亚甲基（甲基亚氨基）或MMI骨架）、CH₂-O-N(CH₃)-CH₂、CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂、和O-N(CH₃)-CH₂-CH₂骨架（其中磷酸二酯是O-P(O)₂-O-CH₂）的那些。在可替换的实施例中，反义寡核苷酸可具有肽核酸（PNA，有时称为“蛋白质”或“肽”核酸）骨架，其中可以聚酰胺骨架取代寡核苷酸的磷酸二酯骨架，其中将核苷碱基直接地或间接地结合到聚酰胺骨架中的氮杂氮原子或亚甲基基团上（参考，例如，Nielsen et al.,Science,1991,254；1497and U.S.Pat.No.5,539,082）。可利用手性的和对映结构体特异的结构取代磷酸二酯键。

如上述提到的，寡核苷酸也可包含含有至少一个修饰的核苷酸碱基的物质。

因而，除了通常在自然界中发现的那些之外，可使用嘌呤和嘧啶。如上述提到的，糖-修饰的核苷酸片段的核苷酸（例如，ANA片段）可包括在它的五呋喃糖（pentofuranosyl）部分上的修饰。

这样的修饰的实例是2’-O-烷基-和2’-卤素-取代的核苷酸。在本发明中有用的糖分子的2’位置上的修饰的某些具体的实例是OH、SH、SCH₃、F、OCN、O(CH₂)n、NH₂或O(CH₂)nCH₃，其中n是从1至约10；C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF₃；OCF₃；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；’SOCH₃SO₂CH₃；ONO₂；NO₂；N₃；NH₂；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷氨基；聚烷氨基；取代的甲硅烷基；RNA断裂基团；报告基团；嵌入剂；用于改进寡核苷酸的药代动力学性能的基团；或用于改进寡核苷酸的药效性能的基团和具有相似的性能的其他取代基。可通过另外的糖、通过糖模拟物如环丁基或通过代替糖的另外的部分取代糖-修饰的核苷酸片段的核苷酸的一个或多个五呋喃糖基团。

“核苷”涉及与糖（例如，[脱氧]核糖、阿拉伯糖和衍生物）结合的碱基（例如，嘌呤[例如，A和G]或嘧啶[例如，C、5-甲基-C、T和U]）。“核苷酸”涉及具有连接到它的糖分子上的磷酸酯基团的核苷。在实施例中，这些结构可包含多种修饰，例如，在碱基、糖和/或磷酸酯部分中。“修饰的核苷酸/核苷”如用于此处涉及不同于且因而排除定义的天然形式的核苷酸/核苷。

“寡核苷酸”如用于此处涉及包括多个连接在一起的核苷酸的序列。寡核苷酸可包括在它的骨架结构中和/或在一种或多种它的组成核苷酸中的修饰的结构。在实施例中，本发明的寡核苷酸的长度是约1至200个碱基，在进一步的实施例中，是从约5至约50个碱基，从约8至约40个碱基，和在还有进一步的实施例中，长度是从约12至约25个碱基。

如通过本领域的技术人员理解的，术语“RNA”独特地用于涉及以核糖作为糖的核酸，然而，“寡核苷酸”是含有RNA、DNA、修饰的核苷、修饰的核苷酸、FANA，等等的广泛的术语。

在实施例中，本发明的治疗分子包括含“嵌合裂隙子”（“gapmer”）的反义寡核苷酸。例如，在PCT国际公开NO.WO/2002/20773中描述“嵌合裂隙子”，也被称为“嵌合反义”寡核苷酸，其全部内容包括在此以供参考。

例如，反义寡核苷酸可能是从侧接一系列可变长度的脱氧核糖核苷酸残基的阿糖核苷酸或修饰的阿糖核苷酸残基构造的嵌合体，其与它的靶RNA序列形成双链。这样合成的反义寡核苷酸/RNA双链是RNaseH的酶作用底物，识别这种双链和降解RNA靶部分的酶。RNaseβH介导的RNA靶分子的断裂被认为是反义寡核苷酸的主要作用机制。

在实施例中，治疗的寡核苷酸是反义杂合嵌合体，其是从2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核苷酸（FANA）构造的，其中所述阿糖核苷酸侧接从β-D-2’-脱氧核糖核苷酸（DNA）构造的定义的序列。在一个实施例中，寡核苷酸包括修饰的阿拉伯糖和2-脱氧糖的嵌合体。这样的寡核苷酸具有“[FANAWING]-[DNA GAP]-[FANA W1NG]”，或5'RO(FANA-p)x-(DNA-p)y-(FANA-p)z-(FANA)3'OH的一般的骨架成分，和更精确地具有一般的结构：

其中，x≥1，y≥1，和z≥0，和R选自由氢、硫代磷酸酯、和增强这样的寡核苷酸的细胞吸收的连接部分组成的组。

在本发明的另一个实施例中，反义寡核苷酸具有化学式：

其中x≥1，y≥1，和z≥0；R选自由氢、硫代磷酸酯、和增强这样的寡核苷酸的细胞吸收的连接部分组成的组；B选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞核嘧啶、次黄嘌呤核苷、和5-甲基胞核嘧啶组成的组；在核苷酸间磷酸酯键合上的Y选自由硫、氧、甲基、氨基、烷氨基、二烷氨基（具有1至约20个碳原子的烷基基团）、甲氧基、和乙氧基组成的组；在呋喃糖环上的X（位置4’）选自基团氧、硫、和亚甲基（CH₂）；和在糖环的2’位置上的Z选自由卤素（氟、氯、溴、碘）、烷基、烷基卤化物（例如，-CH₂F）、烯丙基、氨基、芳基、烷氧基、和叠氮基组成的组。

在本发明的另一个实施例中，反义寡核苷酸具有化学式：

其中x≥1，y≥1，和z≥0；R选自由氢、硫代磷酸酯、和增强这样的寡核苷酸的细胞吸收的连接部分组成的组；B选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞核嘧啶、次黄嘌呤核苷、和5-甲基胞核嘧啶组成的组。

依照本发明的另一个实施例，提供了靶向DRR的反义寡核苷酸，其具有化学式：

其中x≥1，y≥1，和z≥0；R选自由氢、硫代磷酸酯、和增强这样的寡核苷酸的细胞吸收的连接部分组成的组；B选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞核嘧啶、次黄嘌呤核苷、和5-甲基胞核嘧啶组成的组；在核苷酸间磷酸酯键合上的Y选自由硫、氧、甲基、氨基、烷氨基、二烷氨基（具有1至约20个碳原子的烷基基团）、甲氧基、和乙氧基组成的组；在呋喃糖环上的X（位置4’）选自基团氧、硫、和亚甲基（CH₂）；和在糖环的2’位置上的Z选自由卤素（氟、氯、溴、碘）、羟基、烷基、烷基卤化物（例如，-CH₂F）、烯丙基、氨基、芳基、烷氧基、和叠氮基组成的组。在具体的实施例中，R是硫代磷酸酯和反义寡核苷酸是硫代磷酸酯（phosphorothioate）。

在其他实施例中，将完全地由如在WO/1999/67378中描述的，FANA单元组成的反义寡核苷酸用于本发明的组合物和方法。例如，反义寡核苷酸可包括由如在国际PCT公开no.WO/1999/67378中描述的那些，P-D-阿糖核苷酸（即，ANA寡聚物）和2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核苷（即，2’F-ANA寡聚物）组成的糖-修饰的寡聚物。

在还有的其他实施例中，本发明的寡核苷酸可能是能够形成结合DRR的G-四分体或独特的3-维结构，和包括至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸的核酸配体（或“适配体”）。例如，阿拉伯糖修饰的核苷酸可能是2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。阿拉伯糖修饰的核苷酸可能在G-四分体的环中或可替换地在G-四分体的鸟嘌呤核苷残基中。

在实施例中，利用阿糖核苷酸完全地取代适配体。例如：5'-AAAAAAAAAAAAAAA-3′。在另一个实施例中，反义RNA是从2’-脱氧核糖核苷酸（DNA）和2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）构造的嵌合体。在本发明的另一个实施例中，本发明的反义RNA是具有糖-磷酸酯骨架成分的适配体，其中所述骨架成分选自阿拉伯糖和脱氧核糖核苷酸的任何组合。在具体的实施例中，阿拉伯糖核苷酸是2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。在本发明的其他实施例中，阿糖核苷酸包括选自由下列组成的组的2’取代基：氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基、烷氧基、和烷氧烷基基团。在本发明的进一步的实施例中，烷基基团选自由甲基、乙基、丙基、丁基、和功能化的烷基基团如乙氨基、丙氨基和丁氨基基团组成的组。在实施例中，烷氧基基团选自由甲氧基、乙氧基、丙氧基和功能化的烷氧基基团如-O(CH₂)q-R组成的组，其中q＝2-4和-R是-NH₂、-OCH₃、或-OCH₂CH₃基团。在实施例中，烷氧基烷基基团选自由甲氧乙基、和乙氧乙基组成的组。在实施例中，2’取代基是氟和阿糖核苷酸是2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。在一个实施例中，FANA核苷酸可能是araF-N（其中N＝U、T、C、G或A）。

在本发明的其他实施例中，本发明的寡核苷酸是包括一种或多种核苷酸间键合的适配体，其中核苷酸间键合选自由：a）磷酸二酯；b）磷酸三脂；c）硫代磷酸酯；d）甲基磷酸酯；e）硼烷磷酸酯；和f）（a）至（e）的任何组合组成的组。

在还有的其他实施例中，将寡核苷酸如在PCT国际公开no.WO/2007/038869中描述的那些用于本发明的组合物和方法。这样的寡核苷酸可能是能够形成结合DRR的G-四分体或其他的独特三维结构，和包括至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸的核酸配体（或“适配体”）。在实施例中，阿拉伯糖修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。

在实施例中，在适配体中的任何位置上，适配体可具有许多阿糖核苷酸，例如：

5'-ADADADADADADADA-3'；5'-AADADDADDDAADAD-3'；

5'-AAAADAAADADDDAD-3'；等等，

其中A是阿糖核苷酸和D是2’-脱氧核糖核苷酸。

在本发明的其他实施例中，利用阿糖核苷酸完全地取代适配体。例如：5'-AAAAAAAAAAAAAAA-3'。

在本发明的其他实施例中，提供从能够选择性地结合DRR的2’-脱氧核糖核苷酸（DNA）和2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）构造的嵌合体。

在其他实施例中，本发明的寡核苷酸是具有糖-磷酸酯骨架成分的任一序列的适配体，其中所述骨架成分选自阿拉伯糖和脱氧核糖核苷酸的任何组合。阿拉伯糖核苷酸可能是2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。

在本发明的其他实施例中，阿糖核苷酸包括选自由氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基、烷氧基、和烷氧烷基基团组成的组的2’取代基。在本发明的进一步的实施例中，烷基基团选自由甲基、乙基、丙基、丁基、和功能化的烷基基团如乙氨基、丙氨基和丁氨基基团组成的组。在实施例中，烷氧基基团选自由甲氧基、乙氧基、丙氧基和功能化的烷氧基基团如-O(CH₂)q-R，组成的组，其中q＝2-4和-R是-NH₂、-OCH₃、或-OCH₂CH₃基团。在实施例中，烷氧基烷基基团选自由甲氧乙基、和乙氧乙基组成的组。在实施例中，2’取代基是氟和阿糖核苷酸是2’-氟阿糖核苷酸（FANA）。在实施例中，FANA核苷酸是araF-G、araF-T、araF-C、araF-A或araF-U。

在本发明的其他实施例中，适配体包括一种或多种核苷酸间键合，其选自由：a）磷酸二酯；b）磷酸三酯；c）硫代磷酸酯；d）甲基磷酸酯；e）硼烷磷酸酯；和f）（a）至（e）的任何组合组成的组。

