CN103276074B - 一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于DNA生物合成领域，具体涉及一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针方法及其应用，可用于检测小的非编码核糖核酸，如微核糖核酸,包括如下步骤：（1）制备重组有模板DNA的质粒；（2）切割并连接模板DNA，从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；（3）切单链，滚环复制，用切口酶切断模板DNA的一条链，加入聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环-探针结构的DNA单链；（4）目的短单链DNA的制备，对步骤（3）的产物采用Ⅱ型内切酶切割形成目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到无突变的单链DNA探针。本发明在小非编码RNA检测领域和小非编码RNA相关疾病的诊断和治疗领域具有广泛用途。

Description

一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法

技术领域

本发明属于DNA生物合成领域，具体涉及一种合成短单链脱氧核糖核苷酸（short single strand DNA，sssDNA）探针的方法，可用于检测小的非编码核糖核酸（small non-coding RNAs），如微核糖核酸（microRNA）。

背景技术

短单链脱氧核糖核苷酸（sssDNA）可作为探针用于科研和医学诊断。最近十几年关于小非编码RNA的研究非常火热，尤其是微RNA，科学家和医药公司对以微RNA作为靶点来研发诊断试剂盒和药物的前景也非常看好。由于微RNA通常只有18-30个碱基(Bartel,2004)，而且一个家族的微RNA差异可能只有1-2个碱基(www.mirbase.com)，因此用杂交方法来检测微RNA的话，对探针的纯度要求高。如果探针有碱基突变的话，会导致检测结果为假阴性或假阳性。

现有合成短核苷酸技术主要是通过固相化学合成(Reese,2005)，这个方法虽然广泛应用于生产寡核苷酸，但其有一定的错误率，且错误率随合成的核苷酸的长度增加而增加。这种方法是从核酸的3’向5’端逐渐加上单个的碱基，因为每加上一个碱基时效率都达不到100%，现在通常的效率是99%左右，所以用这种方法合成的含21个碱基的脱氧核糖核苷酸通常只有79%左右的纯度(Lohmannet al.,2007;Pon et al.,1996)。虽然合成后的纯化（常用HPLC或PAGE纯化）能帮助富集预期目的大小的脱氧核糖核苷酸，但无法减少拥有同样大小的突变的脱氧核糖核苷酸杂质。因而现有的固相化学合成的寡核苷酸产品经纯化后也不可能达到100%纯度。这对那些需求100%纯度（序列一致）的寡核苷酸的应用是个致命缺点。

科研者也在寻求以生物酶合成方法生产高纯度的短单链脱氧核糖核苷酸的方法。PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）被用于生产长度为30个碱基的短核苷酸探针(Bertilsson et al.,2002,Appl Environ Microbiol)，但这种方法存在两个缺点：一是PCR需要以化学合成的引物来扩增，而合成的引物总会有突变的，这就使PCR的产物中携带了引物中的突变，导致产物达不到100%的纯度，而且对扩增的产物长度有限制；另一个缺点是PCR合成的产物是双链，需要额外的步骤来把双链分离并纯化出目的单链。

2003年Van Ness J等描述了一种恒温扩增单链寡核苷酸片段的方法(VanNess et al.,2003)。具体是利用一种热稳定的切口内切酶N.BstNBI在双链寡核苷酸片段打上切口，这样有切口的一条寡核苷酸片段就会从双链模板上脱落，产生一个5’突出的末端，随后DNA聚合酶就可以补齐这个末端产生新的双链寡核苷酸，新合成的双链寡核苷酸又可以被切口内切酶Nt.BstNBI打上切口，聚合酶又可以进行复制，这样就达到了扩增小片段核苷酸的目的。这种方法有很大的局限性:恒温扩增对扩增的寡核苷酸的长度有严格的要求,如果要扩增的寡核苷酸太长，Tm值就会太高，切口内切酶作用于双链寡核苷酸片段后产生的寡核苷酸片段就不会从模板上脱落；相反，如果要扩增的寡核苷酸太短，Tm值就会太低，寡核苷酸片段就很容易从模板上脱落。因此，这种方法只适合扩增8-16个碱基的寡核苷酸，对于更短或更长的寡核苷酸扩增就无能为力了。

