CN103374058B - 增血压素固相合成工艺及其中间体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用固相合成技术来生产增血压素H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH的工艺及其中间体。该方法包含以下步骤：(a)制备保护增血压素R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基，R₂、R₃、R₄为侧链保护基，R₅为羧基树脂；(b)在切割试剂的作用下，步骤(a)所得的保护增血压素脱保护并和树脂分离，生成增血压素H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH。本发明提供的合成增血压素的方法环保、高效，对设备要求低，可应用于规模化工业生产。

Description

增血压素固相合成工艺及其中间体和应用

技术领域

本发明属于药物合成工艺领域。更具体地，本发明涉及一种增血压素的固相合成工艺及其中间体和应用。

背景技术

增血压素为增血压药，CAS登记号53-73-6，英文名angiotensinamide或[Asn¹，Val⁵]-angiotensin II，化学结构为H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH(2003版国家药品标准WS-10001-(HD-1448)-2003)。增血压素用于外伤或手术后休克和全身麻醉或腰椎麻醉时所致的低血压症等，可预防或治疗围手术期低血压，作为急救用药治疗休克期低血压，也可用于治疗血管紧张素转换酶抑制剂用药过量且常规治疗无效时。

在心血管稳态平衡受到威胁时，神经激素机制-包括交感神经系统、血管加压素系统和肾素血管紧张素系统被激活，导致血管收缩保持血压和关键器官血流。在低血压(包括脱水和出血)状态下儿茶酚胺、血管紧张素和加压素在调节动脉血压方面起关键作用。增血压素药物为化学合成的血管紧张素II类似物，两者药理作用类似。增血压素能直接兴奋小动脉血管平滑肌，使小动脉强力收缩，从而迅速升高血压。增血压素主要作用于皮肤、内脏和肾脏血管以增加外周阻力，对骨骼肌及脑血管的收缩作用较小，对心肌的兴奋作用微弱，无显著的静脉收缩效应。增血压素还可促进肾上腺皮质分泌甾体激素醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血量增多，血压升高；醛固酮还会作用于下丘脑，下丘脑分泌激素促使垂体释放抗利尿激素(加压素)，促进肾小管对水分的重吸收。增血压素经氨肽酶作用后将N端Asn去除形成七肽血管紧张素III，血管紧张素III的缩血管作用较弱，但促进醛固酮分泌的作用却强于增血压素。增血压素还会诱导肾上腺髓质和交感神经末端大量释放儿茶酚胺，儿茶酚胺通过肾上腺素能受体收缩血管、加强心肌收缩而升高血压。增血压素有时会引起心率减缓但罕见心律不齐；还会引起冠脉收缩而暂时性损害心肌功能，但持续给药会改善心室功能。

多肽的化学合成目前主要有液相合成和固相合成两种方法。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制，并有机会得以纯化；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备与场地。固相合成工艺简单，占用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须优化各步反应条件使得转化率接近100％、而且尽可能避免副反应的发生。专利US2978444中描述了一种液相合成增血压素的方法，该工艺路线运用了聚合式合成策略，具有较高的效率，但以下两个问题使得该路线较难获得高纯度产品：在肽片段缩合反应中，肽片段C端氨基酸、特别是His容易消旋；该路线中反复使用了皂化反应，在强碱性水溶液中Asn侧链容易脱酰胺。另外该方法使用了氢化反应，需要特殊设备和工作条件，还要使用较为昂贵的金属催化剂、且容易导致产品中残留重金属问题。更为重要的是，该专利方法无法实现连续合成，需要占用较多生产设备(如反应釜等)与人力、工时。文献Biochemistry1965，Vol4：2394报道了一种线性合成策略，由于使用了固相合成技术，工艺相对简单，能够保证较高的收率。但该路线使用了氯甲基树脂，最后需要使用氢溴酸将肽链从树脂上解离下来，而且侧链保护基团硝基和苄基在氢化反应中难以完全解离。