在另一个实施例中，优选地在形成G-四分体的适配体的环中，或结合DRR的独特的三维结构中，利用阿拉伯糖修饰的核苷酸，优选地2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA）取代具有适配体的至少一个核苷酸的适配体。

在其他实施例中，可将反义寡核苷酸如在WO/2003/037909中描述的那些用于本发明的方法和组合物。简单地说，这样的寡核苷酸具有结构：[R¹-XJ_a-R²]a

其中a大于或等于1；其中R¹和R²的每一个独立地是至少一个核苷酸；和其中X是脂肪族的连接子。在实施例中，寡核苷酸包括至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸，例如，R¹、R²或两者都可包括至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸。在实施例中，修饰的脱氧核糖核苷酸选自由ANA、PS-ANA、PS-DNA、RNA-DNA和DNA-RNA嵌合体、PS-[RNA-DNA]和PS-[DNA-RNA]嵌合体、PS-[ANA-DNA]和PS-[DNA-ANA]嵌合体、RNA、PS-RNA、PDE-或PS-RNAl类似物、锁定核酸（locked nucleic acids）（LNA）、磷酸二酰胺吗啉核酸、N3'-P5'氨基磷酸酯DNA、环己烯核酸、α-L-LNA、硼烷磷酸酯DNA、甲基磷酸酯DNA、和它们的组合组成的组。在实施例中，ANA是FANA（例如，PDE-或PS-FANA）。

在实施例中，上述提及的PDE-或PS-RNA类似物选自由2’-修饰的RNA组成的基团，其中2’-取代基选自由烷基、烷氧基、烷基烷氧基、F和其组合组成的组。在实施例中，脂肪族连接子选自由脂肪族的核苷和非-核苷酸连接子组成的组。在实施例中，脂肪族核苷酸选自由嘌呤和嘧啶无环核苷类似物（seconucleosides）组成的组。在实施例中，嘌呤无环核苷类似物选自由无环腺苷和无环鸟苷组成的组。在实施例中，嘧啶无环核苷类似物选自由无环嘧啶、无环胞嘧啶和无环尿嘧啶组成的组。在实施例中，非-核苷酸连接子包括选自由氨基酸和氨基酸衍生物组成的组的连接子。在实施例中，氨基酸衍生物选自由（a）N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元，其中通过亚甲基羰基连接子（PNA单体）连接杂环碱基；和（b）O-PNA单元组成的组。

依照本发明的进一步的方面，提供了一般结构Ib的反义寡核苷酸嵌合体：

其中n大于或等于1。关于上述的结构Ib，“AON1”是寡核苷酸链，在实施例中，其选自由ANA（例如，FANA）、DNA、PS-DNA、5’-RNA-DNA-3’嵌合体，以及其他RNaseH-适当的寡核苷酸（competentoligocleotide），例如阿糖核酸（2’-OH取代的ANA）（Damha,M.J.et al.J.Am.Chem.Soc.1998,120,12976）、环己烯核酸（Wang J.et al.J.Am.Chem.Soc.2000,122,8595）、硼烷磷酸酯连接的DNA（Rait,V.K.et al.Antisense Nucleic Acid Drug Dev.1999,9,53）、和α-L-锁定核酸（Sorensen,M.D.et al.J.Am.Chem.Soc.2002,124,2164）或其组合组成的组；和“AON2”是寡核苷酸链，在实施例中，其选自由FANA、DNA、PS-DNA、5'-DNA-RNA-3'嵌合体，以及其他RNase H-适当的寡核苷酸如上述描述的那些，或其组合组成的组。AON1和AON2的核苷酸间键合包括但不一定限于磷酸二酯、磷酸三脂、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、和/或氨基磷酸酯（5'N-3′P和5'P-3'N）基团。在ANA-X-ANA嵌合体构造中，直接地连接到阿拉伯糖的C2’-原子上的取代基包括但不限于氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基（例如，2’-甲基、乙基、丙基、丁基，等等）、和烷氧基基团（例如，2'-OMe、2'-OEt、2'-OPr、2'-OBu、2'-OCH₂CH₂OMe，等等）。

在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸具有结构：

其中m、n、q和a的每一个独立地是大于或等于1的整数；其中R¹和R²的每一个独立地是至少一个核苷酸，其中，Z¹和Z²的每一个独立地选自由氧原子、硫原子、氨基基团和烷氨基基团组成的组；其中Y¹和Y²的每一个独立地选自由氧、硫和NH组成的组；和其中R³选自由H、烷基、羟烷基、烷氧基、嘌呤、嘧啶和其组合组成的组。在实施例中，R³是腺嘌呤或鸟嘌呤，或它的衍生物。在实施例中，R³是胸腺嘧啶、胞核嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、或它的衍生物。在实施例中，上述指出的R¹和R²的每一个独立地选自由ANA、PS-ANA、PS-DNA、RNA-DNA和DNA-RNA嵌合体、PS-[RNA-DNA]和PS-[DNA-RNA]嵌合体、PS-[ANA-DNA]和PS-[DNA-ANA]嵌合体、α-L-LNA、环己烯核酸、RNA、PS-RNA、PDE-或PS-RNA类似物、锁定核酸（LNA）、磷酸二酰胺吗啉核酸、N3'-P5'氨基磷酸酯DNA、甲基磷酸酯DNA、和其组合组成的组。

在实施例中，上述指出的R¹和R²的每一个独立地可包括至少两个通过核苷酸间键合连接的核苷酸，其中所述核苷酸间键合选自由磷酸二酯、磷酸三脂、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯（5'N-3'P和5'P-3′N）基团和其组合组成的组。在其他实施例中，上述指出的R¹和R²的每一个独立地包括ANA。在实施例中，上述指出的ANA包括选自由氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基（例如，甲基、乙基、丙基和丁基）和烷氧基（例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、和甲氧乙氧基）基团组成的组的2’-取代基。在实施例中，2’-取代基是氟和所述ANA是FANA。在实施例中，烷基基团选自由甲基、乙基、丙基和丁基基团组成的组。在实施例中，烷氧基基团选自由甲氧基、乙氧基、丙氧基、和甲氧乙氧基基团组成的组。

在其他实施例中，靶向DRR的本发明的反义寡核苷酸选自由下列组成的组：

其中，R¹、R²、n、a、Z¹、Z²、Y¹和Y²与上述定义的一样和R⁴和R⁵的每一个独立地选自由嘌呤（例如，腺嘌呤和鸟嘌呤或它的衍生物）和嘧啶（例如，胸腺嘧啶、胞核嘧啶、尿嘧啶、或它的衍生物）组成的组。在实施例中，R¹和R²是PDE-FANA；和a＝1。在实施例中，R¹和R²是PS-FANA；和a＝1。在实施例中，R¹是[FANA-DNA]；R²是[DNA-FANA]；和a＝1。在实施例中，R¹是[FANA-DNA]；R²是FANA；和a＝1。在实施例中，R¹是FANA；R²是[DNA-FANA]；和a＝1。在实施例中，R¹和R²是PS-DNA；和a＝1。在实施例中，R¹是PDE-[RNA-DNA]；R²是PDE-[DNA-RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是RNA；R²是[DNA-RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是S-[(2'O-烷基)RNA-DNA]；R²是S-[DNA-(2O-烷基)RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是S-[(2'O-烷基)RNA-DNA]；R²是S-[(2'O-烷基)RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是S-[(2’O-烷氧基烷基)RNA-DNA]；R²是S-[DNA-(2'O-烷氧烷基)RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是S-[(2'O-烷氧基烷基)RNA-DNA]；R²是S-[(2'O-烷氧基烷基)RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是S-[(2'O-烷氧基烷基)RNA]；R²是S-[DNA-(2'O-烷氧基烷基)RNA]；和a＝1。在实施例中，R¹是PDE-[(2'O-烷基-RNA)-DNA]；R²是PDE-[DNA-(2'O-烷基RNA)]；和a＝1。在实施例中，R¹是PS-[(2'O-烷基-RNA)-DNA]；R²是PS-[DNA-(2'O-烷基RNA)]；和a＝1。在实施例中，R¹是PDE-[(2'O-烷氧基烷基-RNA)-DNA]；和R²是PDE-[DNA-(2'O-烷氧基烷基RNA)]；和a＝1。

在实施例中，R¹是PS-[(2'O-烷氧基烷基-RNA)-DNA]；R²是PS-[DNA-(2'O-烷氧基烷基RNA)]；和a＝1。在实施例中，R¹和R²是PDE-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫，和n＝4。在实施例中，R¹是PS-[FANA]；R²是PDE-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫，和n＝4。在实施例中，R¹是FANA；R²是PS-FANA；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中Y¹、Y²、Z¹和Z²是氧和n＝4。在实施例中，R¹和R²是PS-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫；和n＝4。在实施例中，R¹是PS-[DNA]；R²是PDE-[DNA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫，和n＝4。在实施例中，R¹是PDE-[DNA]；R²是PS-[DNA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫；和n＝4。在实施例中，R¹和R²是PS-[DNA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫，和n＝4。在实施例中，R¹和R²是PDE-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lie，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫。在实施例中，R¹是PS-[FANA]；R²是PDE-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lie，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫。在实施例中，R¹是PDE-[FANA]；R²是PS-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lib，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫，和n＝4。

在实施例中，R¹和R²是PS-[FANA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lie，其中Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫。在实施例中，R¹是PS-[DNA]；R²是PDE-[DNA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lie，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫。在实施例中，R¹是DNA；R²是PS-DNA；a＝1；和寡核苷酸具有结构He。在实施例中，R¹和R²是PS-[DNA]；a＝1；和寡核苷酸具有结构lie，其中，Y¹、Y²是氧；Z¹、Z²都是氧或硫。在实施例中，a＝2和每一个R¹和R²独立地由至少3个核苷酸组成，在进一步的实施例中，由3-8个核苷酸组成。在实施例中，a=3和每一个R¹和R²独立地由至少2个核苷酸组成，在进一步的实施例中，其中每一个R¹和R²独立地由2-6个核苷酸组成。在实施例中，寡核苷酸是对于靶RNA的反义寡核苷酸。

在本文中，术语“治疗分子”涉及用于降低或抑制DRR表达的核酸分子。例如，治疗性分子可能是治疗寡核苷酸或治疗RNA。治疗分子的非-限制性实例包含反义RNAs、反义寡核苷酸、适配体、核酶和其他如本领域已知的降低靶RNA表达的核酸分子。在实施例中，靶RNA是DRRmRNA或其片段或部分。此处，治疗分子也被称为“治疗核酸分子”和可交换地使用术语。在某些实施例中，治疗分子或寡核苷酸包含特异性地与一种或多种编码DRR的核酸分子或它的部分或片段杂交的寡核苷酸。在其他实施例中，包含含有SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的寡核苷酸。

