CN103301290A - 复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种复方龙眼多糖免疫固本方剂，由36g/kg桂圆益气补血汤中加入龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg而得；所述的桂圆益气补血汤由以下原料制备而成：龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g。将龙眼多糖进行分离提取，除蛋白、色素和除小分子后，与桂圆益气补血汤混合即得所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂。本发明具有益气补血和安神健脾的功效；并能够激活免疫细胞，改善机体的免疫功能。

Description

复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法，属于保健药物技术领域。

背景技术

龙眼中含有丰富的多糖，多糖是一种活性物质，已被国际医学界公认为具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖和抗病毒等作用。

中国专利03100545.4公开了一种龙眼、枸杞多糖保健液，由龙眼多糖10-90重量份和枸杞多糖10-90重量份组成，还公开保健液中可以添加人参、黄芪、党参、橄榄油以及其他中药材，该多糖保健液具有较高的生物活性和免疫性，属于营养性和功能性食品，有利于保持人体的健康。但是，该保健液没有公开龙眼多糖与其他中药材的合理配比。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法，通过龙眼多糖和其他中药材的配比优化，提高其免疫调节功能。

本发明实现上述目的所采取的技术方案是：一种复方龙眼多糖免疫固本方剂，由36g/kg桂圆益气补血汤中加入龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg而得；所述的桂圆益气补血汤由以下原料制备而成：龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g。

所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）龙眼粗多糖的分离提取：市购龙眼干果剥壳去核后，取出果肉阴干，称重，按质量体积比为龙眼肉:蒸馏水=1:4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，68℃下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼粗多糖；

（2）将龙眼粗多糖除蛋白和色素：称取龙眼粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭活5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液；将已去除蛋白的龙眼粗多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼粗多糖；

（3）除小分子：将已去除蛋白和色素的龙眼粗多糖进行溶解后装入已用蒸馏水浸泡30min除去杂质的透析玻璃纸中，夹于烧杯边缘，加入蒸馏水至完全没过玻璃纸；将蒸馏水置于5000ml广口瓶中，以1滴/s的速度通过玻璃管滴入装有透析玻璃纸的烧杯中，透析48h除去小分子杂质，然后减压浓缩，95%乙醇醇沉，即得纯化的龙眼多糖；

（4）桂圆益气补血汤的制备：称取龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g，加水浸泡30min，加入12倍量水，武火煮沸改用文火继续煎煮36min，煎煮2次，合并水煎液，3000rpm/min离心10min除杂，将水煎液浓缩至生药浓度为36g/kg；

（5）在生药浓度为36g/kg的桂圆益气补血汤中加入纯化的龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg，即得所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂。

本发明具备的有益效果是：以中医临床经验方桂圆益气补血汤和龙眼多糖配伍而成，其中桂圆益气补血汤由龙眼肉、黄芪、山药、当归和甘草组成，方中龙眼肉性温味甘为君药，主入心脾两经，有补益心脾，养血安神的功效；黄芪和山药为臣，均入脾肺两经，可补气生血，当归同为臣药助龙眼肉养血补心，甘草味甘，调和诸药。全方具有益气补血，安神健脾的功效。多糖类化合物是一种理想免疫调节剂，能激活免疫细胞，改善机体的免疫功能，而对正常细胞却无毒副作用。将多糖与中药方剂的首度联合应用，体现中医药继承创新的新特色。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

一种复方龙眼多糖免疫固本方剂，由36g/kg桂圆益气补血汤中加入龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg而得；所述的桂圆益气补血汤由以下原料制备而成：龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g。

实施例2

实施例1所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）龙眼粗多糖的分离提取：市购龙眼干果剥壳去核后，取出果肉阴干，称重，按质量体积比为龙眼肉:蒸馏水=1:4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，68℃下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼粗多糖；

（2）将龙眼粗多糖除蛋白和色素：称取龙眼粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭活5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液；将已去除蛋白的龙眼粗多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼粗多糖；

（3）除小分子：将已去除蛋白和色素的龙眼粗多糖进行溶解后装入已用蒸馏水浸泡30min除去杂质的透析玻璃纸中，夹于烧杯边缘，加入蒸馏水至完全没过玻璃纸；将蒸馏水置于5000ml广口瓶中，以1滴/s的速度通过玻璃管滴入装有透析玻璃纸的烧杯中，透析48h除去小分子杂质，然后减压浓缩，95%乙醇醇沉，即得纯化的龙眼多糖；

（4）桂圆益气补血汤的制备：称取龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g，加水浸泡30min，加入12倍量水，武火煮沸改用文火继续煎煮36min，煎煮2次，合并水煎液，3000rpm/min离心10min除杂，将水煎液浓缩至生药浓度为36g/kg；

（5）在生药浓度为36g/kg的桂圆益气补血汤中加入纯化的龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg，即得所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂。

实施例3

实施例1和实施例2所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂的活性研究

发明人将生药浓度为36g/kg的桂圆益气补血汤分别与龙眼多糖高、中、低不同剂量进行配伍，研究配伍后对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。

（1）动物分组及造模

单一性别昆明种小鼠70只，按体重随机分为7组，分别为：空白对照组、阴性对照组、单用药治疗组与合用药治疗组。实验时程为4周。环磷酰胺溶于生理盐水，除空白对照组腹腔注射生理盐水外，其余每组隔3d腹腔注射一次环磷酰胺（Cy），20mg/kg，容量为10ml/kg，制造免疫低下模型。空白和阴性对照组每天灌胃生理盐水予以治疗，给药容积为10ml/kg；单独给药组分别给予益气补血汤36g/kg或龙眼多糖160mg/kg；合用给药组分别给予益气补血汤和龙眼多糖320mg/kg、160mg/kg、80mg/kg。

