CN103159853A - 全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用，该Fab抗体是按照如下方法制备而成：从丙型肝炎感染患者中分离淋巴细胞，并通过噬菌体展示技术分离全人源抗丙型肝炎核心抗原的抗体基因，采用Fab抗体基因表达方法，表达并分离得到相应的抗体蛋白，其可用于丙肝炎核心抗原的检测。

Description

全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因重组抗体药物技术领域，具体而言，涉及全人源基因重组Fab抗体,尤其涉及特异地针对丙型肝炎核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用。

背景技术

丙型肝炎病毒（Hepatitis Virus C type,HCV）是一种能够引起人类非甲非乙型肝炎的RNA病毒，其主要经血液途径传播，据统计目前全世界约有1.7亿HCV的感染者，我国的丙型肝炎感染者已经超过4000万。目前还没有针对HCV的有效疫苗用以预防丙型肝炎的传播，因此为防止医源性的丙型肝炎的传染，HCV感染的诊断和血液制品生产相关领域的筛查，对于阻止HCV的传播具有重要的意义。

目前，国内外针对丙型肝炎的诊断试剂盒分为两种，一种是检测病人血液或其它样品中存在的HCV病毒基因组，而采用RT-PCR方法进行定量检测；另一种则采用免疫学方法检测样品中的HCV相关的抗原和或抗体。针对抗HCV病毒相关的抗体类试剂盒在检测HCV感染的“窗口期”约70-80天；而针对HCV核心抗原的，用抗HCV核心抗原的单抗的双抗体夹心法检测样品中存在的HCV核心抗原，使检测HCV感染的“窗口期”提高至14天，但两种试剂盒均各有优缺点。

单克隆抗体技术、基因重组抗体技术已经是比较成熟的技术，并且通过杂交瘤技术已经制备了多种针对HCV的单克隆抗体。也有采用噬菌体展示技术，构建了针对HCV的抗体库。我们通过噬菌体技术从HCV感染者中分离外周血单个核细胞，建立了相应的抗HCV抗体展示库，并从该库中筛选到能够与HCV核心抗原具有高亲和力的噬菌体颗粒，并通过基因克隆技术获得相应的抗体基因，采用全人源抗体基因工程表达技术，在大肠杆菌中实现全人源Fab抗体的表达。利用本方法制备的Fab抗体可能作为HCV诊断试剂盒的组分用于诊断试剂盒的开发，并且该Fab抗体可能具有治疗HCV的潜在价值。

发明内容

本发明通过基因重组技术，克隆抗HCV核心抗原的抗体基因，表达并分离纯化全人源抗HCV核心抗原的基因工程Fab抗体，并将该抗体用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是用于早期复查HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本发明的目的在于提供一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用、编码该Fab抗体的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。

本发明的目的是这样实现的：

一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中：（1）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；（2）轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

一种DNA分子，编码上述的基因工程Fab抗体的重链或/和轻链。

在本发明的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述基因工程Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，以及编码所述基因工程Fab抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。

