CN103308360B - 粘稠性临床检验标本的降粘设备及降粘方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种粘稠性临床检验标本的降粘设备及降粘方法，属于临床检验技术领域，所述粘稠性临床检验标本的降粘设备，其包括试剂瓶；降粘试剂，装在所述的试剂瓶中，所述降粘试剂包括中性磷酸盐缓冲液、蛋白酶及生理盐水；以及多个玻璃珠，装在所述的试剂瓶中。所述降粘方法，包括：将粘稠性临床检验标本放入到上述降粘设备中，振摇1-2分钟，得到低粘度的临床检验标本。本发明通过利用玻璃珠在剧烈运动时相互之间产生的剪切力，以及蛋白酶的酶降解作用，将临床粘稠标本变为稀薄标本，有利于标本中的致病菌充分游离，提高了致病菌培养阳性率，操作简单，并且仅需1-2分钟即可降低粘稠性标本的粘稠度，明显缩短了降粘时间。

Description

粘稠性临床检验标本的降粘设备及降粘方法

技术领域

本发明属于临床检验领域，特别是涉及一种粘稠性临床检验标本的降粘方法。

背景技术

临床检验是将病人的血液、体液、分泌物、排泄物和脱落物等标本，通过目视观察、物理、化学、仪器或分子生物学方法进行检测。临床检验为临床诊断提供了重要依据。

痰液、脓液、精液、粘稠阴道分泌物、脓便或脓血便等临床检验样本较为粘稠，检测前通常需要先进行预处理。目前，用于细菌培养的上述临床检验标本预处理的方法为：将粘稠标本加入含有15-20ml灭菌生理盐水的试管中，剧烈震荡5-10秒，用接种环将粘性标本取出以同样的方法反复洗两次后接种，该方法所用时间为3-4min，洗涤掉粘稠标本表面杂菌；用于PCR检测的上述临床检验标本的预处理方法为：将粘稠标本中加入其5倍体积的质量浓度为4%的NaOH溶液，剧烈震荡5-10秒，然后于37℃液化30-60min，期间震荡3-5次，液化后的标本用1.5ml生理盐水洗涤2次，该方法平均处理时间为45分钟。

现有粘稠临床检验标本的预处理方法，存在以下问题：用于细菌培养的标本经处理后仍旧粘稠，致病菌不能够充分游离，影响接种效果，最终导致用于细菌培养的标本的阳性率偏低；用于PCR检测的标本通过NaOH处理能够很好的降低标本的粘性，但是所用时间较长，并且强碱性溶液处理后不能够直接用于PCR检测，必须用中性溶液洗涤2-3次使之中性化，反复洗涤会导致致病菌的丢失，最终导致PCR扩增拷贝数下降及阳性率降低；上述两种方法操作较为复杂，需要专业人士进行操作，因而无法随时随地对标本进行快速有效的处理。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种临床检验标本的降粘方法。所述技术方案如下：