也有报道用滚环扩增的方法生产核苷酸（李岩等，2011,一种高效扩增小片段DNA方法的建立；Lohmann et al.,2007)。Lohmann等2007年报道用滚环扩增的方法生产66个碱基的核苷酸。最近李岩等报道用滚环扩增的方法生产更短核苷酸，他们是先把化学合成的单链寡核苷酸链接成环，用这个环状寡核苷酸作为模板，利用phi29DNA聚合酶以单向或双向短引物开始复制，其产物分别是一条很长的单链DNA（单向引物）或者是一条很长的双链DNA（双向引物）。这个方法的缺点:一是把化学合成的模版和引物的中的错误带至产物中了；二是没找到把长单链切割成特异短链的方法；三是长双链DNA虽然可以被内切酶切割，但要求被复制扩增的目的DNA片段含有酶切位点，即不能扩增特定的不含内切酶的序列，并且切割后的产物还是双链，不能用于需要单链探针的实验和诊断。

本发明是将经测序验证无突变的DNA连接至质粒中扩增，然后用内切酶切出目的片段，连接成环，再以切口酶切断其中一条链，然后用phi29DNA聚合酶以滚环扩增的方法扩增出需要的DNA单链，这个DNA单链会自发形成颈环的二级结构，从而能被预先设计好的Ⅱ型内切酶切割形成短的（10-30bp）的目的单链DNA和副产物颈环DNA，通过PAGE分离纯化可得到单一的含一致序列（无突变）的短单链DNA。这个方法的优点：一是模板经测序验证无突变；二是经巧妙设计，生成的长单链DNA能被切割成只含目的序列的短单链DNA，没有序列性限制，而且是单链，经简单分离纯化后可作为探针使用；三是phi29DNA聚合酶的纠错能力强，错误率约为1X10^-7，显著优于用Taq DNA聚合酶（错误率为2x10^-4）进行PCR扩增得到的单链DNA，比用其它方法合成的错误率低很多。

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题，提供一种准确性高、用于小非编码RNA的精确检测的合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备重组有模板DNA的质粒

设计模板DNA序列：模板DNA为双链，两端含有相同的酶切位点；模板DNA设有至少一个颈环-探针结构；模板DNA还带有切口酶位点。

合成所述的模板DNA并连接至质粒中，经测序验证无突变并扩增；

（2）酶切并连接模板DNA

从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；

（3）切单链，滚环复制

用切口酶切断模板DNA的一条链，加入DNA聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环-探针结构的DNA单链；

（4）目的短单链DNA的制备

对步骤（3）的自发形成颈环二级结构的DNA单链产物采用内切酶切割形成与微RNA完全互补的目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到含单一序列的无突变的单链DNA探针。

进一步的技术方案包括：颈环为含内切酶位点的可成环结构，探针为任何一个DNA序列；内切酶切割内切酶位点以在颈环和任何一个DNA序列之间切断。

进一步地，所述的探针为任一微RNA的反义序列；所述的内切酶切割内切酶位点以在颈环和任一微RNA的反义序列之间切断，切离出与微RNA序列完全互补的微RNA的反义序列。

进一步地，所述的内切酶为BtsCI或BspPI，所述的内切酶位点为BtsCI位点或BspPI位点内切酶与内切酶位点相对应。或与这些内切酶类似的其它内切酶，能在颈环和任一微RNA的反义序列之间切断，且切离出与微RNA序列完全互补的微RNA的反义序列。

进一步地，所述的切口酶位点包括Nt.BstNBI位点，所述的切口酶包括Nt.BstNBI。

进一步地，采用末端转移酶在纯化后的单链DNA探针端部加上标记物；或者在聚合酶扩增时加入带标记物的扩增底物。

进一步地所述的标记物包括地高辛、荧光素、生物素或同位素。

进一步地，所述的目的单链DNA探针大小为10-30bp。

进一步地，所述的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。

综上，本发明提供一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，即用phi29DNA聚合酶以测序正确的环状缺口DNA为模板，扩增出可形成颈环结构的长单链DNA，经内切酶在颈环部位切断后可分离得到目的单链DNA，作为探针在小非编码RNA检测领域和小非编码RNA相关疾病的诊断和治疗领域具有广泛用途。