在实施例中，本发明的治疗分子，例如，治疗RNA或治疗寡核苷酸是与DRR mRNA的片段或部分互补的或特异性杂交的寡核苷酸。治疗分子互补的或特异性地杂交的DRR mRNA的片段或部分的非-限制性的实例包含下列：DRR mRNA的核苷酸170-190；DRR mRNA的核苷酸175-195；DRR mRNA的核苷酸180-200；DRR mRNA的核苷酸185-205；DRR mRNA的核苷酸190-210；DRR mRNA的核苷酸195-215；DRR mRNA的核苷酸200-220；DRR mRNA的核苷酸205-225；DRR mRNA的核苷酸210-230；DRR mRNA的核苷酸215-235；DRR mRNA的核苷酸220-240；DRR mRNA的核苷酸225-245；DRR mRNA的核苷酸230-250；DRR mRNA的核苷酸235-255；DRR mRNA的核苷酸240-260；DRR mRNA的核苷酸245-265；DRR mRNA的核苷酸250-270；DRR mRNA的核苷酸255-275；DRR mRNA的核苷酸260-280；DRR mRNA的核苷酸265-285；DRR mRNA的核苷酸270-290；DRR mRNA的核苷酸275-295；DRR mRNA的核苷酸280-300；DRR mRNA的核苷酸285-305；DRR mRNA的核苷酸290-310；DRR mRNA的核苷酸295-315；DRR mRNA的核苷酸300-320；DRR mRNA的核苷酸305-325；DRR mRNA的核苷酸310-330；DRR mRNA的核苷酸315-335；DRR mRNA的核苷酸320-340；DRR mRNA的核苷酸325-345；DRR mRNA的核苷酸330-350；DRR mRNA的核苷酸335-355；DRR mRNA的核苷酸340-360；DRR mRNA的核苷酸345-365；DRR mRNA的核苷酸350-370；DRR mRNA的核苷酸355-375；DRR mRNA的核苷酸360-380；DRR mRNA的核苷酸365-385；DRR mRNA的核苷酸370-390；DRR mRNA的核苷酸375-395；DRR mRNA的核苷酸380-400；或其片段、部分或衍生物。

在其他实施例中，治疗核酸分子具有与DRR mRNA的核苷酸425至439互补的或特异性地交杂的序列，或与DRR mRNA的核苷酸420至444互补的或特异性地交杂的，或与DRR mRNA的核苷酸415至439互补的或特异性地交杂的，或与DRR mRNA的核苷酸424至439互补的或特异性地交杂的，与DRR mRNA的423至439，422至439，421至439，或420至439，或420至434互补的或特异性地杂交的序列；或其片段、部分或衍生物。

应该理解，也包含在末端上与另外的1至3个核苷酸杂交的核酸，或与更小的片段杂交的核酸或与引用的序列和区域的衍生物杂交的核酸。另外，核酸序列可包含治疗分子的功能需要的额外的核苷酸。

在还有的其他实施例中，本发明的治疗分子是反义寡核苷酸，其具有altimer、嵌合裂隙子的结构，和/或包括一种或多种修饰的核苷酸如2’-脱氧-2’-氟阿糖核苷酸（FANA），或是如此处描述的适配体。

核酸分子和表达构建体

在一个方面中，本发明涉及核酸序列（例如，治疗核酸分子，例如，反义寡核苷酸、编码治疗核酸分子的DNA，或生产治疗核酸分子的载体），在制备适于降低肿瘤细胞如神经胶质瘤细胞中的靶基因如DRR的表达的反义分子的应用。

如此处应用的，术语“降低靶基因的表达”涉及本发明治疗分子或治疗寡核苷酸，例如，反义或其他治疗分子（例如，适配体）以特异性和转录后方式抑制靶基因表达的能力。

在一个实施例中，本发明涉及RNA序列或寡核苷酸序列制备如此处定义的治疗分子的应用。在实施例中，通过一种或多种下列标准表征治疗分子，和在一个实施例中，通过所有的下列标准表征治疗分子：与靶mRNA具有至少50%序列同一性、或至少70%序列同一性、或至少80%序列同一性、或至少90%序列同一性；具有靶向靶基因的外显子区域的序列；和/或显示靶向靶基因的3’末端而不是靶向靶基因的5’末端的性能。在某些实施例中，靶基因是DRR或编码DRR的基因的片段。

在进一步的实施例中，可进一步通过一种或多种下列标准，或通过所有的下列标准表征治疗分子：具有在15至25个核苷酸之间，或在18至22个核苷酸之间，或19个核苷酸，或在19至33个核苷酸之间，21至31个核苷酸，或29个核苷酸；或13至17个核苷酸的核酸长度，具有30和50%之间的含量的GC含量；显示在它的3’末端上的TT（T）序列；显示当采用双链形式时没有二级结构；具有低于20°C的Tm（熔融温度）；或具有在SEQ ID NO:1、2、5-10或14-16中指出的核苷酸（在表1中给出核苷酸序列；“nt”代表核苷酸）。在实施例中，治疗分子具有15个核苷酸的核酸长度。

在另一个实施例中，治疗分子或寡核苷酸包括与具有改进治疗核酸的功能所必需的另外的核苷酸的DRR mRNA互补的核苷酸。在还有的另一个实施例中，治疗核酸分子具有SEQ ID NO:1或2的序列。在另一个实施例中，治疗核酸分子具有与DRR mRNA的核苷酸425至439互补的或特异性地杂交的序列，或与DRR mRNA的核苷酸420至444或其片段或衍生物互补的或特异性地杂交的，或与DRR mRNA的核苷酸415至439或其片段或衍生物互补的或特异性地杂交的，或与DRR mRNA的核苷酸424至439，DRR mRNA的423至439，422至439，421至439，或420至439，或420至434互补的或特异性地杂交的序列。应该理解，也包含在末端上与另外的1至3个核苷酸杂交的核酸，或与引用的序列的更小的片段或衍生物杂交的核酸。另外，核酸序列可包含治疗分子的功能所需要的额外的核苷酸。

在实施例中，本发明的治疗分子或寡核苷酸包括此处提供的序列，例如，SEQ ID NO:1、2、5-10或14-16。在另一个实施例中，本发明的治疗分子或寡核苷酸由此处提供的序列组成，例如，SEQ ID NO:1、2、5-10或14-16组成。

在另一个实施例中，本发明的治疗分子或寡核苷酸具有SEQ ID NO:14、15或16的序列。

表1典型的核酸序列

^a以粗体显示核苷酸和加下划线的是FANA核苷酸；其他核苷酸是DNA；“-”指示硫代磷酸酯（PS）键合。

在另一个实施例中，本发明涉及含有任何下列序列：SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16、或其片段或衍生物的核酸序列，制备适于降低神经胶质瘤细胞中的DRR的表达的治疗分子，例如，反义寡核苷酸的应用。

在本发明的背景中，假如不破坏或抑制所得分子的功能，即靶基因的下调，术语“片段”和“衍生物”涉及与原始核酸的不同在于它们在5’或3’末端任一个上，或在两个末端或内部地延伸或缩短，或在一个末端延伸，在另一个末端缩短的核酸。假如不破坏或抑制合成的分子的功能，术语“片段”和“衍生物”涉及与原始核酸的不同在于通过其他核苷酸取代和/或通过技术人员可用的方法（以化学方法）修饰原始序列的一种或多种核苷酸。“片段”和“衍生物”对原始核酸一般可显示至少80%，例如，至少85%、至少90%、至少95%或甚至至少99%的序列同一性。可通过比对所述序列，和确定在含有相同的核酸碱基的两个序列上的比对中的位置的数目VS.比对中的位置的总数目，计算两个核苷酸序列之间的序列同一性。

应该理解，包含保留降低或减少DRR表达的能力的表1中的核酸序列的片段和衍生物。例如，包含含有来自表1中给出的序列的约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18或约19个邻近的核苷酸和保留降低/减少DRR表达的能力的核酸序列。

本领域的技术人员应该清楚，任何上述给出的序列或它的互补序列可用于制备治疗分子，例如，反义寡核苷酸，例如双链的RNA分子。当提供上述公开的核酸，具体地RNAs时，本领域的技术人员知道如何制备反义寡核苷酸。简要地，可通过任何可用的方法，且如需要的，在适当的条件下，使链退火合成需要的核酸。可依照各自的核酸序列调整退火的条件，例如，温度和孵育时期。

在具体的实施例中，本发明涉及含有SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的核酸序列制备治疗分子，如反义寡核苷酸的应用。

在另一个实施例中，本发明涉及含有SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的RNA序列制备反义分子的应用。

为了发挥期望的功能，例如，降低神经胶质瘤细胞中的DRR的表达，将从如上述定义的本发明的核糖核酸制备依照本发明的治疗分子（反义寡核苷酸、反义RNAs、适配体、核酶等等），将其递送给靶细胞，优选人类GBM细胞。

存在几种已知的将（核糖）核酸引入动物细胞的方法，它们中任何一种可用于本发明且取决于宿主。最简单的，可直接地将核酸注射到靶细胞/靶组织中。其他方法包含受体细胞与含有核酸的细菌原生质体融合，使用组分如氯化钙、氯化铷、氯化锂、磷酸钙、DEAE葡聚糖、阳离子脂质或脂质体或诸如受体介导的内吞作用的方法、生物溶解颗粒导弹方法（biolistic particle bombardment）（“基因枪”方法）、利用病毒载体的感染、电穿孔（electroporation），等等。适于递送治疗分子的其他技术或方法是本领域已知的。也可使用稳定的分子的增强对流输注化疗（Convection-enhanced delivery）（如依据Kawakami et al.,J Neurosurg101:1004-1011,2004描述的）。另外的可能性是可移植的药物释放生物可降解的微球体的应用，如依据Menei and Benoit,Acta Neurochir88:51-55,2003参考的那些。应该清楚，也可使用不同的上述-提及的递送模式或方法的组合。另一个途径是使用递送核酸分子的奥马耶贮器（Ommayareservoir）（微泵）与在生物可降解的微球体中囊封的核酸分子，或同时使用两种途径。

利用治疗分子，如反义技术，完成体内基因沉默的主要的障碍是递送。为了改进热稳定性、耐核酸酶消化性和增强核酸的细胞吸收，已经在本领域中检验了多种途径。这些包含化学修饰如锁定核酸、硫代磷酸酯取代、2’-氟取代、2-O-甲基取代、在多种类型的脂质体中的核酸分子的囊封（免疫脂质体、PEG化的（免疫）脂质体）、阳离子脂质和聚合物、纳米粒子或枝状分子（dendrimer）、聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物微球体、可移植的药物-释放生物可降解微球体、核酸分子与保护剂的共注射，等等。应该理解，这些方法和本领域已知的其他方法可用于本发明的方法。

在一个方面中，在肿瘤，例如，初级肿瘤（原发）和/或转移的肿瘤的位点上递送本发明的核酸分子，可选地稳定的、囊封的或如上述另外修饰的核酸分子。完成局部化的递送的方式是如在别处描述的奥马耶贮器的应用。将本发明的核酸分子靶向肿瘤细胞的另外的方式是使用抗体-导向的、细胞类型-特定的递送。例如，可将某些核酸与特异性识别肿瘤细胞的Fab复合，如Fab-鱼精蛋白-复合体（Song et al.,Nat Biotechnol23:709-717,2005），或可使某些核酸在免疫脂质体中囊封。可通过多种方法，如系统给予（静脉注射、皮下注射、肌肉注射、口服给药、鼻吸入，等等）或局部地，例如，利用奥马耶贮器，给予这样的抗体-靶向的核酸分子，例如，以纳米粒子的形式。具体地，可在久远的日期或在外科手术时使用具有注射剂的对流输注。也可采用本发明的核酸分子的吸入式给药，例如，以鼻喷雾或气雾剂混合物的形式。另外的选项是用于递送的纳米技术的应用。

已经描述了核酸分子的体内递送，例如，裸的或脂质囊封的核酸分子的静脉内的、脑室内的（intracerebroventricular）或鼻内的给药。也已经描述了在免疫脂质体中或在病毒粒子中囊封的载体的静脉内给药，或所述静脉内给药是本领域已知的。

当如上述描述的，直接地将分子应用于细胞时，治疗核酸分子的作用，例如，靶基因的表达的降低，可能只是短暂的。在某些情形中，如果将编码各自的核酸分子的核酸并入表达载体中，这可能是有利的。如下文描述的，提供适当的元件，将DNA转录成相应的能够形成期望的反义分子的RNA。