一方面，提供了一种粘稠性临床检验标本的降粘设备，其包括：

试剂瓶；降粘试剂，装在所述的试剂瓶中，所述降粘试剂包括中性磷酸盐缓冲液、蛋白酶及生理盐水；以及多个玻璃珠，装在所述的试剂瓶中。

优选，所述的中性磷酸盐缓冲液为无菌中性磷酸盐缓冲液；所述的蛋白酶为胰蛋白酶；所述的生理盐水为质量浓度为0.85-0.9%的无菌生理盐水。

具体地，所述中性磷酸盐缓冲液与所述生理盐水的体积比为2：1-10，所述蛋白酶占所述降粘试剂总质量的0.05-0.5%。

优选，所述中性磷酸盐缓冲液与所述生理盐水的体积比为1：1，所述蛋白酶占所述降粘试剂总质量的0.1%。

优选，所述的降粘设备中，所述试剂瓶为10ml容积的透明无菌试剂瓶；所述降粘试剂体积为5-6ml；所述玻璃珠的直径为2-2.5mm，数量为8-10个。

优选，所述的试剂瓶为螺旋口玻璃瓶，且带有配套瓶盖。

另一方面，提供了一种粘稠性临床检验标本的降粘方法，所述方法包括：

将粘稠性临床检验标本放入到上述降粘设备中，振摇1-2分钟，得到低粘度的临床检验标本。

优选，所述的粘稠性临床检验标本与所述降粘试剂的体积比为1：4-5。

优选，所述的粘稠性临床检验标本通过无菌容器采集，且送检过程中密闭保存。

进一步地，将粘稠性临床检验标本放入到降粘设备之前，先用灭菌生理盐水洗涤两次。

所述降粘试剂中各试剂的作用如下：

中性磷酸盐缓冲液：用于调节整个降粘体系的pH值，使整个体系的pH值始终保持在较为稳定的范围内，既有利于酶降解反应的进行，又能保证处理后的标本为中性或接近中性，因而可以直接进行后续检测，不需要进行再次洗涤或pH值的调整；

蛋白酶：降解粘稠性临床检验标本中的变性蛋白质，降低粘稠性临床检验标本的粘度；

生理盐水：用于稀释粘稠性临床检验标本。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：通过本发明实施例提供的降粘设备处理的标本，质地稀薄，有利于标本中的致病菌充分游离，提高了致病菌培养阳性率，为临床诊断提供了更为可靠的依据；本发明实施例提供的降粘方法所使用的降粘体系接近中性，不会破坏细菌的生存环境，利于后续培养，通过本发明实施例提供的降粘设备处理的标本，不需要进行后续反复洗涤处理即可直接使用，避免了由反复洗涤导致的致病菌的丢失，最终导致PCR扩增拷贝数下降及阳性率降低的问题；本发明实施例提供的降粘方法所使用的试剂易于配制、成本较低；本发明实施例提供的降粘方法，操作简单，可随时随地进行降粘处理，并且仅需1-2分钟即可降低粘稠性临床检验标本的粘稠度，明显缩短了降粘时间。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例提供了一种粘稠性临床检验标本的降粘设备，其包括试剂瓶、降粘试剂及多个玻璃珠，降粘试剂及玻璃珠均装在试剂瓶中，所述降粘试剂包括中性磷酸盐缓冲液、蛋白酶及生理盐水。

本发明实施例提供的降粘设备，通过中性磷酸盐缓冲液的调节，使整个降粘体系的pH值接近中性，在该环境下蛋白酶高效降解粘稠性临床检验标本中的变性蛋白质，从而降低其粘度，协同玻璃珠在剧烈运动时相互之间产生的剪切力，将粘稠性临床检验标本变为稀薄标本，有利于标本中的致病菌充分游离，提高了致病菌培养阳性率，为临床诊断提供了更为可靠的依据；由于中性磷酸盐缓冲液的调节作用，通过本发明实施例提供的降粘设备处理的标本几乎为中性，不需要进行后续洗涤处理即可直接使用，避免了由洗涤导致的致病菌的丢失，最终导致PCR扩增拷贝数下降及阳性率降低的问题；本发明实施例所使用的试剂易于配制、成本较低；本发明实施例提供的降粘瓶，操作简单，可随时随地进行降粘处理，并且仅需1-2分钟即可降低粘稠性标本的粘稠度，明显缩短了降粘时间。

较佳的，为避免外界细菌对检测结果的干扰，所述的中性磷酸盐缓冲液选用无菌中性磷酸盐缓冲液，所述的生理盐水为无菌生理盐水。

较佳的，所述蛋白酶为胰蛋白酶，胰蛋白酶在该环境下具有较高的活性，降粘效率高。

较佳的，所述的生理盐水为质量浓度为0.85-0.9%的无菌生理盐水，所述无菌中性磷酸盐缓冲液,优选无菌磷酸盐缓冲液（pH7.4），该缓冲液可通过下述方法制得：取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得。以使降粘体系与人体环境更为接近，避免目标菌群由于环境改变而产生异常。