附图说明

图1和图2：设计的用于扩增的DNA模板序列，其5’端为含Ⅱ型内切酶BtsCI位点的可形成颈环结构的序列，3’端为一个微RNA的反义序列（探针），或为任何一个DNA的序列（图1A）；把上述颈环-微RNA探针序列叠加，形成颈环-探针-颈环-探针-颈环的序列，再在这个序列的5’端加上Nt.BstNBI切口酶识别位点GAGTGatat，最后在两端各加上一个EcoRI内切酶识别位点GAATTC（图一1B和图2）；phi29DNA聚合酶以带切口的环状的模板DNA为模板，以链取代的方式滚环复制与完整环状链互补的链（图1C）；

图3：经内切酶EcoRI消化的pUC57-miR124质粒通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离的图谱；左侧泳道为100bp的DNA marker，右侧泳道为切出的约130bp的模板DNA片段；

图4：15%的PAGE胶分离经BtsCI切割后的单链DNA产物的图谱，泳道1中最上的一条带是miR-124的探针（即目的单链DNA探针），中间一条带为颈环DNA片段，最下面一条带是含EcoRI和Nt.BstNBI位点的DNA片段；泳道2是化学合成的20个碱基的寡核苷酸，作为marker；

图5：用本发明生产的miR-124探针（即目的单链DNA探针）检测到miR-124在E12.5小鼠胚胎中脑的分化的神经元（mantle zone）中表达的图谱。

具体实施方式

以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，包括如下步骤：

a、设计需要扩增的模板DNA序列，其5’端为含Ⅱ型内切酶BtsCI位点的可形成颈环结构的序列，3’端为一个微RNA的反义序列（探针结构），或为任何一个DNA的序列。这两部分为一个单元，可以叠加这样的单元，就形成了本发明所设计的颈环-探针-颈环-探针-颈环的序列。再在这个序列的5’端加上Nt.BstNBI切口酶识别位点GAGTGatat，最后在两端各加上一个EcoRI内切酶识别位点GAATTC。

b、DNA合成公司合成设计的序列，克隆至载体中，经测序无突变后，转染至细菌中扩增质粒。

c、提取质粒后，用内切酶EcoRI切出模板DNA片段，然后用T4DNA连接酶把模板DNA连接成环状DNA，再用切口酶Nt.BstNBI把DNA双链中的一条链切开。

d、以环状带切口的模板DNA为模板，用phi29DNA聚合酶以链取代的方式滚环复制与完整环状链互补的链。

e、用Ⅱ型内切酶BtsCI切断扩增的单链DNA产物。

f、用15%的PAGE胶分离纯化目的单链DNA，可作为探针用于科研和医学诊断。

实施例一：制备微RNA探针方法一

第一步：设计需要扩增的DNA序列，其5’端为含Ⅱ型内切酶BtsCI位点的可形成颈环结构的序列，3’端为一个微RNA的反义序列（探针），或为任何一个DNA的序列，见图1A。为了优化生产和后续实验，把上述颈环-微RNA探针序列叠加，形成颈环-探针-颈环-探针-颈环的序列，再在这个序列的5’端加上Nt.BstNBI切口酶识别位点GAGTGatat，最后在两端各加上一个EcoRI内切酶识别位点GAATTC，如图1B。

所需检测的小鼠微RNA mmu-miR-124-3p（序列号MIMAT0000134）的序列为5’UAAGGCACGCGGUGAAUGCC3’（seq No.3）。设计的用于生产miR-124探针的序列见表1。