（2）主要指标检测方法

A、小鼠免疫脏器指数的测定

摘眼球放血处死小鼠，剥取脾脏，并将周围组织剥离干净后称重，按下式计算免疫脏器指数：

脾脏指数=脾脏平均重量(mg)/平均体重(g)

B、腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验

各组小鼠处死前lh，每只小鼠腹腔内注射4%SRBC0.5ml，1h后小鼠眼球摘除取血处死，75%乙醇浸泡后，拿入无菌操作台下进行无菌操作。用注射器给每只小鼠腹腔注入2ml RPMI1640培养液，轻揉小鼠腹部lmin，用尖吸管吸取腹腔液，3000rpm离心10min，弃上清，沉淀物中加1ml含胎牛血清的RPMI1640培养液，重悬细胞，计数，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml。取腹腔巨噬细胞悬液100μl加入96孔细胞培养板中，每个样本设三个复孔，放入37℃，5%CO₂培养箱中孵育2h，倒去培养液，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞单层，每孔再加入100μl0.072%中性红溶液，37℃，5%CO₂培养箱中继续培养3h之后，用不含胎牛血清的RPMI1640培养液清洗3遍，再每孔加入细胞溶解液(无水乙醇：0.1mol/L冰乙酸=l：l)100μl4℃冰箱放置过夜，次日在酶标仪波长570nm处测吸光度OD值。

C、小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖能力的测定方法

小鼠脾脏细胞的体外培养方法：小鼠取血后处死，于无菌环境中取出脾脏，用一次性注射器内芯在不锈钢滤网上轻轻碾磨离散细胞，加入胰蛋白酶消化，并用吸管吹打数次，1200rpm离心10min，用RPMI-1640(含5%FBS，50uM2-巯基乙醇，100μ/ml青霉素和100mg/ml链霉素)调细胞数为1×10⁶个/ml悬液。

小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖能力的测定方法：稳定后的小鼠脾脏细胞每孔加入LPS(终浓度30μg/ml)或ConA(终浓度20μg/ml)100μl，对照组给予空白培养液。细胞培养箱中孵育72h后，MTT法测细胞存活率。

D、小鼠血清中IL-2、IL-4和INF-γ的测定

按照ELISA试剂盒法测定。

（3）测定结果

桂圆益气补血汤与不同剂量龙眼多糖配伍对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

结果如表1所示。

表1：

注：*表示与阴性对照组比较P<0.05，#表示与空白对照组比较P<0.05。

桂圆益气补血汤与不同剂量龙眼多糖配伍对免疫抑制小鼠细胞因子的影响

结果如表2所示。

表2：

注：*表示与阴性对照组比较P<0.05，#表示与空白对照组比较P<0.05

（4）结论

结果表明，桂圆益气补血汤给药组和龙眼多糖免疫固本方剂给药组均能显著促进免疫抑制小鼠脾淋巴细胞转化能力和巨噬细胞吞噬能力（P<0.05）。桂圆益气补血汤给药组和龙眼多糖免疫固本方剂给药组均能提高免疫抑制小鼠血清中IL-2含量，提示它们调整改善了Cy引起的免疫抑制状态。龙眼多糖免疫固本方剂给药组小鼠血清中INF-γ/IL-4比值与正常对照组无统计学差异，提示它能纠正免疫抑制小鼠Thl/Th2细胞因子的比例紊乱，从而调节免疫功能。综合分析，龙眼多糖免疫固本方剂给药组免疫调节作用优于桂圆益气补血汤给药组，桂圆益气补血汤与低剂量龙眼多糖配伍时作用效果最佳。因此复方龙眼多糖免疫固本方剂的最佳配方确定为：桂圆益气补血汤36g/kg与龙眼多糖80mg/kg配伍。

Claims (2)

1.一种复方龙眼多糖免疫固本方剂，其特征在于，由36g/kg桂圆益气补血汤中加入龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg而得；所述的桂圆益气补血汤由以下原料制备而成：龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g。

2.一种适用于权利要求1所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）龙眼粗多糖的分离提取：市购龙眼干果剥壳去核后，取出果肉阴干，称重，按质量体积比为龙眼肉:蒸馏水=1:4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，68℃下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼粗多糖；

（2）将龙眼粗多糖除蛋白和色素：称取龙眼粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭活5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液；将已去除蛋白的龙眼粗多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼粗多糖；

（3）除小分子：将已去除蛋白和色素的龙眼粗多糖进行溶解后装入已用蒸馏水浸泡30min除去杂质的透析玻璃纸中，夹于烧杯边缘，加入蒸馏水至完全没过玻璃纸；将蒸馏水置于5000ml广口瓶中，以1滴/s的速度通过玻璃管滴入装有透析玻璃纸的烧杯中，透析48h除去小分子杂质，然后减压浓缩，95%乙醇醇沉，即得纯化的龙眼多糖；

（4）桂圆益气补血汤的制备：称取龙眼肉20g、黄芪20g、当归10g、山药15g和甘草6g，加水浸泡30min，加入12倍量水，武火煮沸改用文火继续煎煮36min，煎煮2次，合并水煎液，3000rpm/min离心10min除杂，将水煎液浓缩至生药浓度为36g/kg；

（5）在生药浓度为36g/kg的桂圆益气补血汤中加入纯化的龙眼多糖并使龙眼多糖的浓度为80mg/kg，即得所述的复方龙眼多糖免疫固本方剂。