具体的，所述中性磷酸盐缓冲液、所述生理盐水及所述蛋白酶的用量根据具体的粘稠性临床检验标本，如痰液、脓液、精液、脓（血）便及粘稠阴道分泌物等确定。其中，所述中性磷酸盐缓冲液及所述生理盐水的体积比一般为2：1-10，所述蛋白酶占所述降粘试剂总质量的0.05-0.5%，所述的粘稠性临床检验标本与所述降粘试剂的体积比为1：4-5，该配比既能实现对粘稠性临床检验标本的降粘处理，又能保证稀薄样本的量适于后续检验。

具体的，本发明实施例提供了一种用于痰液临床检验标本的降粘设备，该降粘设备中所述中性磷酸盐缓冲液与所述生理盐水的体积比为1：1、所述胰蛋白酶占所述降粘试剂总质量的0.1%。在其他实施例中粘稠性临床检验标本可以为痰液、脓液、精液、脓（血）便及粘稠阴道分泌物等。

较佳的，本发明实施例中所述的试剂瓶为10ml容积的透明无菌试剂瓶，其装有5-6ml所述的降粘试剂，8-10个直径为2-2.5mm所述的玻璃珠。由于痰液临床检验标本通常为1.5ml左右，该条件下痰液临床检验标本降粘效果最好且最节省试剂。

较佳的，为了密封试剂瓶，防止振摇过程中液体溅出以及外界空气对样本的污染，所述的试剂瓶为螺旋口玻璃瓶，且带有配套瓶盖。

实施例2

本发明实施例提供了一种痰液临床检验标本的降粘方法，所述方法包括：

将粘稠性临床检验标本放入到实施例1提供的降粘设备中，用力振摇1-2分钟，试剂瓶内的混合物变成较为均质的稀薄液体，该稀薄液体即为低粘度的临床检验标本。

较佳的，为了保证粘稠性临床检验标本在采集和送检过程中不被外界污染，所述的粘稠性临床检验标本通过无菌容器采集，且送检过程中密闭保存。

通过本发明实施例提供的降粘方法处理的标本，质地稀薄，有利于标本中的致病菌充分游离，提高了致病菌培养阳性率，为临床诊断提供了更为可靠的依据；本发明实施例提供的降粘方法所使用的降粘体系接近中性，不会破坏细菌的生存环境，利于后续培养，通过本发明实施例提供的降粘方法处理的标本，不需要进行后续冲洗处理即可直接使用，避免了由冲洗导致的致病菌的丢失，最终导致PCR扩增拷贝数下降及阳性率降低的问题；本发明实施例提供的降粘方法所使用的试剂易于配制、成本较低；本发明实施例提供的降粘方法，操作简单，可随时随地进行降粘处理，并且仅需1-2分钟即可降低粘稠性标本的粘稠度，明显缩短了降粘时间。

对比例1

提供了一种痰液临床检验标本的预处理方法，该方法包括：将痰液临床检验标本中加入5倍体积的质量浓度为4%的NaOH溶液，剧烈震荡5-10秒，然后置于37℃下液化30-60min，液化期间震荡3-5次，液化后的标本用适量生理盐水洗涤2次，得待检测标本。

用实施例2提供的降粘方法和对比例1提供的方法分别对230例疑似结核感染患者的痰液临床检验标本进行降粘处理，处理后的标本在相同条件下应用荧光定量PCR技术进行结核核酸（TB-DNA）定量的检测，检测结果见表1。