多肽药物合成工艺的关键问题之一是对保护氨基酸消旋的控制(中国药物杂2010，Vol 19：102)。专利US6015881对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案。该方案认为在低温下预先活化氨基酸对抑制消旋十分重要。氨基酸按照以下方式预活化：Fmoc保护氨基酸、HOBt、DIPEA在室温下溶解后冷却到0-5℃，然后将HBTU加入到上述溶液中搅拌至溶解。HBTU最后加料是因为在其不存在时活化和消旋都不会发生。该方案在生产实施过程中需要有一套独立的反应釜A用于配料、控温和活化保护氨基酸，将活化保护氨基酸溶液转移至缩合反应釜B中，以及随后的设备清洁工作。更为重要的是，虽然保护氨基酸的OBt酯稳定性良好，但如果在反应釜A中贮存时间稍长，因不能和氨基缩合而走向消旋通路，故而对预活化时间需要严格的控制(J.Org.Chem.1997，Vol62：4307)。故而预活化方案增加了合成工艺的复杂度。

综上所述，现在还缺乏一种高效合成增血压素的方法，因此仍然迫切需要开发新的增血压素的生产工艺。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是克服现有的增血压素固相合成方法采用氯甲基树脂，最后需要使用氢溴酸将肽链从树脂上解离下来，侧链保护基团硝基和苄基在氢化反应中难以完全解离的不足，提供一种新的增血压素的制备方法，该方法不需要使用氢溴酸将肽链从树脂上解离，侧链保护基团硝基和苄基解离完全。本发明还提供上述制备方法中涉及的重要中间体及其应用。此外，本发明还对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案，该方案中配料和保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是：一种增血压素的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(a)制备保护增血压素R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基，R₂、R₃、R₄为侧链保护基，R₅为羧基树脂；

(b)在切割试剂的作用下，步骤(a)所得的保护增血压素脱保护并和树脂分离，生成增血压素H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH。

优选的，步骤(b)所述的切割试剂是常规的弱酸试剂TFA。更优选的，所述的弱酸试剂中还含有TIS和水。最优选的，所述的弱酸试剂为TFA∶TIS∶H₂O体积比为95∶2.5∶2.5的混合物。切割试剂的用量也是常规，较佳的如约100g肽树脂/L切割试剂。

优选的，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别为Boc、Pbf、tBu、Trt、Wang树脂。属于对酸敏感保护基团。

本发明所述的保护增血压素在TFA作用下，通过一步化学反应即可高效解离得到C端为游离羧基的肽段，并同时脱保护，生成增血压素。

优选的，步骤(a)包括以下步骤：

(1)采用固相合成法将氨基保护的苯丙氨酸(保护基团-Phe-OH)固定在羧基树脂上，然后将氨基保护基团脱除，得到连接苯丙氨酸的树脂(H-Phe-羧酸树脂)；

(2)加入氨基保护的脯氨酸(保护基团-Pro-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(3)加入氨基保护侧链保护的组氨酸(保护基团-His(Trt)-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(4)加入氨基保护的缬氨酸(保护基团-Val-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(5)加入氨基保护侧链保护的酪氨酸(保护基团-Tyr(tBu)-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接侧链保护酪氨酸、缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(6)加入氨基保护的缬氨酸(保护基团-Val-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接缬氨酸、侧链保护酪氨酸、缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(7)加入氨基保护侧链保护的精氨酸(保护基团-Arg(Pbf)-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，然后将氨基保护基团脱除，得到连接侧链保护精氨酸、缬氨酸、侧链保护酪氨酸、缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)；

(8)加入氨基由Boc保护的天冬酰胺(Boc-Asn-OH)，在缩合剂的存在下进行缩合反应，得到连接氨基由Boc保护的天冬酰胺、侧链保护精氨酸、缬氨酸、侧链保护酪氨酸、缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂，即保护增血压素R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基Boc，R₂、R₃、R₄为侧链保护基，R₅为羧基树脂(Boc-Asn-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)。

优选的，步骤(1)-(7)任一项所述的氨基保护基团是Fmoc。

优选的，步骤(3)所述的氨基保护侧链保护的组氨酸的侧链保护基是(Trt)；步骤(5)所述的氨基保护侧链保护的酪氨酸的侧链保护基是(tBu)；步骤(7)所述的氨基保护侧链保护的精氨酸的侧链保护基是(Pbf)。

优选的，步骤(1)所述的将氨基由Fmoc保护的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)固定在羧基树脂上的方法可以是常规方法，也可以是以下优选的方法，在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的作用下，在助缩合剂的启动下，氨基由Fmoc保护的苯丙氨酸和经过挥发性有机溶剂溶胀处理的羧基树脂进行缩合反应，得到连接Fmoc保护苯丙氨酸的树脂。

