CN103290091B - 一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，涉及一种检测系统，属于分子生物技术领域。本发明利用基于荧光蛋白的双分子荧光互补技术，将通常需要两个基于单表达质粒载体的BiFC检测体系构建到一个双表达质粒载体系统中，可以明显降低BiFC检测方法在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的假阳性率，并可实现定量分析。本发明还可用于基于基因文库的未知蛋白质-蛋白质相互作用的筛选研究，以及活体动物内的蛋白质-蛋白质相互作用检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法。
背景技术
细胞本身是由不同生物分子间相互作用形成一个有序的生命活动的基本单元。细胞重大生命活动的发生和调节是通过生物大分子间(蛋白质—蛋白质、蛋白质—核酸等)相互作用来实现的。蛋白质—蛋白质相互作用(protein-protein interaction,以下简称“PPI”)不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖，同时还介导细胞生命活动过程中的信号转导、致癌转化和调整等，因此研究蛋白质—蛋白质相互作用具有重要的生命科学意义。
目前，针对哺乳动物细胞可实现活细胞内准确空间定位的PPI成像的技术，只有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)技术和双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)技术。基于荧光蛋白的BiFC技术，是指利用基因克隆技术将完整荧光蛋白在合适位点切开形成两个无荧光的片段，并使这两个片段分别与两目标蛋白构成融合蛋白，借助两目标蛋白质间的相互作用拉近这两个荧光片段的空间距离，从而重新折叠形成结构完整并具有荧光特性的融合蛋白。与FRET技术相比，双分子荧光互补技术对仪器设备的性能要求较低、实验结果更直观、后续处理简单、检测灵敏度更高、尤其在弱PPI的检测中具有优势。但现有BiFC技术均伴随着较高的假阳性率，在检测中还会产生很高的本底信号，这些缺点使得该方法在未知蛋白质间的相互作用检测和PPI的定量研究中受到限制。因此，发展低假阳性率的BiFC系统，将会极大地促进活体内的蛋白质功能研究。此外，利用基于多种不同荧光蛋白的BiFC技术可方便地实现活细胞内多对蛋白质相互作用的检测。通常，针对一对PPI进行BiFC检测时，需要同时向细胞中转染两种质粒。若同时针对三对PPI进行BiFC检测，则需要同时向细胞中转染6种质粒。显然多质粒转染过程中，不同基因的表达比例很难控制。这一问题很大程度上影响了BiFC技术在多对蛋白质相互作用检测中的应用。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法。利用该方法在检测蛋白质相互作用的同时，可以显著的降低BiFC的假阳性产生。
本发明所采用的技术方案是：
一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，包括以下步骤:
1)将荧光蛋白在特定位点切割成两个蛋白序列片段，荧光蛋白的N端和C端分别命名为FPN和FPC；
2)将待测目标蛋白A的DNA序列与FPN基因序列同时插入到双表达载体中的一个启动子的下游，另一个待测蛋白B和与FPC基因序列同时插入双表达载体中的另一个启动子下游，从而构建了基于双表达载体的双分子荧光互补系统；
3)将同时含有待测目标蛋白A和B的双分子荧光互补系统转染细胞，培养16～24小时以后，使用荧光显微镜观察光源刺激前后是否存在荧光；如果两目标蛋白存在相互作用，则荧光蛋白的N端和C端靠近，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号；如果没有或者只有极其微弱荧光，证明两目标蛋白之间无相互作用。
优选地，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin、黄色荧光蛋白mVenus和青色荧光蛋白mCerulean。
优选地，所述双表达载体为pBudCE4.1、pIRES2和pVITR03。
优选地，所述步骤3)中，当两目标蛋白存在相互作用，荧光蛋白的N端和C端靠近的距离范围为10nm～20nm，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号。
进一步地，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin时，特定位点为第155号丝氨酸。
进一步地，所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白mVenus时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。
进一步地，所述荧光蛋白为青色荧光蛋白mCerulean时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。
本发明具有以下优点：