因而，依照本发明的进一步的方面，提供促进引入到宿主细胞和/或促进编码依照本发明的治疗分子的核苷酸序列的表达和/或促进它的维持的表达构建体。可将表达构建体插入到可能是商业上可用的质粒、病毒、或载体中。在另一个实施例中，因此，本发明涉及利用DNA序列制备如此处定义的RNA分子的应用。例如，DNA序列可包括与在SEQ ID NO:1、2、5、6、7、8、9、10、14、15或16中描述的RNA序列对应的或编码所述RNA序列的DNA序列，连接子，和与DNA互补的序列。优选地，连接子的长度是4至15个核苷酸，更优选地，连接子是4至10个核苷酸长，和最优选地，它是4至8个核苷酸长。连接子可由任何适当的核苷酸序列组成。在一个实施例中，DNA序列由来源于通过4至15个核苷酸连接子分开的DRR基因的15nt序列组成，来源于相同的15nt序列的相反互补的序列组成，和显示它的3’末端上的tt（t）序列。在另一个实施例中，将DNA序列插入到适于用于此处提供的方法的表达载体中。

例如，能够引起形成如此处定义的治疗核酸的转录的表达载体可能是克隆载体、二元载体或整合载体。因而，本发明也涉及包含任何此处描述的DNA序列的载体。优选地，表达载体是真核表达载体、或逆转录病毒载体、质粒、噬菌体、或一般在生物技术领域中使用的任何其他载体。这样的载体是本领域的技术人员已知的。如果必需或期望，可操作地将DNA核酸连接到指导真核细胞中mRNA合成的调控元件上。

为了驱动RNA的表达，这些载体通常含有RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ、RNA聚合酶Ⅲ、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶和优选地RNA聚合酶Ⅲ启动子，如H1或U6启动子，因为在哺乳动物细胞中，RNA聚合酶Ⅲ表达相对大量的小RNAs和在并入一系列3-6个尿嘧啶核苷后终止转录。类型Ⅲ启动子完全地位于被转录的序列的上游，从而消除治疗分子中包含启动子序列的任何需要。可选地，也可将一种或多种转录终止序列并入表达载体中。术语“转录终止序列”包括在转录单元的末端上的控制序列，其发出初级转录的3’加工和聚腺苷酸化和转录的终止的信号。可将另外的调控元件，如转录或翻译增强子并入表达构建体中。

为了治疗的目的，在某些情形中，已经证明了逆转录病毒载体的应用最适于将期望的核酸递送给靶细胞。应该理解，逆转录病毒载体或腺病毒载体，它们中的很多是本领域已知的，也可用于此处提供的载体、组合物和方法。也应该理解，可通过上述描述的任何递送方法或本领域已知的其他方法，将含有本发明的DNA序列的表达载体引入到靶细胞中。

应用、组合物和试剂盒

依照本发明，可将治疗分子和/或载体用作用于治疗癌症，优选地神经胶质瘤，更优选地神经胶母细胞瘤的药物，或用于制造用于治疗癌症，优选地神经胶质瘤，更优选地神经胶母细胞瘤的药物。依照本发明，也可将治疗分子和/或载体用作用于延迟癌症的发展的药物，例如，神经胶质瘤，如神经胶母细胞瘤。术语“延迟癌症的发展”如用于此处，涉及使癌症再生长延迟超过30%、或超过50%、或超过70%，和/或增加受侵袭的受试者的存活时间。在实施例中，依照本发明，治疗分子和/或载体可用于抑制脑癌入侵，例如，恶性神经胶质细胞（MGC）入侵。

依照本发明，可单独使用或结合其他癌症疗法使用治疗分子和/或载体。其他癌症疗法的非-限制性的实例包含癌症的切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和/或基于基因的疗法。术语“切除术”涉及部分或所有的肿瘤的手术上的清除或切除。术语“放射疗法”涉及利用放射线的癌症的治疗。术语“化学疗法”涉及利用化学物质的癌症的治疗，称为化疗剂。术语“免疫疗法”如用于此处涉及通过利用免疫治疗剂，有助于清除癌细胞的免疫系统反应的刺激。术语“基于基因的疗法”涉及基于将遗传材料（DNA、或可能地RNA）转移到个体中的癌症的治疗。这样的其他癌症疗法的实例包含：化学疗法，包含但不限于替莫唑胺、长春新碱、长春瑞滨、甲基苄肼、卡氯芥、洛莫司汀、红豆杉醇、多西他赛、三苯氧胺、维甲酸、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和沙立度胺；免疫治疗剂，如但不限于激活的T细胞和脉冲树枝状的细胞；神经胶质瘤细胞中的CD3、CD7和CD45的基因转移，伴随如此处定义的RNA分子的递送。

依照本发明，可单独给予或结合一种或多种另外的癌症疗法给予治疗分子和/或载体。可在治疗分子和/或表达载体给予之前、之后或同时给予另外的癌症疗法。

本发明的进一步的目标是包括治疗有效量的治疗分子的药学制剂，例如，本发明的反义寡核苷酸和/或表达载体，和药学上可接受的载体。术语“治疗有效量”如用于此处意指研究员、兽医、医生或其他临床医生所寻找的在组织、系统、动物或人类中引发生物学或医学响应的治疗分子和/或表达载体的量。

在另一个实施例中，因此，本发明涉及适于癌症的治疗的药物组合物，优选地神经胶质瘤，和更优选地神经胶母细胞瘤，所述药物组合物包括依照本发明的治疗分子和/或表达载体，和药学上可接受的载体。在还有的另一个实施例中，本发明涉及适于延迟癌症的发展的药物组合物，优选地神经胶质瘤，和更优选地神经胶母细胞瘤，所述药物组合物包括依照本发明的治疗分子和/或表达载体，和药学上可接受的载体。在进一步的实施例中，本发明涉及适于抑制癌症入侵的药物组合物，优选地神经胶质瘤，和更优选地神经胶母细胞瘤，所述药物组合物包括依照本发明的治疗分子和/或表达载体，和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本发明涉及适于抑制恶性的神经胶质细胞（MGC）入侵的药物组合物。

依照本发明，药物组合物可进一步包括至少一个如上述讨论的另外的癌症治疗剂。

依照本发明，可口服地给予药物组合物，例如，以药丸、药片、漆涂药片（lacquered tablet）、糖衣药片（sugar-coated tablet）、粒剂、硬和软凝胶胶囊、水、酒精或油溶液、糖浆、乳剂或悬浮液，或直肠地给予，例如，以栓剂的形式。也可肠胃外地执行给药，例如，以适于注射或灌输的溶液形式皮下地、肌肉地或静脉内地给药。例如，其他的适当的给药形式是经皮的或局部的给药，例如，以药膏、酊剂、喷雾或经皮的治疗系统的形式，或以鼻喷雾或气雾剂混合物的形式的吸入性给药，或，例如，微胶囊、植入物（implant）或包药干糊片（wafer）。

可如本领域已知的进行药物组合物的制备。例如，使得治疗分子和/或活性化合物，和一种或多种固体的或液体的药学载体物质和/或添加剂（或辅助物质）和，如果期望，结合具有治疗或预防作用的其他药学上的活性化合物，成为适当的给药形式或剂量形式，然后，在人类医药中，可将其用作药物。药学制剂也可含有添加剂，它们中很多是本领域已知的，例如，填充剂、分解质、结合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、香料、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、用于达到储存作用（depot effect）的试剂、用于改变渗透压力的盐、涂层剂或抗氧化剂。

如此处应用的，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包含任何和所有的生理学上相容的溶剂、分散介质、涂层剂（包衣剂）、抗细菌的和抗真菌的试剂、等压和吸收延迟试剂，等等。在一个实施例中，载体适于肠胃外给药。可替换地，载体可适于静脉内的、腹膜内的、肌肉的、舌下的或口服的给药。药学上可接受的载体包含无菌的水溶液或分散液和适于无菌的可注射的溶液或悬浮液的临时制备的无菌的粉末。用于药学上活性物质的这样的介质和试剂的应用是本领域已知的。除了在任何传统的介质或试剂与活性化合物不相容的情况，预期它在本发明的药物组合物中的应用。组合物也可包含辅助的活性化合物。

在制造和存储的条件下，治疗组合物一般必须是无菌的和稳定的。可将组合物配制成溶液、微型乳剂、脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有，例如，水、乙醇、多羟基化合物（多元醇）（例如，丙三醇、丙二醇、和液体聚乙二醇，等等）的溶剂或分散介质，和它的适当的混合物。例如，可通过应用涂层如卵磷脂，通过在分散的情况中，维持需要的颗粒大小和通过应用表面活性剂维持适当的流动性。在很多情况中，将优选的是，在组合物中包含等压试剂（等渗试剂），例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、或氯化钠。可通过包含延迟吸收的组合物，例如，单硬脂酸盐和凝胶，使得可注射的组合物的吸收延迟。此外，可以延时释放配方的形式给予本发明的寡核苷酸，例如，以包含缓慢释放聚合物的组合物的形式。可利用将保护修饰的寡核苷酸对抗迅速的释放的载体制备修饰的寡核苷酸，如受控的释放配方，包含植入物和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物（PLG）。

关于这样的配方的制剂的很多方法已获得专利，或通常是本领域的技术人员已知的。可通过将活性化合物，如本发明的治疗分子，以适当的溶剂中需要的量和一种或多种上述列举的成分的组合结合，如需要，之后过滤杀菌，从而制备无菌的可注射的溶液。通常，通过将活性化合物并入到含有基础分散介质和来自上述列举的那些的必需的其他成分的无菌的媒介中，制备悬浮液。在适于制备无菌的可注射的溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从它的先前无菌-过滤的溶液中产生活性组分加上任何另外的期望的成分的粉末。也可利用一种或多种增强它们的溶解性的附加化合物制备本发明的治疗分子。

单独的或结合要给予的一种或多种活性化合物使用治疗分子和/或表达载体的剂量或量，取决于个人的情况，和通常，适于个人的环境，从而达到最适宜的作用。因而，它取决于要治疗的疾病的特性和严重性，也取决于要治疗的人类或动物的性别、年龄、体重和个人响应性，取决于使用的化合物的功效和作用的持续时间，取决于治疗是急性的或慢性的或预防性，或取决于除了治疗分子和/或表达载体之外，是否给予其他活性化合物。应该理解，剂量和给药方案在熟练的技术人员的能力范围内。

在另一个实施例中，依照本发明，本发明提供包括RNA治疗剂或表达载体或药物组合物、和其使用说明的试剂盒。

治疗方法

不倾向于通过理论限制，基于发明人的新的和意想不到的发现，即DRR在恶性神经胶质瘤的入侵成分中高度地表达，和在体内和体外入侵试验中驱动MC入侵，本发明的发明人预期，敲低的和因而显著降低DRR表达的治疗益处可通过抑制肿瘤到脑的入侵来介导，例如，通过抑制恶性神经胶质细胞（MGC）入侵，从而降低或延迟癌到邻近健康组织的入侵（例如，在神经胶质瘤的情况中，脑）。

细胞入侵需要利用肌动蛋白细胞骨架和MT连同FA的连续形成和解体的事件的循环。已经很好确定了MT在FA周转（turnover）中的作用，积聚的证据表明，在通过F-肌动蛋白调整的过程中，MT向FA生长。更少知道的是正常的神经胶质细胞和神经胶母细胞瘤中的FA的组成，和还没有描述调节正常的神经胶质细胞和神经胶质瘤细胞中调节FA周转的分子机制。

此处报道的我们的发现表明，在入侵的MGC中观察的DRR的重新表达导致更迅速的FA解体和因而入侵。当完全破坏DRR-肌动蛋白联合（结合，association）时，不能将MGC从肿瘤块分离具有临床意义。实际上，已经显示了CD151-特异性的转移封闭性单克隆抗体通过防止细胞后收回抑制转移，和因而细胞从初级的肿瘤块分开和迁移（Zijlstra et al.,Cancer Cell13:221-34.2008）。