更优选的，步骤(a)包括以下步骤：

(1)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂作用下，在助缩合剂的启动下，氨基Fmoc保护的苯丙氨酸和经过挥发性有机溶剂溶胀处理的羧基树脂进行缩合反应，得到连接Fmoc保护苯丙氨酸的树脂，然后将氨基保护基团Fmoc脱除，得到连接苯丙氨酸的树脂；

(2)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(1)所得的连接苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的脯氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(3)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(2)所得的连接脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链Trt保护的组氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(4)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(3)所得的连接侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的缬氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(5)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(4)所得的连接缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链tBu保护的酪氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(6)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(5)所得的连接侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的缬氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(7)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(6)所得的连接缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链Pbf保护的精氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(8)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(7)所得的连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Boc保护的天冬酰胺进行缩合反应，得到连接氨基Boc保护的天冬酰胺、侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂，即保护增血压素R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基Boc，R₂、R₃、R₄为侧链保护基Pbf、tBu、Trt，R₅为羧基树脂。

更优选的，步骤(1)-(8)中所述的缩合反应的缩合体系包括以下几种中的任何一种，其中第1列AA表示氨基酸，最后一列表示助缩合剂，中间列表示缩合剂，列和列之间用“/”相隔：

(1)AA/HOBt/DIC

(2)AA/HOBt/DCC

(3)AA/TBTU/HOBT/DIPEA或NMM

(4)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM

(5)AA/HCTU/HOBT/DIPEA或NMM

(6)AA/PyBop/HOBT/DIPEA或NMM

(7)AA/Bop/HOBT/DIPEA或NMM

(8)AA/HATU/HOAT/DIPEA或NMM

(9)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM

(10)AA/HCTU/HOBt/DIPEA或NMM

(11)AA/CDI/HOBt

(12)AA/CDI/HOAT。

其中，DCC性质和DIC相似，部分氨基酸偶联效果稍优于DIC，但容易结块，操作不便，缩合过程中，中间体不易洗涤赶紧，因此本发明优选DIC。BOP、PyBOP、HATU、HBTU、HCTU均是鎓盐类缩合剂，HATU、HCTU的效果比HBTU好，缩合效率高，但其价格贵。有机碱NMM较DIPEA碱性弱，其他性质基本相似，根据情况可互换。

最优选的，步骤(1)中所述的缩合剂为DIC和HOBt，助缩合剂为DMAP；步骤(2)-(7)所述的缩合剂为HBTU和HOBT，助缩合剂为有机碱，所述的有机碱为DIPEA，NMM或collidine；步骤(8)所述的缩合剂为HOBT，助缩合剂为DIC。

进一步优选的，步骤(7)所述的缩合剂为HBTU和HOBT，助缩合剂为有机碱，并且步骤(7)还包括第二次缩合反应，包括以下步骤，在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂HOBT的存在下，在DIC的启动下，所得的连接肽的树脂和氨基Fmoc保护侧链Pbf保护的精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂(H-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-羧酸树脂)。

优选的，本发明合成增血压素的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，包括洗涤、抽干。在任一保护氨基酸缩合时，无需在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中。可参见图6的示意图。

优选的，在进行步骤(1)-(8)中的缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂(优选DMF和DCM)，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入缩合反应启动剂启动缩合反应。本发明每次连接保护氨基酸都采用了氮气吹入使DCM挥发降温技术，向反应混合物中通入氮气使挥发性溶剂挥发可以保持反应体系温度在15-20℃。在加入有机碱DIPEA或DIC启动反应之前都需要利用DCM挥发降温至15-20℃，反应体系温度在15-20℃，当加入有机碱启动缩合反应后，通过保温装置使缩合反应体系温度一直稳定在22-28℃。因此，优选的，步骤(1)-(8)启动缩合反应后缩合反应的温度为22-28℃，更佳地为25℃。而缩合反应的反应时间如常规，一般是监测达到反应终点为止。