表一用于生产miR-124探针的模板DNA序列

为了更好地显示序列结构，正向序列为5’Gaattc GAGTGatat CCATCC GCGCtgt gcgc GGATGGA GGCATTCACCGCGTGCCTTA CATCC GCGC tgt gcgc GGATGTAGGCATTCACCGCGTGCCTTA CATCC GCGC tgt gcgc GGATGTA gaattc3’（图2）。Nt.BstNBI位点的上、下链的序列分别为GAGTGNNNNN、CTCACNNNNNN，切点在上链的最后一个N(N指A、T、C、G中的任意一种，下同)之前。BtscI位点的上、下链的序列分别为GGATGNN、CCTACNN，切点在上链的末端和下链的最后两个N之前。

第二步：让DNA合成公司合成上述设计的序列，克隆至pUC57载体中，经测序验证合成的序列无突变后，转染至细菌中扩增质粒，质粒命名为pUC57-miR124。

第三步：提取质粒后，用1μl含20单位的内切酶EcoRI（NEB）消化1μgpUC57-miR124质粒，切出模板DNA片段，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳（120V,30min）分离出约130bp的模板DNA片段，见图3。割胶，并用胶回收试剂盒回收模板DNA片段，DNA用20μl去离子水洗脱。

第四步：取10μl回收的模板DNA，用1μl含400单位的T4DNA连接酶（NEB）把模板DNA连接成环状DNA，总反应体系20μl，16℃反应2小时。然后65℃温育10分钟把连接酶失活。

第五步：取5μl上述连接产物，用1μl含10单位的切口酶Nt.BstNBI（NEB）把一条链切开，反应在1X NEBuffer3.1缓冲液中置于55℃进行2小时。然后80℃温育30分钟把切口酶失活。

第六步：取5μl第五步酶切的产物，用1μl含10单位的phi29DNA聚合酶（NEB）以带切口的环状的模板DNA进行链取代的方式滚环复制（RCA）与完整环状链互补的链（示意图见图1C），反应在20μl体系（含2单位的phi29DNA聚合酶,1Xphi29DNA聚合酶缓冲液,0.1mg/ml BSA,0.2mM dTTP,0.2mM dGTP,0.2mMdATP和0.2mM dCTP）中于30℃进行6小时。然后置于65℃10分钟让酶失活。第七步：用Ⅱ型内切酶，即1μl含20单位的BtsCI酶切断扩增的单链DNA产物。反应在1X CutSmart缓冲液（50mM醋酸钾，20mM Tris-醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/ml BSA，pH7.9）中于50℃进行1小时。

第八步：向第七步的反应液中加6x DNA loading buffer至终浓度为1x DNAloading buffer。样品上至15%的PAGE胶，在1xTBE中用150V电泳2小时分离纯化目的单链DNA。胶用GelRed染色后，用凝胶成像仪拍照，结果见图4。

第九步：切割含有20bp的miR-124探针的胶，把胶切成小碎片，用3倍体积的1xTBE洗脱摇过夜。瞬时离心（600g，1min）后，把溶液转移至新的1.5ml管内，加0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA，用70%的乙醇洗涤一次，风干DNA沉淀，加5ul TE buffer溶解DNA。

第十步：利用末端转移酶（Terminal Transferase）标记探针。取5pmol第九步产生的DNA探针，加1μl含20单位的末端转移酶（NEB）在1X Terminal转移酶反应缓冲液，0.2mM DIG-dUTP，0.25mM CoCl₂中于37℃孵育半小时，然后70℃加热10分钟使酶失活。这样3’端标记DIG-dUTP的DNA探针就可以用于检测miR-124了。

实施例二：制备微RNA探针方法二

方法二大体与方法一相同，只是在方法一的第六步反应中，用0.1mM DIG-dUTP和0.1mM dTTP代替0.2mM dTTP,这样phi29DNA聚合酶合成的单链DNA就掺入了DIG-dUTP。DIG是一种标记物，可以是地高辛、荧光素、生物素、同位素等。在完成第九步的割胶纯化DNA后，得到的就是标记好的DNA探针了。