具体检测方法如下：

所用的检测方法具体为：

用枪头或吸管吸取降粘后的痰液临床检验标本0.5ml至1.5ml微量离心管中，在12,000rpm下离心5分钟；

去上清液，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，在100℃下恒温处理10±1分钟；

然后置于离心管中，在12,000rpm下离心5分钟，备用；

吸取上清液2μl加入到PCR扩增管中，在12,000rpm下离心2分钟，上机扩增。

PCR扩增条件是：93℃2分钟预变性，然后按93℃45秒，55℃60秒，先做10个循环，最后按93℃30秒，55℃45秒，做30个循环。

实施例3

本发明实施例提供了一种痰液临床检验标本的降粘方法，所述方法包括：

步骤1：通过无菌容器采集粘稠性临床检验标本，且送检过程中密闭保存；

步骤2：用适量灭菌生理盐水对所述粘稠性临床检验标本进行两次洗涤，除去所述粘稠性临床检验标本表面的杂菌；

步骤3：将粘稠性临床检验标本放入到实施例1提供的降粘设备中，用力振摇1-2分钟，试剂瓶内的混合物变成较为均质的稀薄液体，该稀薄液体即为低粘度的临床检验标本。

对比例2

提供了一种痰液临床检验标本的预处理方法，该方法包括：将痰液临床检验标本加入含有15-20ml灭菌生理盐水的试管中，剧烈震荡5-10秒，接种环将粘性标本取出后以同样的方法反复洗两次,得待检测标本。

用实施例3提供的降粘方法和对比例2提供的方法分别对200例患者的痰液临床检验标本进行降粘处理，200名患者均经过X线、CT等检查确诊为呼吸道感染，处理后的痰液临床检验标本，在相同条件下进行细菌培养，细菌生长结果见表2。

其中具体细菌分离培养方法如下：

血平板：适用于分类各种细菌，例如本实验中的大场埃希菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、硬鼻结克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、白色念珠菌等。1个标本接种2块血平板，1块血平板按一般的培养方法进行需氧培养，在37℃下培养24～48小时，另1块血平板置厌氧缸或厌氧袋内进行厌氧培养，经37℃培养2-3d后，认真观察生长情况和菌落特点，并挑取菌落涂片革兰氏染色镜检，根据形态特征得到初步印象，再按各类厌氧菌的特征进行鉴定；

巧克力平板：分离流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌，于CO₂环境下在36～37℃培养24～48小时；

沙保罗培养基：分离白色念珠菌、白色念珠菌及其他酵母样真菌等，在36～37℃下培养2～3d；

根据菌落特点及性状取可疑菌落，进行纯培养，然后进行鉴定。

表1用两种方法分别进行降粘处理后标本的PCR扩增结果

TB-DNA	对比例1提供的方法	实施例2提供的方法
			阳性/例	133	146
阴性/例	97	84
			平均降粘时间（min）	45	1

由表1可知，实施例2提供的降粘方法不仅大大节约了标本降粘所用的时间，而且PCR扩增后TB-DNA的阳性率明显提高。

表2用两种方法分别进行处理后标本的细菌生长情况

由表2可知，实施例3提供的降粘方法致病菌培养阳性率明显提高。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种粘稠性临床检验标本的降粘方法，其特征在于，所述方法包括：

将粘稠性临床检验标本放入到容积为10ml螺旋口玻璃瓶中，与所述螺旋口玻璃瓶中的降粘试剂混合振摇1-2分钟，得到低粘度的临床检验标本，所述螺旋口玻璃瓶带有配套瓶盖，所述降粘试剂体积为5-6ml，所述螺旋口玻璃瓶中有8-10个直径为2-2.5mm的玻璃珠；所述粘稠性临床检验标本通过无菌容器采集的，且送检过程中密封保存；

所述粘稠性临床检验标本放入到所述螺旋口玻璃瓶中之前，先用灭菌生理盐水洗涤两次；

所述降粘试剂包括无菌中性磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶及无菌生理盐水；所述无菌中性磷酸盐缓冲液与所述生理盐水的体积比为1：1，所述胰蛋白酶占所述降粘试剂总质量的0.1％；所述的生理盐水为质量浓度为0.85-0.9％的无菌生理盐水。