更优选的，所述的非挥发性有机溶剂选自DMF和DMSO中的一种或两种。

更优选的，所述的挥发性有机溶剂选自DCM和Et₂O中的一种或两种。

优选的，所述非挥发性有机溶剂和挥发性有机溶剂的用量比是3∶1-3.5∶1(体积比)。

更优选的，所述的有机碱选自DIPEA，NMM(N-甲基吗啉)或collidine(2，4，6-三甲基吡啶)。

更优选的，步骤(1)所得的连接苯丙氨酸的树脂的载样量为0.7-0.8mmol/g。

本发明的方法中，缩合反应前或后的步骤都是常规步骤，如脱保护反应、对反应产物肽树脂的洗涤、最后将多肽从树脂上切割下来并脱去保护基等步骤，当然也包括对树脂的溶胀等步骤。

本发明中所述的脱除氨基保护基团Fmoc的反应是本领域常规技术，比如加入哌啶即可在温和的条件下脱除。较佳的是DMF溶剂中，将肽树脂和哌啶进行脱保护反应。优选25℃反应20分钟，进行两次反应即可。

本发明所述的固相合成反应中，各步反应完成后，对于反应产物的分离纯化都是采用常规固相合成中的技术，将接肽树脂洗涤、抽干即可。洗涤采用常规固相合成中的洗涤用剂，一般包括反应溶剂或甲醇等。

本发明的技术方案之二是：一种保护增血压素，其是连接氨基由Boc保护的天冬酰胺、侧链保护精氨酸、缬氨酸、侧链保护酪氨酸、缬氨酸、侧链保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的羧基树脂(即R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基Boc，R₂、R₃、R₄为侧链保护基，R₅为羧基树脂)。

本发明的技术方案之三是：所述的保护增血压素在制备增血压素多肽药物中的应用。

本发明对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案，该方案中配料和保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。该方案如下：一种一步反应不需预活化却能够抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋的固相合成法制备多肽的方法，包括以下步骤：将保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂(优选DMF和DCM)，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后加入缩合反应启动剂启动缩合反应。启动缩合反应后缩合反应的温度优选为22-28℃，更优选25℃。

本发明的一较佳实施例为：一种增血压素的制备方法，包括以下步骤：在DMF和DCM溶剂中，以HBTU/HOBt或DIC/HOBt为缩合剂，以DIPEA为缩合反应启动剂，将Fmoc或Boc保护氨基酸连接到Wang树脂上，然后脱去氨基酸N端保护基团，反复循环，逐个接上的保护氨基酸依次为：

(1)Fmoc-Phe-OH，

(2)Fmoc-Pro-OH，

(3)Fmoc-His(Trt)-OH，

(4)Fmoc-Val-OH，

(5)Fmoc-Tyr(tBu)-OH，

(6)Fmoc-Val-OH，

(7)Fmoc-Arg(Pbf)-OH，

(8)Boc-Asn-OH，

从而获得保护八肽增血压素树脂，再用切割试剂TFA∶TIS∶H₂O(体积比95∶2.5∶2.5)处理获得增血压素。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供的合成增血压素的方法不需使用氢溴酸，环保、高效，对设备要求低，可应用于规模化工业生产。并且产物纯度高、产率高，纯度可达99.5％以上。本发明中，优选的，所有反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失。缩合反应无需在反应器之外低温预活化，节省了生产设备、人力与工时。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1：本发明增血压素合成过程图。

图2：HBTU缩合Boc-Asn-OH所得增血压素粗品HPLC图。

图3：DIC/HOBt缩合Boc-Asn-OH所得增血压素粗品HPLC图。

图4：试验获得的增血压素醋酸盐纯品HPLC图谱。

图5：试验获得的增血压素醋酸盐质谱图。

图6：在线低温预活化示意图。

具体实施方式

本发明中，术语“羧基树脂”是树脂中与(第一个)氨基酸直接相连的反应基团是羧基的树脂。如王氏树脂。羧基树脂，通常加入适当的缩合剂，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定。

本发明是在Wang树脂上缩合氨基酸，所有的化学反应均在一个反应器内连续完成，简化了传统固相合成中使用的低温预活化步骤。这对反应体系的变温控制提出了特殊要求。在提高合成效率的同时，也在中间体纯化方面受到很多限制。故而连续合成对化学反应、特别是缩合反应的效率方面有更高的要求。本发明的特别之处在于优化了各缩合步骤的最佳反应条件，使得高效、快速、连续合成也能获得有工业应用价值的高产率、高纯度产品。这将在以下几点中得到更加具体的体现。