实施例三：用制成的目的单链DNA探针（即miR-124探针）检验小鼠miR-124

第一步：

八微米厚的胚胎发育12.5天小鼠的脑切片，经下述步骤处理

1.二甲苯脱蜡两次，每次15分钟

2.100%乙醇洗两次，每次5分钟

3.70%乙醇洗5分钟

4.30%乙醇洗5分钟

5.去离子水中洗5分钟

6.1x PBS中洗两次，每次5分钟

7.4% PFA冰上固定20分钟

8.1xPBS中洗两次，每次5分钟

9.10μg/ml蛋白酶K在1x蛋白酶K缓冲液中处理5分钟

10.1xPBS中洗两次，每次2分钟

11.4%PFA冰上固定10分钟

12.1xPBS中洗两次，每次5分钟

13.在含600μl乙酸酐的1xTEA【200ml of0,1M三乙醇胺-盐酸（triethanolamine-HCl），pH8】中处理10分钟

14.2xSSC处理两次，每次5分钟

第二步：预杂交

加100μl的杂交缓冲液（Ambion）到上述处理好的脑片上，盖上盖玻片，放置在一个含50%甲酰胺、5xSSC的保湿盒中，把保湿盒放置在52℃的温箱内预杂交1个小时。

第三步：杂交

取1pmol用方法一制备的miR-124探针，加入100μl的杂交缓冲液（Ambion）、混匀。把脑片上的盖玻片移去，加上含探针的100μl的杂交缓冲液，盖上一个新的盖玻片，放回保湿盒中，放至温箱中52℃杂交过夜。

第四步：洗涤

1.50%甲酰胺，2xSSC，0.1%Tween-20于57℃洗四次，每次15分钟

2.50%甲酰胺，0.2xSSC，0.1%Tween-20于57℃洗四次，每次15分钟

3.1xPBS中洗两次，每次10分钟

第五步：抗体检测信号

1.在室温下用含10%胎牛血清的1x PBS封闭脑片1小时

2.加400μl1:2000稀释的HRP交联的anti-DIG抗体（Roche）室温孵育2小时

3.缓冲液I（0.1M Tris0.1M NaCl pH7.5）中洗涤两次，每次15分钟

4.缓冲液I（0.1M Tris0.1M NaCl pH9.5）中洗涤15分钟

5.按说明书1:50稀释NBT/BCIP储存液（18.75mg/ml氮蓝四唑和9.4mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐,Roche），加400μl稀释的NBT/BCIP底物于脑片上，37℃显色反应3小时，TE缓冲液中终止

6.封片后拍照，结果见图5，通过原位杂交实验，本发明的miR-124探针检测到miR-124在E12.5小鼠胚胎中脑的分化的神经元（mantle zone）中特异性地高表达。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备重组有模板DNA的质粒

设计模板DNA序列：模板DNA为双链，两端含有相同的酶切位点；模板DNA设有至少一个颈环-探针结构，所述颈环为含内切酶位点的可成环结构，所述探针为与任一微RNA完全互补的单链DNA探针；模板DNA还带有切口酶位点；

合成所述的模板DNA并连接至质粒中，经测序验证无突变并扩增；

(2)酶切并连接模板DNA

从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；

(3)切单链，滚环复制

用切口酶切断模板DNA的一条链，加入phi29DNA聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环-探针结构的DNA单链；

(4)目的短单链DNA的制备

对步骤(3)的自发形成颈环二级结构的DNA单链产物采用内切酶切割，在颈环和DNA探针序列之间切断，形成与微RNA完全互补的目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到含单一序列的无突变的单链DNA探针。

2.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的内切酶为BtsCI或BspPI，所述的内切酶位点为BtsCI位点或BspPI位点，内切酶与内切酶位点相对应。

3.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的切口酶位点为Nt.BstNBI位点，所述的切口酶为Nt.BstNBI。

4.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：采用末端转移酶在纯化后的单链DNA探针端部加上标记物；或者在聚合酶扩增时加入带标记物的扩增底物。

5.根据权利要求4所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的标记物包括地高辛、荧光素、生物素或同位素。

6.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的目的单链DNA探针大小为10-30bp。