CN103333807B - 一株降解拟除虫菊酯类农药的烟色曲霉菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株降解拟除虫菊酯类农药残留的烟色曲霉（Aspergillusfumigatus）菌株WJ-1，该菌株能够同时降解氯氟氰菊酯和氯氰菊酯两种拟除虫菊酯类农药。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.7515。该菌株能够分别将５０ｍｇ／Ｌ氯氟氰菊酯和氯氰菊酯农药在4天内降解98.9％和97.9%，并能够维持稳定的降解能力。本发明提供的新菌株，为拟除虫菊酯洗涤剂的研发和控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留提供了研究基础，应用前景广阔。

Description

一株降解拟除虫菊酯类农药的烟色曲霉菌

技术领域

本发明提供一株可降解拟除虫菊酯类农药的菌株，属于应用微生物学科领域。

背景技术

拟除虫菊酯是人工合成的模拟天然除虫菊酯的化合物。目前已占杀虫剂市场的20%，在我国的施用面积占总施用面积的三分之一以上。拟除虫菊酯类农药的残留对环境造成了一定的影响。随着我国对某些高毒有机磷农药的禁用，拟除虫菊酯农药成为主要的替代品之一，拟除虫菊酯类农药的残留问题也越来越受到人们重视。

解决农药残留主要有两种方式：化学处理法和生物修复。生物修复方法具有安全、成本低、无二次污染的特点。利用生物修复解决拟除虫菊酯类农药的残留问题已成为目前研究的热点。目前国内外研究已分离到大量能降解或转化拟除虫菊酯类农药的微生物类群，主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱菌属（Alcaligenes）和沙雷氏菌属（Serratia）鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）等。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够高效降解氯氟氰菊酯和氯氰菊酯农药的菌株——烟色曲霉菌（Aspergillus fumigatus）WJ-1。

本发明烟色曲霉菌（Aspergillus fumigatus）WJ-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.7515，保藏日期：2013年04月24日。

本发明烟色曲霉菌WJ-1的菌落特征为：在固体培养基上呈圆形菌落，中心稍凸起，其他部分平坦，质地丝绒状，分生孢子结构大量，表面丝绒状。近于带浅紫灰的橄榄绿色菌株。菌落反面带黄色。

本发明从农药厂的活性淤泥中获得一系列菌株，经分离纯化后，得到一株能够有效降解氯氟氰菊酯的菌株，命名为WJ-1。经ITS序列比对分析，将其鉴定为烟色曲霉菌（Aspergillus fumigatus）。经过查阅已发布的农药降解菌株的文献，了解到该种属在拟除虫菊酯类农药降解方面还未见正式报道。实验结果表明：在LB液体培养基 pH 7.0、温度37℃、200 r/min条件下培养4d。其对50 mg/L氯氟氰菊酯的降解率能够达到98.9%。同时，菌株对氯氰菊酯的降解率也达到了97.9%。为其在生物修复中的应用提供一定的理论基础。

附图说明

图1为烟色曲霉菌的菌落形态照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。：

实施例1

拟除虫菊酯类农药降解菌的筛选与鉴定

（1）培养基

无机盐培养基：NaCl 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O  0.1g/L,，pH 7.0。

富集培养基：NaCl 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，酵母提取物 1.0g/L，pH 7.0。

Luria-Bertani培养基：NaCl 10.0g/L，酵母提取物 5.0g/L，蛋白胨  10.0g/L,，pH 7.0。

上述培养基均为12l℃，灭菌20 min，固体培养基的琼脂用量为1.5％。

（2）菌株的分离纯化

取农药厂废水排放处的土壤，配制50%的悬浮液，取1 mL接种于含50 mg/L氯氟氰菊酯的100 mL富集培养基中，37℃，180rpm震荡培养6 d。待菌长出后，取1 mL菌液接入相同的培养基中，37℃，180rpm震荡培养。传代过程中，氯氟氰菊酯的浓度逐步提高到450 mg/L，6 d传代一次。将富集后的菌液以10%的接种量接入无机盐培养基中，培养基中氯氟氰菊酯的浓度为50 mg/L，移种3～4次。将无机盐培养基的菌液以一定稀释度涂布于LB固体培养基平板上，置于37 ℃恒温培养。挑取平板上的菌落，多次划线分离、纯化菌株。选取生长快，菌落形态规则的菌株斜面４℃保藏。