第一，本发明提供一种可以规模化高效生产增血压素的合成路线(图1)。使用Wang树脂线性合成保护增血压素，无需HBr或HF等处理，即可在TFA作用下高效解离得到C端为游离羧基的肽段；用Pbf保护Arg侧链、Trt保护His侧链、tBu保护Tyr侧链，确保在TFA处理时高效解离得到增血压素。最后一步缩合反应原料使用Boc-Asn-OH，而非常用原料Fmoc-Asn(Trt)-OH，这样可以减少一步脱Fmoc反应。更为重要的是，有文献报道肽链N端Asn侧链若用Trt保护，该保护基团对三氟乙酸相当稳定，需要长时间处理才能完全除去(Pept.Res.1992，Vol5：145)，这样会引起其它的副反应。DIC与HBTU是多肽合成工业中的常用缩合剂。HOBt是常用的缩合添加剂，保护氨基酸与HOBt在缩合剂存在下形成的OBt活化酯，兼具良好的酰胺化反应性能与稳定性。一般而言，HBTU的肽键缩合速率较快，相应也会减少副反应发生的几率，保护氨基酸2倍投料，过量1倍以内即可缩合完全。

第二，本发明有效避免使用Asn侧链脱水副反应。Asn若无侧链保护，在用DCC或BOP缩合时容易导致侧链脱水副反应，使用DCC/HOBt可以避免该副反应(J.Org.Chem.1980，Vol45：55；Int.J.Pept.ProteinRes.1989，Vol34：287)。在用HBTU缩合Fmoc-Asn-OH时，增血压素产物中存在分子量为[M-18]的杂质，推测可能为Asn侧链酰胺脱水(图2)。在改用DCC/HOBt后，有效地抑制了该副产物的生成。但考虑到在工业化生产中，DCC的产物难以处理，尝试用DIC/HOBt来替换DCC/HOBt，亦能抑制[M-18]副产物的生成，可将相对面积比控制在2％以下(图3)。

第三，本发明避免了保护氨基酸预活化的繁琐操作。HBTU是非常高效的缩合试剂，需要有机碱如DIPEA来启动缩合反应。反应体系加入DIPEA过程中有大量热能释放出来，会出现温度骤升效应。该放热效应经常同一些氨基酸在缩合过程中的消旋副反应相联系，如Fmoc-His(Trt)-OH。一些多肽合成的经验表明，如果将Fmoc-His(Trt)-OH和HBTU、DIPEA在一个预活化反应器中低温混合以抑制放热效应，然后将经过预活化处理的溶液加入到氨基酸缩合反应器中，会显著抑制His的消旋(专利US6015881)。但在实际操作过程中，这种预活化的时间难以掌握，如果氨基酸已被活化而没有和氨基接触反应，也会增加消旋副反应的几率。因此，最好的解决方案是在氨基酸缩合反应器中实现即时的变温操作，使得在缩合全程中的温度始终保持在固定值。本发明将反应器的缩合温度稳定控制在22-28℃，即使是Fmoc-His(Trt)-OH的缩合也无需预活化。保护氨基酸、HBTU和HOBT先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物的溶剂含有DMF和DCM。然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃。然后滴加DIPEA，这样保证了保护氨基酸活化后不受环境高温的影响，而且一旦氨基酸被活化后即能有机会和氨基缩合。这一方法操作简单，所得产品质量与预活化方案相当。

第四，本发明在Wang树脂上高载样量连续合成保护增血压素。Wang树脂是一种良好的连续合成支持物，但随着载样量的增高，会在空间上造成缩合反应困难、导致缩合不完全。很显然，从工业应用角度考虑，高载样量会有效降低树脂在合成中所占的物料成本比例、减小反应釜的体积、减少溶剂用量。保护增血压素的合成中需要缩合体积庞大的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，当Fmoc-Phe-Wang树脂的载样量高于0.7mmol/g后，经常会导致Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合难以完全，而且增加投料比也不能解决该问题，在用醋酸酐封头后才能在茚三酮反应中得到阴性结果。本发明通过Fmoc-Arg(Pbf)-OH的二次缩合，解决了高载样量与缩合反应不完全的矛盾，实现了在Wang树脂上高载样量(Fmoc-Phe-Wang树脂，0.7-0.8mmol/g)连续合成保护增血压素。