恶性神经胶质瘤入侵是脑癌治疗失败的主要的原因。此处，我们报道，新的功能筛选策略的发展和作为入侵的调节剂的下调肾细胞癌（DRR）的鉴定。此处，我们显示：在体外和体内中DRR驱动入侵；尽管不在正常的神经胶质细胞中表达，但是DRR在神经胶质瘤的入侵成分中高度地表达；DRR联合和组织肌动蛋白和微管细胞骨架；DRR与肌动蛋白和微管细胞骨架的这些联合是焦点粘连（FA）解体和细胞入侵必需的。我们的结果提供支持MT促进FA解体和识别DRR在这种正常生理过程中作为新角色的观点的证据。我们已经显示，DRR是调节FA解体的新的肌动蛋白/MT交联剂。作为支持，我们显示，DRR定位于肌动蛋白细胞骨架和FA，与LC2亚单元MAP1A互相作用。我们显示，DRR表达组织肌动蛋白和MT细胞骨架，以便MT接近FA和促进它们的解体。DRR缺乏，或通过完全破坏DRR-肌动蛋白或DRR-LC2联合对这种复合体的破坏，导致肌动蛋白和MT之间的协调的损失，以及MT不能到达FA。这些发现识别作为新的细胞骨架交联剂的DRR，其调节FA动力学和细胞移动。

在上述观点中，本发明提供在需要其的受试者中，用于治疗癌症的方法，如神经胶质瘤，例如神经胶母细胞瘤，所述方法包括将本发明的治疗分子，此处描述的载体或药物组合物给予所述受试者。在另一个实施例中，本发明涉及在需要其的受试者中，用于延迟癌症的发展的方法，如神经胶质瘤，例如神经胶母细胞瘤，所述方法包括将此处提供的治疗分子、载体或组合物给予所述受试者。术语“受试者”如用于此处优选地涉及人类，但是兽医应用也在靶向例如驯服的家畜、实验室或宠物动物的本发明的范畴中。本发明进一步提供用于下调DRR表达的方法，例如使DRR表达减少超过50%、超过70%、或超过90%。在实施例中，使DRR表达减少或降低约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%。在另一个实施例中，本发明涉及用于抑制或降低肿瘤细胞的迁移或入侵的方法，优选地神经胶质瘤的细胞如神经胶母细胞瘤，所述方法包括将本发明的治疗分子、载体或组合物给予需要其的受试者。

本发明进一步提供用于增强癌症疗法对癌症治疗的功效的方法，具体地是神经胶质瘤（优选地神经胶母细胞瘤），所述癌症疗法选自包括切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和/或基因疗法的组，所述方法包括给予此处定义的治疗分子、载体或组合物，和同时地、单独地或顺序地给予所述癌症疗法。术语“增强癌症疗法的功效”，如此处应用的，涉及传统的癌症治疗的改进和包含在传统的癌症治疗期间应用的抗癌组合物的量的降低，例如，放射疗法中的放射线的量、化学疗法中化疗剂的量、免疫疗法中免疫治疗剂的量或基于基因的疗法中载体的量，和/或从而在传统的癌症治疗期间，当在传统的剂量或量上应用时，增加传统的治疗和抗癌组合物的功效。在一个实施例中，增强癌症疗法的功效涉及延长接受治疗的受试者的存活率。

此处也提供了DRR作为入侵的脑癌细胞的生物标记的应用。基于DRR表达，升高的DRR表达的检测可用于识别入侵的肿瘤细胞和用于肿瘤的诊断和/或预后。因此，提供用于恶性神经胶质瘤的诊断和预后的方法，连同DRR作为入侵生物标记的应用。

也提供用于诊断和预后应用的试剂盒。这样的试剂盒可包括载体、包装或容器，将其划分成区室（隔间），以便接受一个或多个容器如小瓶、管子、等等，每一个容器包括在方法中使用的单独的要素（element）。例如，容器可包括可检测地标记的或能够可检测地标记的探针。例如，探针可能是，DRR生物标记特异性的抗体或特异性地与DRR杂交的RNA。试剂盒也可包含含有报告装置（reporter-means）的容器，如生物素-结合蛋白，例如，结合到可检测标签上的抗生素蛋白或链霉亲和素，例如，酶、荧光、或放射性同位素标签。试剂盒可包含所有的或部分的生物标记蛋白的氨基酸序列，或编码这样的氨基酸序列的核酸分子，或结合到DRR生物标记的mRNA上的核酸分子，或编码结合到DRR生物标记的mRNA上的核酸分子的核酸分子。

本发明的试剂盒一般将包括上述描述的容器和一种或多种包括从商业和使用者立场上期望的材料的其他容器，包含缓冲剂、稀释剂、过滤器（filter）、针、注射器、和具有使用说明的包装插入物。另外，可在容器上提供标签，从而指示用于具体应用的组合物。也可在试剂盒包括的插入物上包括指示和/或其他信息。

在一个实施例中，本发明提供试剂盒，包括至少一种结合DRR蛋白质或DRR mRNA的试剂；和用于在受试者中确定脑癌细胞的入侵的至少一种试剂的使用说明。

总之，本发明涉及抗-DRR治疗方法治疗恶性神经胶质瘤的应用。本治疗方法基于涉及反义-、病毒-载体-的抗-DRR分子的使用，或旨在敲低人类肿瘤细胞中DRR表达的任何其他有关的方法的应用。进一步依靠下列非-限制性的实例说明本方法的技术上的可行性。

实施例

将通过参考下列实施例更容易地理解本发明，提供说明本发明的实施例，不能以任何方式解释为限制它的范畴。

除非另作定义或上下文另外明显地指出，此处应用的所有的技术和科学术语具有与一般由本发明所属领域的技术人员理解的相同的意义。应该理解，与此处描述的那些相似的或相同的任何方法和材料可用于本发明的实施或检验。

材料和方法

功能筛选试验

将正常的人类成人脑cDNA库（Clontech）亚克隆到pLib逆转录病毒载体（Clontech）中和利用Lipofectamine PLUS试剂（Clontech）将其用于转染PT67包装细胞系。从转染后24-72小时的上清液收集分泌的复制缺陷的逆转录病毒，和在72小时时间过程上，用于连续地转导WT-U251神经胶质细胞系（图1A）。

人类神经胶质瘤分析

在蒙特利尔神经学学会和医院（Montreal,魁北克,加拿大），从脑肿瘤研究中心组织库获得人类神经胶质瘤样品。从所有的病人获得书面的同意，和在蒙特利尔神经学学会和医院，通过机构伦理委员会批准该项目。

细胞

在以10%FBS和青霉素-链霉素抗生素混合物补充的DMEM高-葡萄糖培养基中培养U251人类少突神经瘤细胞系（WT）、人类神经胶质肿瘤细胞系（U343MG）、大鼠星形细胞瘤细胞系（C6）、DRR^-和DRR⁺细胞。人类神经胶母细胞瘤细胞系（U87MG）（圣地亚哥的加利福尼亚大学，Cavance实验室）在以10%灭活的FBS和青霉素-链霉素抗生素混合物补充的DMEM高-葡萄糖的培养基中生长。

抗体和试剂

通过Covance生产针对氨基酸67-92的亲和力-纯化的兔多克隆抗-DRR抗体。从Sigma购买小鼠抗-粘着斑蛋白和小鼠抗-微管蛋白抗体、诺考达唑、和G418。从Chemicon购买大鼠抗-微管蛋白和小鼠抗-GFAP抗体。从Invitrigen购买若丹明-毒伞素、兔抗-FAKpY397和Alexa488-、694-、和647-结合的二抗、和脂质体2000。从Encor Biotechnology Inc.购买鸡抗-MAP2抗体。GFP-paxillin cDNA质粒由Dr.I.R.Nabi（英国哥伦比亚大学）馈赠。

人类神经胶质瘤免疫标记

以5μm切割固定的石蜡-包埋的组织，并固定。载玻片在120℃，在高压下，在柠檬酸缓冲液中（pH6.0，Lab Vision）经历热-诱导的抗原表位修复（epitope-retrieval）10分钟。在室温下，在Lab Vision360Autostainer上进行所有的标记。利用结合到HRP上的链霉亲和素或LV-聚合物增强抗体结合，和利用AEC色原（发色团）显现（Lab Vision）。利用Surgipath560苏木精复染色所有的切片，和利用Aquatex固定。DRR抗体对照包含抗原性肽竞争，利用免疫前血清免疫标记和单一的二抗免疫标记。

细胞

利用短发夹RNAs（Paddison等人，2002）和逆转录病毒转导产生DRR^-细胞系。远侧C-末端序列（GCTCTCTCTCTTCGCCGGCCAATGCGGCA）用于产生短的发夹环。RT-PCR用于确定降低的DRR mRNA水平和蛋白质印迹用于证明降低的蛋白质水平。利用Stratagene QuikChange定点突变试剂盒产生

和

构建体。通过利用脂质体2000，按照制造商的使用说明，以DRR、

和

表达载体转染WT-U251细胞产生DRR⁺、和

稳定细胞系。在转染72小时后，扩增细胞，和在以0.6mg/ml的G418补充的DMEM中选择2周。用胰蛋白酶消化抗性克隆，和在选择培养基中扩增。Dr.P.McPherson（McGill University）慷慨赠与E18-19大鼠海马趾神经细胞。每七天，将以B-27、N-2、l-谷酰胺（500μm）和青霉素/链霉素（100单位/ml）（Invitrogen）补充的Neurobasal培养基供给细胞。

细胞增殖、迁移和入侵试验

用胰蛋白酶消化细胞和利用Coulter Z Series计数器计数细胞（Beckman-Coulter,Inc.）。为相同细胞系的两个样品采取两次测量和求均值。将细胞加入（plate，布板）在6-孔板中，和在24、48、72和96小时后计数。为了评价2D细胞迁移，使细胞生长到汇合，和利用吸液管顶端（管头）产生划痕。在划痕后1-11小时每隔一定间隔捕获图像。利用悬滴法产生肿瘤球状体，和如先前描述的将其移植到胶原质1型基质中（Werbowetski-Ogilvie et al.,CancerResearch66:1464-1472,2006）。在以后的时间点之后（0、24、48和72小时）显像植入的球状体。通过在4个不同的角度上计算极端直径和通过减去在时间零点上的球状体的极端直径测量侵袭的区域。以一式三份地进行所有的试验和所有的试验都来自3个独立的试验。

关于图22中显示的划痕试验，使用下列程序：在转染72小时之后，细胞达到单层。200μl吸液管用于进行划痕。利用PBS将细胞漂洗3次，和将新鲜的培养基加入到细胞中。在划痕开始和在24小时和48小时，利用5×物镜捕获图像。关于每一个图像，测量划痕的一侧和另一侧之间的距离。通过在每一个时间间隔上，测量划痕的距离和通过从在时间零点上的划痕的距离将其减去，量化细胞迁移的距离（μm）。

小鼠脑内肿瘤移植

将小鼠固定到立体定位架（stereotactic frame）上和在中线上，在头皮中做出小的切口。在前顶前0.5mm和侧部2mm形成毛口孔（burr hole）。慢慢地，通过毛口孔，将微升注射器（Hamilton Company）降低到4.4mm的深度，和注射含有2×10⁵细胞3μl PBS的细胞悬浮液12分钟。在注射后一个月将动物处死，以便评价肿瘤生长和入侵。