本方法能够满足活细胞条件下检测蛋白质的相互作用，基于荧光蛋白的双表达载体系统，与目前常用的BiFC系统(至少两个载体分子的共同转染)相比，操作更简便，转染的载体量更易控制，每对融合蛋白的表达量更稳定，可用于蛋白质相互作用的定量分析；同时该方法显著降低了BiFC假阳性的产生，扩大了BiFC技术的应用范围，使之适用于从基因文库中快速高效地筛选出未知的蛋白质-蛋白质相互作用。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为mLumin-BiFC系统的双表达载体质粒图谱；
图2为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-bFos-Lc-bJun、pBud-Ln-b△Fos-Lc-bJun、pBud-Ln-bFos-bJun-Lc和pBud-Ln-b△Fos-bJun-Lc于37℃培养24小时后的荧光成像图；
图3为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-bFos-Lc-bJun、pBud-Ln-b△Fos-Lc-bJun、pBud-Ln-bFos-bJun-Lc和pBud-Ln-b△Fos-bJun-Lc于37℃培养24小时后的数据统计分析直方图；
图4为COS-7细胞分别转染pBud、pBud-Ln-b△Fos-bJun-Lc和pBud-Ln-bFos-bJun-Lc于37℃培养24小时后的流式细胞仪分析结果图；
图5为COS-7细胞分别转染pBud、pBud-Ln-b△Fos-bJun-Lc和pBud-Ln-bFos-bJun-Lc于37℃培养24小时后的数据统计分析直方图；
图6为COS-7细胞分别转染bJun-Vn/bFos-Vc、bJun-Vn/△bFos、pBud-Vn-bFos-Vc-bJun和pBud-Vn-b△Fos-Vc-bJun于37℃培养24小时后的荧光成像图；
图7为COS-7细胞分别转染bJun-Vn/bFos-Vc、bJun-Vn/△bFos、pBud-Vn-bFos-Vc-bJun和pBud-Vn-b△Fos-Vc-bJun于37℃培养24小时后的数据统计分析直方图；
图8为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-RBD-Lc-bKRas、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas12v、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的荧光成像图；
图9为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-RBD-Lc-bKRas、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas12v、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的数据统计分析直方图；
图10为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-RBD-Lc-bKRas、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas12v、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的单个细胞的激光共聚焦荧光成像图；
图11为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-Grb2-Lc-bKRas、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas12v、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的荧光成像图；
图12为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-Grb2-Lc-bKRas、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas12v、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的数据统计分析直方图；
图13为COS-7细胞分别转染pBud-Ln-Grb2-Lc-bKRas、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas12v、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas185S于37℃培养24小时后的单个细胞的激光共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
本发明是一种蛋白质相互作用的检测方法，基于远红色荧光蛋白突变体和黄色荧光蛋白，而该检测方法的关键在于，荧光蛋白的选取和哺乳动物细胞双表达载体的选取。本具体实施方式中选用的是远红荧光蛋白mLumin和黄色荧光蛋白mVenus，双表达载体使用真核表达载体pBudCE4.1。具体实施方式中的pBudCE4.1含有两个强启动子CMV和EF-1α，在CMV启动子的下游分别插入远红/黄色荧光蛋白片段的N末端与bFos，EF-1α启动子下游插入远红/黄色荧光蛋白片段的C末端与bJun。使得荧光蛋白片段与bFos/bJun能够融合表达，在bFos和bJun的相互作用下介导两个荧光蛋白片段互补形成一个完整的可发光的荧光蛋白。原则上，也可以用其它强启动子替代这两个启动子，但应保证两个启动子在同一载体中启动基因表达的能力相当。