下面进一步描述本发明的技术特征，这些技术特征使得本发明有别于一般方法，能够确保增血压素的高效工业化生产。

1.Fmoc-Phe-Wang树脂的制备：

树脂预处理：将Wang树脂用DMF洗涤一次，再用DCM溶胀30min，抽干。将经过预处理的Wang树脂与Fmoc-Phe-OH、HOBt、DIC和DMF、DCM混合，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，缓慢滴加DMAP后，控制温度在22-28℃反应16-20小时，抽干，DMF洗涤两次，加入Pyridine/Ac₂O/DCM溶液，反应2-3小时，用DMF，MeOH交叉洗涤两次，抽干获得Fmoc-Phe-Wang树脂。DMF体积数(mL)为Wang树脂质量数(g)的6-8倍。将Wang树脂上活性基团的总摩尔数定义为n，则Fmoc-Phe-OH、HOBt、DIC的摩尔数均为3n；DMAP的摩尔数为0.2n；Pyridine和Ac₂O的摩尔数为10n。

2.Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤1的Fmoc-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MeOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Fmoc-Pro-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，MeOH、DMF交叉洗涤，抽干；得到Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Fmoc-Pro-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。

3.Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤2的Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MEOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Fmoc-His(Trt)-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至四氯苯醌检测阴性，抽干，MeOH、DMF交叉洗涤，抽干；得到Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。

4.Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤3的Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MEOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Fmoc-Val-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，MeOH、DMF交叉洗涤，抽干得到Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Fmoc-Val-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。

5.Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤4的Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MEOH，DCM洗交叉涤，抽干。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，MeOH、DMF交叉洗涤，抽干得到Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。

6.Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤5的Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MEOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Fmoc-Val-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，MeOH、DMF交叉洗涤，抽干得到Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Fmoc-Val-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。

7.Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤6的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MEOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、HBTU、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，滴加DIPEA后，控制温度在22-28℃反应2-3小时。若茚三酮检测阴性，抽干，用MeOH、DMF交叉洗涤，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、HOBt和HBTU的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIPEA的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的3倍。若茚三酮检测非阴性，DMF洗涤两次，抽干，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温15-20℃，滴加DIC后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，用MeOH、DMF交叉洗涤，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂，Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩尔数是Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的1倍；HOBt和DIC的摩尔数分别为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；

8.Boc-Asn-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备：

在步骤7的Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂中，加入20％Pip/DMF溶液脱Fmoc，在22-28℃反应两次，第一次10min，第二次20min，抽干，用DMF，MeOH，DCM交叉洗涤，抽干。加入Boc-Asn-OH、HOBt和DMF、DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温15-20℃，滴加DIC后，控制温度在22-28℃反应2-3小时至茚三酮检测阴性，抽干，用DMF，MeOH交叉洗涤，得到保护基增血压素。20％Pip/DMF、DMF、DCM和MeOH的体积数(mL)分别为Fmoc-Phe-Wang树脂质量数(g)的6-8倍；Boc-Asn-OH的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍；DIC、HOBt的摩尔数为Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的4倍。

9.增血压素的制备

将保护增血压素加入到切肽试剂TFA∶TIS∶H₂O中，反应2-3小时，抽滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加冰冷甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集增血压素粗品。粗肽经反相高效液相色谱纯化得到白色纯品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1：Fmoc-Phe-Wang树脂的制备

称量Wang树脂50g(100-200，1.23mmol/g)，装入砂芯反应器，用500mL DMF洗涤一次，抽干，再用500mL DCM使树脂充分溶胀，抽干。

加Fmoc-Phe-OH(MW：387.4，Wang树脂摩尔数的3倍)71.5g，HOBt(MW：135.13，Wang树脂摩尔数的3倍)24.9g，DIC(MW：126.2，Wang树脂摩尔数的3倍)28.9mL，300mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至16℃，缓慢加入DMAP(MW：122，Wang树脂摩尔数的0.2倍)1.5g，将混合物在26℃搅拌18小时。真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Pyridine(MW：79.1，Wang树脂摩尔数的10倍)49mL，Ac₂O(MW：102.09，Wang树脂摩尔数的10倍)58mL，500mL DCM，将混合物在27℃搅拌3小时，真空抽干，用DMF，MeOH交叉洗涤两次，真空抽干至恒重。测得Fmoc-Phe-Wang树脂的替代度为0.80mmol/g(Fmoc-Phe-Wang树脂总重75g，总摩尔数60mmol)。