蛋白质印迹和免疫沉淀反应

为了确定WT、DRR^-和DRR⁺细胞中的DRR表达水平，允许细胞生长到80%汇合，在冷的PBS中洗涤，和利用RIPA缓冲液或2%热的SDS裂解。在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离裂解液（30μg），和转移到硝化纤维素膜上。利用兔抗-DRR和鼠抗-微管抗体，之后是适当的HRP-结合的二抗（Jackson ImmunoResearch）作为探针检测膜。使用ECL plusTM试剂检测试剂盒（Pierce）。如先前描述的，在HEK-293细胞中进行免疫沉淀反应试验（Angers-Loustau et al.，Molecular Cancer Research2:595-605,2004）。

鼠大脑内肿瘤移植

通过机构动物保健委员会（Institution's Animal Care Committee）批准所有的动物试验，其与动物保健加拿大理事会的指导方针一致。通过含有克他命、甲苯噻嗪和乙酰丙嗪的腹膜内注射液麻痹六周大的CD1nu/nu无胸腺小鼠（Charles River,加拿大）。

酵母双杂交筛选

利用Matchmaker^TM双杂交系统3进行酵母双杂交筛选（Clontech）。将全长DRR用作诱饵（bait），以便筛选人类脑cDNA文库（Clontech）。

免疫细胞化学

细胞在玻璃盖玻片上或在纤连蛋白（10μg/ml）涂覆的盖玻片上生长，利用4%PFA固定和在被免疫标记之前，利用0.5%TritonX-100透化（permeabilize）。如先前描述的进行FA解体试验（Ezratty EJ et al.,Nat.CellBiol.7:581-590,2005）。简要地，在利用诺考哒唑（10μM；4h）处理之前，在无-血清的培养基中孵育细胞24h。沿着可变的时间过程（5、15、30和60分钟），利用无-血清的培养基洗掉药物。利用Zeiss510共聚焦显微镜（63×物镜）显现荧光标记的细胞。利用Image J软件量化粘着斑蛋白-染色的焦点粘连的数目和表面积。量化三个独立的试验的至少10个视野。

关于免疫荧光研究，利用4%PFA固定细胞和如上述描述的，在用于免疫染色的处理之前，利用0.5%TritonX-100透化。利用鼠抗-粘着斑蛋白标记细胞，从而显现焦点粘连和若丹明-毒伞素用于染色肌动蛋白。以Zeiss510共聚焦显微镜利用63×物镜显现荧光标记的细胞。

共聚焦录像显微镜技术

在利用GFP-毒伞素转染之前，将WT或DRR⁺细胞接种在35mm玻璃底培养皿（MatTek Corporation）中。在转染后24-48小时，利用Zeiss510共聚焦显微镜（63×物镜），每隔1分钟捕获一次图像170分钟。分析五个DRR⁺和五个对照（WT）细胞，和为DRR⁺细胞分析总的17个FA。利用在Webb等人，2004中描述的技术，量化GFP-毒伞素并入FA和它从FA解体的表观速率常数。从五个细胞、5-10个FA/细胞获得测量。在对照细胞中，在170分钟成像时间间隔内，没有鉴定到装配或解体的FA。以平均值±标准误差呈现数据。

人类神经胶质瘤的初级培养

在被转移到细胞培养皿中之前，利用磷酸盐缓冲盐1×（PBS）将从外科切除术获得的组织漂洗两次。使坏死的组织和血管与肿瘤分离。然后切割组织，和在37℃，利用5ml的1.25%的胰酶（trysin）-EDTA孵育30分钟，之后，将7.5ml的细胞培养基（以20%胎牛血清（FBS）、250U/ml青霉素G、250μg/ml硫酸链霉素和4.4μg/ml两性霉素B（Fungizone）补充的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM））加入到样品中，从而中和胰酶-EDTA。然后将样品转移到细胞过滤器（cell strainer）中。将5ml的细胞培养基加入到细胞过滤器中，和将上述过程重复三次。然后在4℃，在1000rpm上将悬浮液离心20分钟，从而沉淀细胞。丢弃上清液和利用3ml红血球裂解缓冲液重悬细胞沉淀物（细胞球粒）（155mM NH4Cl/5.7mMK2HPO4/0.1mM EDTA，pH＝7.3）。在室温下，将细胞孵育15分钟，和然后将15ml培养基加入到样品中，彻底地混合，和在1000rpm上离心10分钟。丢弃上清液和在培养基中重悬细胞。之后，在使用之前，允许细胞在以20%FBS、2×抗生素补充的DDEM中最少生长2周。在2周之后，在以10%FBS和2×抗生素补充的DMEM中培养细胞。在5%CO₂的潮湿的空气中，在37℃维持培养物。刚一达到汇合，就利用0.05%胰酶-EDTA胰酶消化细胞。

细胞转染和3D入侵试验

将50000细胞涂板在6孔板中过夜，和第二天，利用GeneJuice^TM（Novagen），依照制造商的使用说明（2.5μgDNA；100μl OptiMEM中的4μlGeneJuice^TM）以单独的表达GFP或DRR反义的质粒载体转染它们。在转染72h后，通过将0.5ml0.05%胰酶-EDTA加入到孔中，和在37℃孵育30秒，分开细胞。然后，利用1ml的培养基中和细胞，将细胞转移到15ml管中和计数。

为了产生肿瘤球状体，从倒转的有盖培养皿（Petri dish）盖子中悬浮含有25000细胞的细胞培养基的液滴（20μl）。在培养皿的底部加入5mlPBS，从而阻止液滴的蒸发。为了形成细胞聚集体，在37℃将悬滴孵育72h。将聚集体转移到含有10ml培养基的2%琼脂/PBS（pH7.4）涂覆的有盖培养皿中，在37℃孵育另外的48h时期，以便允许聚集体变成圆形，类似于球状体。然后，将球状体移植到与10×DMEM和0.1mM NaOH以（8：1：1）的比率混合的液体胶原质Ⅰ型溶液中（2.5mg/ml0.012N HCL）。允许含有胶原质的球状体在37℃凝固30min，在其之后，将0.5ml的组织培养基加入到每一个孔中。在随后的时间点：0、24、48、72、和96小时之后，使移植的球状体显像。通过在4个不同的角度计算极端直径和通过减去时间零点的球状体的极端直径，测量入侵的区域。

关于图17-22中的试验，如下进行转染：在转染之前一天，将细胞涂布，以便在转染时达到75%的汇合。在转染之前，利用新鲜的培养基代替细胞培养基。依照制造商的使用说明，制备DRR低聚物和脂质体2000（Invitrogen）的复合体。简要地，在opti-MEM中轻轻地混合脂质体，和在室温下放置5min。首先将DRR低聚物与opti-MEM混合（以便加入到细胞中的最终的浓度是20nM）和轻轻地与脂质体混合。在加入到细胞中之前，在室温下，将脂质体-DRR低聚物复合体在室温下孵育20分钟。在转染后一天，将新鲜的细胞培养基加入到转染的细胞中。在转染72小时之后，固定细胞或裂解细胞。

反义寡核苷酸合成

标准的亚磷酰胺固相合成条件用于所有修饰和未修饰的寡核苷酸的合成（Damha and Ogilvie,1993,In Agrawal,S.(ed.),Protocols forOligonucleotides and Analogs:Synthesis and Properties,Methods inMolecular Biology,Vol.20,The Humana Press Inc.,Totowa,NJ,pp/81-114）。在Applied Biosystems3400DNA合成仪上，在1μmol比例上利用UnylinkCPG支撑体（ChemGenes）进行合成。将所有的亚磷酰胺制备成0.15M乙腈（ACN）溶液，除了DNA之外，将其制备成0.1M。5-乙基硫代四唑（5-ethylthiotetrazole）（0.25M ACN溶液）用于激活用于偶联（coupling）的亚磷酰胺。利用3%的CH₂Cl₂中的三氯乙酸溶液经110s完成脱三苯甲基作用（detritylation）。利用醋酸酐的四氢呋喃（THF）和16%N-甲基咪唑的THF溶液完成不足序列（failure sequence）的加帽。利用0.1M的氢化黄原胶（xanthane hydride）在1：1v/v吡啶/ACN溶液完成硫化作用。DNA酰胺（DNA amidite）的偶联时间是110s（鸟嘌呤核苷是270s），和2'F-ANA亚磷酰胺是600s，除了允许鸟嘌呤核苷亚磷酰胺偶联900s之外。利用无水的2：3TEA:CAN，在柱脱氰乙基作用步骤上，以三次15min洗涤，之后是ACN洗涤完成去保护。在室温（RT）条件，利用3：1的NH₄OH：EtOH48h，或在65℃上利用40%甲胺10min完成从固体支撑体的去保护和分裂（Bellon,L,2000,Curr.Protocols.Nucleic Acid Chem.,3.6.1-3.6.13）。

通过利用24%丙烯酰胺凝胶的制备型变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），或利用具有100mmol醋酸三乙胺水溶液和5%CAN的固定相，和HPLC-级的乙腈的流动相的Varian Pursuit5反相C18柱，在Waters1525HPLC上通过反相HPLC，完成粗寡核苷酸的纯化。在DEPC-处理过的高压消毒的Millipore水中过夜提取凝胶带，和使其冻干干燥。利用来自GEHealthcare的Nap-25Sephadex柱脱去所有纯化的寡核苷酸的盐分。通过分析型变性PAGE和/或ESI-LCMS证实序列。

利用在NCBI网站上公布的可用的mRNA序列设计靶向DRR mRNA的序列。利用可获自自IDT的反义寡核苷酸（AON）序列选择工具设计有效靶向DRR的反义序列（http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/ AntiSense/Antisense.aspx7source=menu）。利用BLAST比对工具（NCBI）检查预测的反义序列，从而检查空闲-靶命中（off-target hits）的缺乏。另外，利用MFOLD工具预测DRR mRNA的片段的mRNA二级结构（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form），以便寻找mRNA-AON结合易接近性。在表1中显示靶向DRR的AON（G4（SEQ IDNO:14）、G5（SEQ ID NO:15）、和G6（SEQ ID NO:16）），和也为对照试验制备不靶向DRR的对照AON（G1（SEQ ID NO:11）、G2（SEQ ID NO:12）、G3（SEQ ID NO:13））。除了此处提供的DRR-靶向AON序列之外，例如，在表1中，可利用这些方法，通过选择与其他DRR mRNA区域互补的序列选择其他DRR-靶向AON序列，同时确定DRR mRNA的特异性而不是其他mRNA序列的特异性。应该理解，包括任何反义分子，例如，反义寡核苷酸，其靶向DRR和降低或减少DRR表达。

结果

功能筛选试验识别作为入侵促进剂的DRR

利用3D入侵模型试验MGC入侵（Del Duca,D.et al.,Journal ofNeurooncology67:295-303,2004）。利用这种模型作为出发点，我们通过逆转录病毒转导MGC，U251神经胶质瘤细胞系，发展新的功能筛选试验，从而表达全部脑cDNA文库。我们推论，如果我们可使细胞异源地表达促进入侵的基因，则可将其与作为高入侵细胞的其他细胞区别。从转导的MGC产生肿瘤球状体，和在3D入侵模型中评价它们的入侵。然后捕获可区别的高入侵细胞，和在培养基中扩增和识别最初转导的基因（图1A）。利用这种前向遗传策略（forward genetic approach），识别作为强的入侵促进剂的DRR。