图1是mLumin-BiFC系统的双表达载体质粒图谱。远红荧光蛋白mLumin第155位氨基酸分割成的两个片段(mLumin-155C和mLumin-155N)通过PPI介导荧光蛋白互补，形成可发光的完整荧光蛋白mLumin，从而可实现mLumin-BiFC探针的PPI光学成像检测。构建质粒时，所用pBudCE4.1双表达载体含有CMV和EF-1α两个独立的启动子和Zeocin筛选抗性。通过内切酶Sal I/BamH I和NotI/Bgl II将荧光片段mLumin-155N-bFos和mLumin-155C-bJun分别插入到CMV和EF-1α启动子下游，使其可以同时独立地表达融合蛋白。37℃条件下可以经由bFos和bJun之间的相互作用，使得荧光蛋白片段相互靠近而形成完整的可发光的荧光蛋白，产生荧光信号。本发明所涉及的其它探针亦可使用pBud CE4.1载体多克隆位点内的其它内切酶位点进行相似的分子克隆操作，亦可对bFos/bJun进行替换，构建为同类的用于检测其它PPI的mLumin-BiFC探针。
图2和图3为基于双表达载体的远红荧光蛋白突变体mLumin-BiFC体系在转染COS-7细胞后的荧光图。从图2中可以看出，在这个体系中，阳性与阴性组中表达荧光蛋白的细胞数目有极大差异。在阴性对照组中几乎看不到发出红色荧光的细胞，图3也说明基于双表达载体的mLumin-BiFC系统在阳性与阴性组中产生了显著地差异，降低了假阳性的发生。
图4和图5为基于双表达载体的远红荧光蛋白突变体mLumin-BiFC体系在转染COS-7细胞后的流式细胞分析。结果表明基于双表达载体的mLumin-BiFC荧光信号阳性与阴性比可以达到37.65倍。并且阴性组和空白对照组之间的差异也很小。这说明基于双表达载体的mLumin-BiFC系统能极大的降低假阳性结果，同时阳性组有很强的荧光互补效率。
图6至图7为基于黄色荧光蛋白突变体mVenus的BiFC系统分别构建到两个表达载体中(Vn-bFos/ΔbFos+Vc-bJun)和构建于双表达载体中(Vn-bFos/ΔbFos-Vc-bJun)的质粒，转染COS-7细胞后的荧光图。从图中可以看出，目前最常用的构建于两个强表达载体中的BiFC体系，阴性对照仍有大量细胞产生荧光信号。而在双表达载体中，阴性对照组中产生荧光信号的细胞数量和荧光强度均有明显的下降。
本发明前期工作是BiFC中间载体的构建。
其具体步骤为：
BiFC中间载体pBud-Vn-Vc和pBud-Ln-Lc质粒构建
mlumin编码序列1-155(Ln)，156-234(Lc)通过PCR扩增酶切后分别插入pBudCE4.1的Hind III/Sal I位点和Bgl II/Mlu I位点；
构建过程所用的引物序列为
实施例1
本实施实例是利用基于双表达载体的mLumin-BiFC系统建立一种低假阳性率的蛋白质相互作用的检测方法。基于此目的，将bFos与mLumin蛋白序列的N端相连(以下简称LN)，bJun与mLumin蛋白序列的C端相连(以下简称LC)。
参照图1，图1是基于mLumin155位点的BiFC分子探针结构图，由探针的阳性组mLumin-Ln155-bFos/mLumin-Lc155-bJun和阴性组mLumin-Ln55-ΔbFos/mLumin-Lc155-bJun构成。其中ΔbFos为缺失突变后的bFos，生理条件下不能同bJun相互作用，因而不产生BiFC荧光信号。
其具体步骤为：首先应用基因工程技术构建pBud-Ln-Lc，质粒在哺乳动物细胞中可以分别表达Ln和Lc。应用PCR技术分别扩增bFos(或ΔbFos)并克隆插入pBud-Ln-Lc中的Ln下游；扩增bJun并克隆插入pBud-Ln-Lc的Lc上游或下游(bJun和bFos能够相互作用,bJun和ΔbFos不能够相互作用),即构建四组质粒载体，分别为pBud-Ln-Fos-Lc-Jun、pBud-Ln-Fos-Jun-Lc、pBud-Ln-ΔFos-Lc-Jun和pBud-Ln-ΔFos-Jun-Lc，从而得到可表达BiFC分子探针的质粒。即完成本发明所涉及的BiFC探针构建。
图2和图3是基于mLumin155位点的双表达载体BiFC探针在细胞内PPI检测应用中的荧光图及BiFC效率统计结果。如图显示，分别将pBud-Ln-Fos-Lc-Jun和pBud-Ln-Fos-Jun-Lc转染COS-7细胞后，普通荧光显微镜下(滤光片参数520-550,DM565,580LP,Olympus)，观察发现有很强的红色荧光信号，而pBud-Ln-ΔbFos-Lc-Jun和pBud-Ln-ΔbFos-Jun-Lc探针几乎没有检测到红色荧光信号。这说明基于双表达载体的mLumin-BiFC探针具有明显的阴阳性对比度，即证明本发明能降低假阳性的产生，可以更方便地应用于活细胞内蛋白质－蛋白质相互作用的研究。
图4和图5是基于双表达载体的mLumin-BiFC系统的流式细胞检测结果。为了进一步验证本发明能够降低假阳性结果的产生，通过流式细胞术分别检测了阴/阳试验组中10000个细胞荧光互补后的远红荧光信号。对比阴性实验组和空白对照组的荧光信号百分比，更确定本发明能够减低阴性实验组的荧光信号。与阳性实验组的对比结果显示本发明能有效降低假阳性产生。
图6和图7是基于双表达载体的mVenus-BiFC系统转染COS-7细胞后的荧光图和统计结果分析。如图所示，通过对比使用两个表达载体的BiFC系统，发现基于双表达载体的mVenus-BiFC系统也能降低假阳性结果。