实施例2：Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pi p/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pi p/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.5g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌2.5小时，四氯苯醌检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例3：Fmoc-Hi s(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-His(Trt)-OH(MW：619.7，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)74.4g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mLDCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在23℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例4：Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Val-OH(MW：339.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.7g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至20℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌2小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例5：Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：459.5，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)55.1g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mLDCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在26℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例6：Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Val-OH(MW：339.4，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)40.7g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在28℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例7：

Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)77.9g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，HBTU(MW：379.25，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)45.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15℃，滴加DIPEA(MW：129.24，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)31.4mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈非阴性，真空抽干，DMF洗涤两次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW：648.8，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的1倍)39.0g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)16.2g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至18℃，滴加DIC(MW：126.2，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)18.8mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。

实施例8：

Boc-Asn-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂的制备

加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌10分钟，真空抽干，再加入500mL 20％Pip/DMF溶液，在25℃搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗涤一次，MeOH洗涤两次，DMF洗涤一次，DCM洗涤一次，真空抽干。加Boc-Asn-OH(MW：232.1，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的2倍)27.8g，HOBt(MW：135.13，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的4倍)32.5g，350mL DMF，100mL DCM，利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用DCM的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至19℃，滴加DIC(MW：126.2，Fmoc-Phe-Wang树脂摩尔数的4倍)37.5mL，将混合物在25℃搅拌3小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，MeOH洗涤一次，DMF洗涤两次，MeOH洗涤三次，真空抽干至恒重，得到保护血管紧张树脂157.4g。

实施例9：H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH的制备

按TFA∶TIS∶H₂O＝95∶2.5∶2.5(体积比)配制切肽溶液1.6L，冷冻后，在搅拌的情况下，将157.4g的保护增血压素树脂加入到切肽溶液中，26℃搅拌2.5小时。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，加甲基叔丁基醚沉淀，离心沉降收集到70.5g增血压素(MW：1030.5)粗品，合成收率为114％。

实施例10：H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH的精制

将70.5g增血压素粗品用5％ACN/水(V/V)溶解，配成10g/L，利用制备型高效液相在0.1％TFA/水(V/V)和0.1％TFA/ACN(V/V)梯度洗脱，分部收集需要的组分并检测，将合格的组分再次上制备柱脱盐，用水和ACN梯度洗脱，向得洗脱液中加入HAc，经减压旋蒸浓缩并除ACN，最后经冷冻干燥得H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH xHAc白色固体，HPLC分析纯度为99.5％(见图4)。质谱鉴定结构正确(见图5)。仪器：美国Waters公司QTOF Premier质谱仪，极性：正，毛细管电压：3.0kV，采样锥：45V，碰撞能量：4EV离子源温度：100℃，去溶剂化温度：350℃，脱溶剂气体：600l/hr，扫描范围：M/z为1002000，扫描时间：0.3秒，扫描间的时间：0.02秒。

讨论

使用Wang树脂合成多肽的一个重要障碍是二酮哌嗪问题，即在缩合两个氨基酸后，在用有机碱脱去氨基保护基Fmoc时，容易发生两肽自身环化形成二酮哌嗪而从树脂上脱落，合成产率降低。本发明中详细考察了合成产物的收率，没有发现明显的收率下降现象，由此推测无严重的二酮哌嗪问题。

该方法工艺简单、过程可控，可以稳定制备高纯度增血压素，非常适合于自动化的高效生产。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

所用的原料的名称和生产厂商：

原料                 生产厂商

Wang树脂             天津南开和成科技有限公司

保护氨基酸           上海吉尔生化有限公司

本发明中所有的缩略语的确切名称如下：

DMF：N，N’-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Fmoc：9-芴甲氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

HOBt：1-羟基苯并-三氮唑

DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺

DMAP：4-二甲氨基吡啶

Pyridine(PipPy)：哌啶吡啶

Piperidine：哌啶

Ac₂O：乙酸酐

MeOH：甲醇

HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺

Trt：三苯甲基

tBu：叔丁基

PbfPbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

TFA：三氟乙酸

TIS：三异丙基硅烷

DCC：环己基碳二亚胺

BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐

ACN：乙腈

HAc：醋酸

Claims (5)