为了检验DRR是否担当MGC入侵的效应器，我们产生由DRR-过表达MGC（DRR⁺，图8）和野生型（WT）MGC组成的复合肿瘤球状体，和研究了每一个细胞系的入侵参数（图1B-1E）。在MGC内源性地表达DRR时，DRR^＋细胞入侵超过WT细胞的240%。通过对比，利用RNA干扰（DRR^-，图8）降低MGC中的DRR表达引起入侵的显著减少（图1F，G&J）。为了检验降低DRR表达是否减少其他神经胶质细胞系中的入侵，我们发展了U343-DRR^-、C6-DRR^-和U87MG-DRR^-和稳定的细胞系和检验了它们的入侵。与表达内源的DRR的它们的野生型对应物比较，所有的DRR^-细胞系在它们入侵中表现显著的降低（图11C-11E）。有趣地，DRR表达也导致细胞生态学的重要的改变，如DRR⁺细胞是拉长的和纺锤形的，而DRR^-细胞是圆形的（图1H、1I、&1K）。因为它们迁移，2D迁移试验中的实验也显示细胞形态学的差异。DRR⁺细胞以长薄突出迁移而WT和DRR^-细胞以均一的宽片层迁移（图9）。已经显示了拉长的纺锤形的细胞形状是MGC通过脑移动的优选模式（Beadle et al.,Mol Biol Cell.19:3357-68,2008）。

接下来，我们在小鼠模型中检验DRR作为入侵促进剂的角色。将DRR⁺和DRR^-肿瘤植入到小鼠的胼胝体下区（subcallosal）/尾部区域和评价入侵（图1L&1M）。DRR^-肿瘤作为很好限制的块生长而没有入侵到邻近的实质中，和这些细胞具有圆形的形态学。相反地，DRR⁺肿瘤是高度入侵的。这些入侵的细胞，其以它们的大的、染深色的和拉长的细胞核为特征，具有拉长的形状，从肿瘤块分离，侵袭实质，和，重要地，向着并且移动到胼胝体。到白质区域如胼胝体中的入侵是人类恶性神经胶质肿瘤优选使用的入侵样式（Pedersen et al.,Int.J.Cancer；62:767-71,1995）。此外，DRR⁺肿瘤比DRR^-肿瘤小（图8B、8C）表明，如先前描述的减少细胞增殖（Wang et al.,Genes Chromosomes Cancer27:1-10,2000）。我们评价，DRR在细胞分裂中的作用，也发现，细胞分裂与DRR表达是逆相关的（图1N）。已经描述了MGC入侵和增殖是暂时地排外事件的观念（Giese et al.,IntJCancer67:275-282.1996）。

因而，我们识别了作为细胞移动的调节剂和细胞入侵的驱动剂的DRR。我们已经在体外和体内入侵实验中证实了这种发现，确定了DRR对细胞入侵的重要性。

DRR在神经细胞和人类神经胶质瘤中表达但不在正常神经胶质中表达

为了在临床上证实我们的体外和体内的发现，我们确定DRR在正常的人类脑和恶性的神经胶质瘤中的表达模式。我们发现，在正常的人类脑中，DRR在神经细胞中强烈地表达，但是不在星细胞或少突细胞中表达（图2A-2F，参考图10高放大倍率图像）。培养的胚胎大鼠神经细胞和神经胶质与神经细胞和神经胶质标记的共标记也显示，DRR在神经细胞中表达但是不在神经胶质细胞中表达（图2G-2L）。包含抗原性肽竞争的DRR抗体对照，利用预-免疫血清的免疫标记和单一的二抗免疫标记是阴性的。在每一个等级的8个恶性神经胶质瘤中的DRR表达的分析指示，DRR在所有的恶性神经胶质肿瘤中高度地但是非均一的表达（图2M）。等级2和3神经胶质瘤，其是具有低的增殖率的高入侵的肿瘤，均一地表达DRR。相反，等级4神经胶质瘤，其是高度地入侵的和高度地增殖的，以提示模式表达DRR。入侵周围肿瘤细胞均一表达DRR，而中心增殖肿瘤区域显示DRR表达的可变性。在8个等级4神经胶质瘤中有5个的中心肿瘤显示很少的甚至没有DRR表达，而在8个肿瘤中的3个中，中心肿瘤是DRR阳性的。总的看来，这些数据显示，在DRR不在正常的神经胶质细胞中表达时，它在恶性神经胶质瘤中具有强烈的和差别的表达模式。

DRR联合细胞骨架

为了揭露DRR如何行使驱动细胞移动的功能，我们在亚细胞水平上定位DRR。内生的或异源地表达的DRR主要地沿着肌动蛋白应力纤维、FA和膜褶边定位（图3A）。和早先的报道一致（Wang et al.,GenesChromosomes Cancer27:1-10,2000），也可在细胞核中发现DRR（图12）。这些结果表明，DRR可通过直接影响细胞骨架机构或通过细胞核中的调节作用促进入侵。

为了解决这个问题，我们通过识别肌动蛋白联合需要的最小的结构域从肌动蛋白细胞骨架分开（解偶联）DRR。产生人类DRR的连续的N-和C-末端截短的构造，和利用荧光标签检验定位。识别两个能够与肌动蛋白联合的最小的区域，氨基酸62-100和108-120（图14）。我们确定，肌动蛋白联合需要的结构域是跨物种保守的结构域。我们识别和突变了人类、小鼠、大鼠和斑马鱼DRR之间保守的62-100和108-120区域内的氨基酸（图13）。在两个片段

中保守的脯氨酸-谷酰胺（PE）基序到丙氨酸的联合突变导致重要的肌动蛋白细胞骨架的混乱和完全破坏肌动蛋白与剩余的应力纤维的联合（图3A）。这些发现指示，DRR的细胞骨架联合是跨物种保守的。

为了识别在DRR与细胞骨架的联合中扮演重要作用的分子，我们使用正常的脑文库的酵母双杂交筛选，从而识别DRR结合伴侣。利用这个实验，将MAP1A的轻链（LC2）亚单元确定为候选DRR结合蛋白。我们也已经显示，DRR和LC2沿着肌动蛋白应力纤维和膜褶边共定位，当异源地表达时，与这些蛋白质的联合一致，可发生共免疫沉淀反应（图3B和3C）。有趣地，DRR肌动蛋白结合位点的突变似乎增加DRR与LC2的联合（图3B）。我们也发现，在某些细胞中，DRR的非-肌动蛋白结合形式可定位于微管（没有显示数据）。

然后，我们利用截短和氨基酸突变分析，揭露DRR的非-LC2结合形式。发现最小的N-末端组氨酸-精氨酸-谷酰胺（HRE）序列是LC2结合需要的（图3B）。当突变这个区域时，

，存在重要的肌动蛋白细胞骨架的混乱和DRR的定位模式的改变。存在细胞核的DRR表达的增加和扩散的细胞质定位（图3A）。也观察到轻微的肌动蛋白联合。

总之，数据显示，DRR定位于肌动蛋白细胞骨架、FA和细胞核。已经定义了肌动蛋白联合

需要的最小的区域。已经将MAP1A的LC2亚单元确定为DRR联合的蛋白质，和可通过氨基酸末端HRE区域的突变

破坏这种联合。

DRR与细胞骨架的联合是细胞移动所需的

破坏DRR-肌动蛋白和DRR-LC2联合的能力提供两种途径，从而确定DRR与细胞骨架的联合是否是驱动细胞移动所需的。产生表达

或

的稳定的细胞系，和在3D入侵实验中检验入侵。我们发现，与WT细胞比较，DRR-肌动蛋白联合的损失导致入侵的3-倍的降低，表明DRR的这种突变形式担当功能显性阴性（functional dominantnegative）（图4）。当破坏DRR-LC2相互作用时，也看到相似的发现（图4）。总之，这些数据显示，DRR与肌动蛋白和LC2的联合是驱动细胞入侵所需的。

DRR调节焦点粘连动力学

细胞移动的过程需要调节的FA动力学（Lauffenburger et al.,Cell84:359-369,1996;Friedl et al.,Nat Rev Cancer3:362-74,2003）。为了确定DRR表达是否影响FA，我们表达了GFP-毒伞素融合蛋白和利用共聚焦录像显微镜研究了DRR表达对FA动力学的影响（图5）。在非-极性的DRR⁺细胞中，我们发现，FA形成和解开采取的总时间是40.05±3.00分钟（图5A-5C）。GFP-毒伞素并入FA的速率常数是（6.2±0.9)×10^-3min^-1，和GFP-毒伞素解体的速率常数是（8.6±0.7）×10^-3min^-1。相反地，在WT对照细胞中，FA不是动态的。我们在170分钟成像时间间隔内，不能检测形成或解体的FA（图5D）。这些数据强烈地支持其中DRR通过增强FA动力学驱动细胞入侵的机制。

已经确定了，FA解体需要聚合的微管（MT）（Kaverina et al.,J.CellBiol.142:181-190,1998;Kaverina et al.,J.Cell Biol.146:1033-1044,1999;Krylyshkina et al.,J.Cell Biol.10156:349-359,2002;Krylyshkina et al.,J.Cell Biol.161:853-859,2003;Ezratty et al.,Nat.Cell Biol.7:581-590,2005）。因为我们显示了，DRR与MAP1A的LC2亚单元相互作用，和显示了DRR过度表达导致较不稳定的FA，我们直接地检查DRR是否促进FA解体。

可利用分解微管的微管解聚剂诺考达唑，检查FA解体的MT对照。在诺考达唑应用之后，因为不存在解体可用的微管，FA的大小增加。在诺考达唑洗掉之上，微管聚合和焦点粘连解开（Ezratty et al.,Nat.Cell Biol.7:581-590,2005）。我们利用涂布在细胞外基质成分纤连蛋白上的DRR⁺和DRR^-细胞进行这个实验。做出两个惊人的观察。首先，在诺考达唑应用和MT解聚作用之后，与非-处理的细胞比较，DRR⁺细胞发展更多和更大的焦点粘连（图6A）。相反，相对非-处理的DRR^-细胞（图6A）或WT细胞（没有显示数据），我们在诺考达唑处理过细胞中，没有观察到FA数目和大小的差异，表明DRR缺乏导致大的或成熟的FA。第二，当MT在过度表达DRR的细胞中重新聚合时，FA开始在5分钟内解开，而在DRR^-细胞中的FA（或WT细胞，没有显示数据）仅仅在15分钟之后开始解开，和不能完全地解开（图6A）。当利用DRR

的非-肌动蛋白结合形式或DRR

的非-LC2形式进行相同的实验时，FA解体动力学与DRR缺乏条件相似（图6B，没有显示

的数据）。发现DRR表达促进FA解体而DRR缺乏导致稳定成熟的FA，这指出DRR作为FA动力学的新的调节剂。

DRR组织肌动蛋白和微管细胞骨架

来自FA解体试验的结果表明，DRR与肌动蛋白细胞骨架和MAP1A的LC2亚单元的联合是FA解体所需的（图6）。DRR可通过其达到这个结果的一个机制是通过将MT放置在FA附近改变MT动力学（Kaverina etal.,J.Cell Biol.146:1033-1044,1999）。我们检验这种假设和发现，DRR调节MT和肌动蛋白细胞骨架。DRR表达导致高度地组织的MT系统，其强烈地与肌动蛋白细胞骨架的定位模式并行（parallel）（图7A）。相反，DRR缺乏导致无规律的、贫乏地组织的MT细胞骨架，其不与肌动细胞骨架并行（图7B）。由于应力纤维形成的损失和皮层肌动蛋白系统的促进，DRR缺乏也导致重要的肌动蛋白细胞骨架的改变（图7A和7B）。应力纤维肌动蛋白系统的促进允许肌动球蛋白收缩和因而细胞后收回（Verkhovsky et al.,J.CellBiol.131:989-1002,1995）。重要地，我们也发现，DRR表达是MT到达FA所需的。DRR缺乏细胞中的MT不接近FA（图7B）。相反，DRR表达导致MT和FA之间的紧密的联合（图7A）。总之，这些数据强烈地表明，通过控制肌动蛋白和MT细胞骨架，DRR是FA动力学的新的调节剂。