实施例2
Raf1是细胞信号途径的重要组成分子KRas的主要效应蛋白，在生长、发育及癌症发生中起着重要作用。Kras-Raf1蛋白的Ras结合域RBD在许多研究中都被当作Ras活性的特异的探针。GTP结合形式的KRas比GDP结合的KRas与RBD有更强的亲和力，GDP结合的Ras与Raf1间的亲和力因为太弱而不足以参与到信号传导中。因此，RBD与KRas的异源二聚化可作为发展活细胞内PPI检测方法的良好蛋白质相互作用模型。
图8至图10是pBud-Ln-RBD-Lc-KRas、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas12v和pBud-Ln-RBD-Lc-KrasC185S转染COS-7细胞后的荧光图。将RBD与KRas或KRas突变体插入pBud-Ln-Lc载体中，构建了pBud-Ln-RBD-Lc-KRas、pBud-Ln-RBD-Lc-KRas12v和pBud-Ln-RBD-Lc-KrasC185S三组探针。分别转染COS-7细胞后，于37℃条件下培养24h。荧光显微镜观察发现在细胞膜上或全细胞内产生了红色荧光，表明RBD与不同结构的Kras的相互作用发生在细胞的不同空间位置上。此结果与先前文献报道相符。而RBD与增强型KRas12v相互作用产生的红色荧光信号明显强于自然型KRas。可见本发明所提供的基因型生物分子探针可在哺乳动物细胞内灵敏地检测蛋白质的相互作用。
实施例3
Grb2是细胞信号通路中的重要衔接蛋白，通过Grb2，KRas可以与不同的信号通路下游蛋白发生相互作用。KRas的活化主要通过其与Grb2-SOS1蛋白复合体作用完成。
将融合片断Grb2和KRas或其突变体克隆至pBud-Ln-Lc，构建出pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas、pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas12v和pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas185S。质粒分别转染COS-7细胞后，于37℃条件下培养24小时后进行成像。参照图11至图13，pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas12v表达的细胞在细胞膜上的红色荧光明显强于pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas，而在pBud-Ln-Grb2-Lc-KRas185S中则看不到明显的荧光，说明BiFC探针能应用于多于两个蛋白形成的复合体的检测中，也验证了KRas的活化增强了KRas与Grb2间的结合作用。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)将荧光蛋白在特定位点切割成两个蛋白序列片段，荧光蛋白的N端和C端分别命名为FPN和FPC；
2)将待测目标蛋白A的DNA序列与FPN基因序列同时插入到双表达载体中的一个启动子的下游，另一个待测蛋白B和与FPC基因序列同时插入双表达载体中的另一个启动子下游，从而构建了基于双表达载体的双分子荧光互补系统；所述双表达载体中的两个启动子在同一载体中启动基因表达的能力相当；
3)将同时含有待测目标蛋白A和B的双分子荧光互补系统转染细胞，培养16～24小时以后，使用荧光显微镜观察光源刺激前后是否存在荧光；如果两目标蛋白存在相互作用，则荧光蛋白的N端和C端靠近，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号；如果没有或者只有极其微弱荧光，证明两目标蛋白之间无相互作用。
2.根据权利要求1所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin、黄色荧光蛋白mVenus和青色荧光蛋白mCerulean。
3.根据权利要求1所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述双表达载体为pBudCE4.1、pIRES2和pVITR03。
4.根据权利要求1至3任一项所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，当两目标蛋白存在相互作用，荧光蛋白的N端和C端靠近的距离范围为10nm～20nm，从而自发重组为完整荧光蛋白，产生荧光信号。
5.根据权利要求1至3任一项所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述荧光蛋白为远红荧光蛋白mLumin时，特定位点为第155号丝氨酸。
6.根据权利要求1至3任一项所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白mVenus时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。
7.根据权利要求1至3任一项所述的低假阳性率的蛋白质相互作用检测方法，其特征在于，所述荧光蛋白为青色荧光蛋白mCerulean时，特定位点为155号丝氨酸和173号丝氨酸。
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