实施例2

拟除虫菊酯降解率测定

（1）       样品前处理

从保藏的斜面上挑单菌落到LB液体培养基中扩大培养，37℃，180rpm震荡培养过夜。取1 mL菌液接种于含50 mg/L氯氟氰菊酯的100 mL 富集培养基中；空白对照以1 mL无菌水代替1 mL菌液。37℃，180rpm震荡培养4d。吸取10 mL菌液于具塞量筒中，加入50 mL乙腈和适量NaCl，剧烈震荡1 min，静置15 min。吸取10 mL上层有机相于10 mL离心管中，过柱，除去杂质。氮气吹干，正己烷定容至5 mL，取2 mL做气相色谱用。

（2）       气相色谱条件

拟除虫菊酯农药残留量采用气相色谱仪(Agilent6890N，USA)检测。Agilent 6890N配备了ECD检测器，色谱柱为：HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane Capillary 30 m×320 μm×0.25 μm (Agilent 19091J-413，325 ℃ Max)。检测条件采用程序升温法：80℃起温，保持2min；以10℃/min升至140℃，保持1min；最后以20℃/min升至280℃，保持8min；进样量为1μL；流速为1.7ml/mL；进样口温度：230℃；检测室温度：330℃。

降解率(%)=(A₀-A₁)/A₀×100

式中，A₀为对照组样品农药残留浓度；

A₁为实验组样品农药残留浓度。

实施例3

菌种鉴定

观察ＬＢ平板上菌株的菌落形态。并对筛选得到的菌株进行ITS鉴定。基本过程如下：提取菌的总DNA，以通用引物：

ITS4：5’-TCCTCCGCTYATrGATATGC一3’：

ITS5：5’一GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG一3’。

扩增ITS片段。测得的ITS序列在Genbank进行Blast比对分析与烟色曲霉菌（Aspergillus fumigatus）相似性最高，达到99%。

实施例4

菌株的降解实验

将菌株接入到装有50 mL的LB液体培养基的锥形瓶中。含氯氟氰菊酯浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L，37℃，摇床转数200 r／min，培养4d，测氯氟氰菊酯的降解率，以未接入菌株的样品为空白对照。

将菌株接入装有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中，瓶中氯氟氰菊酯的浓度为50 mg/L，分别调节pH为6.0、7.0、8..0、9.0，37℃，摇床转数200 r／min，培养4d，测氯氟氰菊酯的降解率，以未接入菌株的样品为空白对照。

将菌株接入装有50 mL 无机盐液体培养基的锥形瓶中，瓶中氯氟氰菊酯的浓度为50 mg/L。并另外设两组分别加入 1 mg/L的葡萄糖和酵母粉。37℃，摇床转数200 r／min，培养4d，测氯氟氰菊酯的降解率，以未接入菌株的样品为空白对照。

    实验结果表明菌株WJ-1的降解效果受到外界因素的影响较大。在有外加碳源存在时，菌株的降解效率比以氯氟氰菊酯为唯一碳源有了极大的提高。菌株的生长pH范围较宽，在pH为中性和弱酸性时对氯氟氰菊酯的去除效果最好且没有明显差异。菌株对氯氟氰菊酯的耐受能力高，达到500 mg/L，但是其降解率随着氯氟氰菊酯浓度的增加而明显降低。菌株WJ-1的在LB液体培养基 pH 7.0、温度37℃、200 r/min条件下培养4d。其对50 mg/L氯氟氰菊酯的降解率能够达到98.9%。同时，菌株对氯氰菊酯的降解率也达到了97.9%。对环境中拟除虫菊酯类农药的修复具有一定的积极意义。

Claims (2)

1.一株降解拟除虫菊酯类农药的烟色曲霉菌（Aspergillus fumigatus）WJ-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7515。

2.如权利要求1所述烟色曲霉菌在降解氯氟氰菊酯中的应用。