DRR表达的降低抑制人类神经胶质瘤入侵

通过外科手术切除人类高等级神经胶质瘤和立即放置在培养基中。在随后两周，利用对照GFP载体或DRR-RNAi（SEQ ID NO:1）（载体也含有GFP）转染它们。从这些细胞产生肿瘤球状体和移植到胶原质基质中。在移植后1至14天捕获明视野（上面的泳道）和荧光图像（下面的泳道）（图16）。非-转染的肿瘤（图16A）和对照GFP-转染的肿瘤（图16B）容易地侵袭，而DRR-RNAi转染的肿瘤不容易侵袭（图16C）。图16D显示来自球状体边缘的入侵距离的量化。

这些结果指示，DRR表达的降低抑制人类神经胶质瘤入侵，和在具有初级脑癌的受试者中，表现DRR作为抑制人类脑癌入侵的治疗靶的第一证明。

几种类型的DRR反义寡核苷酸降低DRR表达

比较不同的DRR反义寡核苷酸在降低DRR表达中的功效。连同相应的非-DRR靶向对照一起，检验altimer寡核苷酸（具有交替的单元的寡核苷酸；例如，在PCT公开no.WO/2003/064441中描述这样的寡核苷酸）和嵌合裂隙子寡核苷酸（嵌合的反义寡核苷酸；例如，在PCT公开no.WO/2002/20773中描述这样的寡核苷酸）。

利用指定的DRR反义转染DRR⁺细胞（反义G4（SEQ ID NO:14；altimer）、反义G5（SEQ ID NO:15；嵌合裂隙子）或反义G6（SEQ ID NO:16；嵌合裂隙子））；非靶向的对照反义（Ctl反义）转染DRR^＋细胞；或剩下的未转染（未转染的）。寡核苷酸G1（SEQ ID NO:11）是非靶向altimer对照，和寡核苷酸G2（SEQ ID NO:12）和G3（SEQ ID NO.13）是非靶向嵌合裂隙子对照。

在转染后72小时，利用蛋白质免疫印迹测定DRR表达水平（图17）。结果显示，不同的反义寡核苷酸有效地降低DRR表达。

接下来，在利用不同的DRR反义寡核苷酸转染之后，我们着眼于DRR过表达的细胞中的肌动蛋白细胞骨架和焦点粘连的改变（图18）。结果显示，通过利用DRR反义寡核苷酸处理的DRR表达的降低诱导细胞从拉长的纺锤形态学向圆形形态学移动。我们也发现，利用DRR反义寡核苷酸的处理导致大的焦点粘连。

利用体外划痕实验分析不同的DRR反义寡核苷酸对DRR⁺细胞迁移的影响（图19）。结果显示，在时间零点上，所有的条件都是相似的，然而在48小时内，在对照DRR⁺细胞中的划痕不再明显。相反，利用DRR反义寡核苷酸的处理阻止间隙结束。这些结果证明了，降低DRR表达阻止细胞迁移。

也利用体外3D入侵实验分析DRR^＋细胞入侵（图20）。可看到，对照DRR⁺肿瘤球状体是高度地入侵的，而利用DRR反义寡核苷酸的处理削弱肿瘤球状体入侵。入侵的量化显示，利用DRR反义寡核苷酸的处理导致入侵的显著降低（图20B）。

接下来，在利用不同的DRR反义寡核苷酸转染之后，我们显示了人类神经胶母细胞瘤细胞的肌动蛋白细胞骨架和焦点粘连的改变（图21）。我们发现，通过DRR反义寡核苷酸处理的DRR表达的降低诱导细胞从拉长的纺锤形态学向圆形形态学移动。我们也发现，利用DRR反义寡核苷酸的处理导致大的焦点粘连。

利用体外划痕实验分析人类神经胶母细胞瘤细胞迁移（图22）。结果显示，在24小时内，几乎紧邻对照神经胶母细胞瘤细胞中的划痕，而利用DRR反义寡核苷酸的处理阻止间隙邻近。这些结果证明，DRR表达的降低阻止神经胶母细胞瘤迁移。

总之，此处我们证明了识别入侵的促进剂的新的功能筛选实验，和利用这个实验，我们识别了作为入侵的促进剂的DRR。这里，在体外3D培养中和在入侵的小鼠模型中，我们显示了，DRR促进MGC入侵。正常的人脑和神经胶质瘤中的DRR表达的特征显示，在正常的脑中，DRR在神经细胞中丰富地表达但是不在神经胶质中表达。相反，DRR在低的和高等级的神经胶质瘤的入侵区域中均一地和高度地表达，而在高等级的神经胶质瘤的中心增殖区域中它的表达是可变的。我们也证明了，DRR表达的降低抑制人类神经胶质瘤入侵。

总之，这些发现指示，DRR是神经胶质瘤入侵的重要的调节剂，和神经胶质瘤的治疗处理的靶标。另外，DRR是描述入侵区域和评级恶性神经胶质瘤的有用的生物标记。

我们注意到，最近其他人的研究已经联合了DRR和恶性神经胶质瘤，报道与低等级的神经胶质瘤比较，在高等级的神经胶质瘤中降低DRR表达，而没有描述在正常的脑中的表达（van den Boom et al.,Int.J.Cancer119:2330-2338,2006）。在别处也报道了DRR的抗增殖的功能（Wang et al.,Genes Chromosomes&Cancer27:1-10,2000）。和DRR作为肿瘤抑制剂的作用的这些报道形成对比，此处，我们报道了令人惊讶的和未预料到的发现，即DRR在肿瘤细胞中担当入侵的驱动剂，和在恶性神经胶质瘤的入侵区域中高度地表达。我们第一次显示了，DRR表达与神经胶质瘤细胞中的入侵表现型联合，和显示了DRR表达的降低抑制人类神经胶质瘤入侵。因而，我们的结果第一次暗示，在神经胶质瘤生物学中DRR作为细胞入侵的驱动剂以及细胞增殖的调节剂的重要的作用。

此处引用的所有的文献和参考的内容整体包括在此以供参考。

尽管结合它的具体的实施例描述了本发明，应该理解，它能够进一步修改，本申请倾向于包括本发明的任何变化、应用、或调整，其总体上遵循本发明的原理且包括本发明披露内容的变型，它们是本发明所属领域已知的或通常实践的，可应用于在上文中阐明的基本特征，且落在所附权利要求的范围内。

Claims (40)

1.一种用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的方法，包括将包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的反义寡核苷酸提供给肿瘤细胞，其中所述反义寡核苷酸降低所述肿瘤细胞中的DRR的表达。

2.一种用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的反义寡核苷酸，包括SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物。

3.一种用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的方法，包括向肿瘤细胞提供包括编码SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的序列的DNA分子，或编码适于降低所述肿瘤细胞中的DRR的表达的反义寡核苷酸的DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述DNA分子插入到适于生产所述反义寡核苷酸的表达载体中。

5.一种表达载体，包括编码SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的序列。

6.一种用于治疗癌症的方法，包括将权利要求2所述的反义寡核苷酸或编码权利要求2所述的反义寡核苷酸的载体给予需要其的受试者。

7.一种延迟癌症的发展的方法，包括将权利要求2所述的反义寡核苷酸或编码权利要求2所述的反义寡核苷酸的载体给予需要其的受试者。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，结合选自由外科切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和基因疗法组成的组中的一种或多种癌症疗法使用所述反义寡核苷酸和/或所述载体。

9.根据权利要求1、3、4和6至8的任何一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是神经胶质瘤细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述神经胶质瘤细胞是神经胶母细胞瘤细胞。

11.根据权利要求2所述的反义RNA，其中所述肿瘤细胞是神经胶质瘤细胞。

12.根据权利要求11所述的反义RNA，其中所述神经胶质瘤细胞是神经胶母细胞瘤细胞。

13.一种用于治疗癌症的药物组合物，包括权利要求2所述的反义寡核苷酸或编码权利要求2所述的反义寡核苷酸的载体，和药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述癌症是神经胶质瘤。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述神经胶质瘤是恶性神经胶母细胞瘤。

16.一种试剂盒，包括根据权利要求13至15的任何一项所述的药物组合物，和其使用说明。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，进一步包括适于治疗神经胶质瘤和/或延迟其发展的第二活性化合物，用于同时地、单独地或顺序地给予受试者。

18.一种用于增强癌症疗法对神经胶质瘤的治疗的功效的方法，包括将权利要求2所述的反义寡核苷酸或编码权利要求2所述的反义寡核苷酸的载体给予需要其的受试者，以及同时地、单独地或顺序地给予所述癌症疗法，其中所述癌症疗法选自由外科切除术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、和基因疗法组成的组。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述神经胶质瘤是恶性神经胶母细胞瘤。

20.一种用于在需要其的受试者中抑制恶性神经胶质细胞入侵的方法，包括向肿瘤细胞提供具有SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸降低所述肿瘤细胞中的DRR的表达。

21.一种用于在需要其的受试者中抑制恶性神经胶质细胞入侵的方法，包括向肿瘤细胞提供包括SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16的序列、或其片段或衍生物的DNA分子，或编码适于降低所述肿瘤细胞中的DRR的表达的反义寡核苷酸的DNA。

22.一种用于在需要其的受试者中抑制恶性神经胶质细胞入侵的方法，包括将权利要求2所述的反义寡核苷酸或编码权利要求2所述的反义寡核苷酸的载体给予所述受试者。

23.一种用于诊断或预后受试者中的神经胶质瘤的方法，包括在所述受试者的神经胶质瘤细胞中测量DRR表达，其中DRR表达指示细胞的入侵。

24.一种用于在受试者中显现入侵神经胶质瘤细胞的方法，包括使神经胶质瘤细胞与特异性结合DRR蛋白质或mRNA的分子接触，和测量所述细胞中的DRR蛋白质或mRNA水平，其中表达DRR的细胞是入侵的。

25.一种用于诊断或预后受试者中的入侵神经胶质瘤的试剂盒，包括DRR RNA或蛋白质特异的可检测标记的探针，用于检测所述探针与DRR RNA或蛋白质的结合的报告装置，和其使用说明。

26.一种用于治疗癌症的方法，包括将降低DRR的表达的治疗核酸分子、或编码所述治疗核酸分子的DNA或载体给予需要其的受试者。

27.根据权利要求27所述的方法，其中延迟所述癌症的发展。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其中抑制恶性细胞入侵。

29.根据权利要求28所述的方法，其中抑制恶性神经胶质细胞入侵。

30.根据权利要求26至29的任何一项所述的方法，其中所述癌症是神经胶质瘤，优选地恶性神经胶质瘤，且更优选地神经胶母细胞瘤。

31.根据权利要求26至30的任何一项所述的方法，其中，所述治疗核酸分子是反义寡核苷酸。

32.根据权利要求26至31的任何一项所述的方法，其中所述治疗核酸分子与DRR mRNA或其片段或衍生物互补或特异性杂交。

33.一种用于降低肿瘤细胞中的下调肾细胞癌（DRR）的表达的方法，包括将与DRR mRNA互补或特异性杂交的治疗核酸分子提供给所述肿瘤细胞，其中所述治疗核酸分子降低所述肿瘤细胞中的DRR的表达。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述治疗核酸分子包括反义寡核苷酸。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述治疗核酸分子包括具有altimer、嵌合裂隙子的结构的反义寡核苷酸，和/或包括修饰的核苷或核苷酸，或其中所述治疗核酸分子包括适配体。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述修饰的核苷或核苷酸是FANA。

37.一种具有在SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16中示出的序列的寡核苷酸。

38.一种DNA，其编码的寡核苷酸具有在SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16中示出的序列。

39.一种具有在SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、14、15或16中示出的序列的RNA。

40.一种药物组合物，包括权利要求37至39的任何一项所述的寡核苷酸、DNA或RNA，和药学上可接受的载体。

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