1.一种增血压素的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(a)制备保护增血压素R1-Asn-Arg(R2)-Val-Tyr(R3)-Val-His(R4)-Pro-Phe-R5，其中，R1为氨基保护基，R2、R3、R4为侧链保护基，R5为羧基树脂；

(b)在切割试剂的作用下，步骤(a)所得的保护增血压素脱保护并和树脂分离，生成增血压素H-Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH；

所述步骤(a)制备保护增血压素的所有化学反应在同一个反应器内依次连续完成，在任一保护氨基酸缩合时，无需在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中，在进行缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在含有肽树脂的反应混合物中，该混合物中含有挥发性有机溶剂DCM或Et₂O和非挥发性有机溶剂DMF或DMSO组成的溶剂，然后利用氮气流和肽树脂充分均匀接触，并利用挥发性有机溶剂的挥发吸热将整个反应系统迅速降温至15-20℃，然后启动缩合反应；启动缩合反应后缩合反应的温度为22-28℃，反应时间是监测达到反应终点为止；

所述保护增血压素R1、R2、R3、R4、R5分别为Boc、Pbf、tBu、Trt、Wang树脂；

所述步骤(b)的切割试剂为TFA︰TIS︰H₂O体积比为95︰2.5︰2.5的混合物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)包括以下步骤：

(1)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂作用下，在助缩合剂的启动下，氨基Fmoc保护的苯丙氨酸和经过挥发性有机溶剂溶胀处理的羧基树脂进行缩合反应，得到连接Fmoc保护苯丙氨酸的树脂，然后将氨基保护基团Fmoc脱除，得到连接苯丙氨酸的树脂；

(2)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(1)所得的连接苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的脯氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(3)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(2)所得的连接脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链Trt保护的组氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(4)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(3)所得的连接侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的缬氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(5)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(4)所得的连接缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链tBu保护的酪氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(6)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(5)所得的连接侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护的缬氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(7)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(6)所得的连接缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Fmoc保护侧链Pbf保护的精氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂；

(8)在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂的存在下，在助缩合剂的启动下，步骤(7)所得的连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂和氨基Boc保护的天冬酰胺进行缩合反应，得到连接氨基Boc保护的天冬酰胺、侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂，即保护增血压素R₁-Asn-Arg(R₂)-Val-Tyr(R₃)-Val-His(R₄)-Pro-Phe-R₅，其中，R₁为氨基保护基Boc，R₂、R₃、R₄为侧链保护基Pbf、tBu、Trt，R₅为羧基树脂。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)-(8)中所述的缩合反应的缩合体系包括以下几种中的任何一种，其中第1列AA表示氨基酸，最后一列表示助缩合剂，中间列表示缩合剂，列和列之间用“/”相隔：

(1)AA/HOBt/DIC

(2)AA/HOBt/DCC

(3)AA/TBTU/HOBT/DIPEA或NMM

(4)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM

(5)AA/HCTU/HOBT/DIPEA或NMM

(6)AA/PyBop/HOBT/DIPEA或NMM

(7)AA/Bop/HOBT/DIPEA或NMM

(8)AA/HATU/HOAT/DIPEA或NMM

(9)AA/HATU/HOBT/DIPEA或NMM

(10)AA/HCTU/HOBt/DIPEA或NMM

(11)AA/CDI/HOBt

(12)AA/CDI/HOAT。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的缩合剂为DIC和HOBt，助缩合剂为DMAP；步骤(2)-(7)所述的缩合剂为HBTU和HOBT，助缩合剂为有机碱，所述的有机碱为DIPEA，NMM或collidine；步骤(8)所述的缩合剂为HOBT，助缩合剂为DIC。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)还包括第二次缩合反应，包括以下步骤，在挥发性有机溶剂和非挥发性有机溶剂组成的溶剂中，在缩合剂HOBT的存在下，在助缩合剂DIC的启动下，所得的连接肽的树脂和氨基Fmoc保护侧链Pbf保护的精氨酸进行缩合反应，然后进行氨基保护基团Fmoc脱除反应，得到连接侧链Pbf保护精氨酸、缬氨酸、侧链tBu保护酪氨酸、缬氨酸、侧链Trt保护组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸的树脂。