上述的基因工程Fab抗体可以用于制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病的试剂或药物。

一种制备上述的基因工程Fab抗体的方法，包括如下步骤：

（1）提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；

（2）用步骤（1）所述的表达载体转化原核宿主细胞；

（3）在适合所述的基因工程Fab抗体表达的条件下培养步骤（2）所得的原核宿主细胞；

（4）分离纯化获得所述的基因工程Fab抗体。

上述的制备方法，其中所述的表达载体为分泌型表达载体，该分泌型表达载体能在分泌信号引导下使所述基因工程Fab抗体的多肽链被分泌到原核宿主细胞周质中。

与现有技术相比，本发明涉及的基因工程Fab抗体及其制备方法具有如下优点和显著的进步：

（1）采用从感染者淋巴细胞中分离抗体基因的方法获得一种全人源的抗体基因序列，并采用基因工程技术表达FAB抗体技术，获得的一组全人源的基因工程FAB抗体；

（2）通过体外组合的方法，获得的FAB抗体具有双识别的特性。

附图说明

图1抗体重链基因PCR克隆（以pMD-VH1为例）

图2FAB抗体基因表达载体pFAB-VH1的构建

图3FAB抗体基因表达载体pFAB-VH2的构建

图4FAB抗体基因表达载体pFAB-VK1的构建

图5FAB抗体基因表达载体pFAB-VK2的构建

图6分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB-VH1CH的构建

图7分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB-VH2CH的构建

图8分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB-VK1CK的构建

图9分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB-VK2CK的构建

图10分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH1CH-VK1CK的构建

图11分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH-VK1CK的构建

图12分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH1CH-VK2CK的构建

图13分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH-VK2CK的构建。

具体实施方式

本发明涉及的基因工程Fab抗体的制备包括如下步骤：

1、采用HCV感染病人，经过诊断是抗HCV核心抗原抗体阳性的患者，从一病人中分离出外周血单个核细胞，采用常规分子生物学技术，分离细胞总RNA，反转录出cDNA,并用针对抗体基因重链可变区和轻链可变区基因的通用引物进行扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，经过双酶切并与同样酶切的pCOMB3，连接并转化大肠杆菌，并在辅助噬菌体作用下，建立相应的噬菌体展示库。

2、将重组人HCV核心抗原包被到酶标板上，将上述噬菌体展示库经过四轮淘洗筛选，获得表达具有抗HCV核心抗原高亲和力的噬菌粒。经过转化、扩增、提取噬菌体DNA，将阳性克隆进行测序并分析抗体可变区基因序列及编码氨基酸。

共选择具有较高亲和力的两个阳性克隆，对它们的轻链和重链分别进行序列分析，结果为重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示,轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。其对应的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示,轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

3、设计与Fab抗体表达载体pFABs相匹配的带相应酶切位点的针对前述各个抗体重链和轻链基因引物，PCR，以阳性噬菌粒为模板，扩增各个基因片段，并亚克隆到pMD-18(TaKRa,Inc)载体中，分别得到各个基因重组质粒，标记为pMD-VH1、pMD-VH2、pMD-VK1和pMD-VK2（参见图1）。

4、按设计的限制性内切酶位点，进行双酶切获得相应的基因片段，采用基因亚克隆技术将获得的各个抗体基因可变区与含有人源抗体基因相应的恒定区的pFab1和pFab2连接，构建相应的抗HCV核心抗原抗体的重链和轻链表达载体，pFAB1-VH1CH,pFAB1-VH2CH,pFAB2-VK1CK,pFAB2-VK2CK四个重组载体，经过筛选鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21菌，并进行诱导表达分析，建立表达抗HCV核心抗原的Fab抗体的工程菌，用于制备重组全人源Fab抗体。

5、为优化或提高表达抗体表达水平，采用一个抗体链一个表达载体、一个工程菌进行表达的方式。

6、表达工程菌经过发酵、收集发酵菌体、破菌、分离纯化包涵体，并经过包涵体的洗涤、变性和复性，然后采用离子交换、凝胶过滤等纯化手段，获得纯化多肽，按分子摩尔比进行重链多肽与轻链多的混合以完全复性成为FAB抗体，并经过亲和层析纯化得到最终获得具有高亲和力的抗HCV核心抗原的Fab抗体。更佳地是，采用变性后的抗体轻链与重链蛋白，经过两两组合后，一起复性的方法，以抗体轻链与重链的相互作用促进复性过程。此外，通过轻链和重链的组合，可以使产生的抗体可能识别两个不同表位的特点。

7、又通过将表达重链基因的转录表达盒子亚克隆到表达抗体基因轻链基因转录盒子的载体中，建立双顺反子以同时在一个菌体内表达重链、轻链基因多肽，获得相应的Fab抗体蛋白表达，并在编码基因上游包含有分泌表达相关的信号肽序列以实现Fab抗体的分泌表达。

8、对于以分泌表达表达的FAB抗体直接应用亲和层析进行纯化，获得重组抗体。

9、对获得的全人源重组Fab抗体进行表位识别分析，确定所获得的抗体具有不同的识别表位，分别是HCV核心抗原的表位FPGGGQIV和EDGVNYATGN。

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1抗HCV抗体噬菌体展示库的建立

1、人外周血淋巴细胞的分离

从医院门诊随机取5例经第2代ELISA试剂检测血清抗HCVIG强阳性，PCR检测HCVRNA阳性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴细胞分层液按常规方法制备人外周血淋巴细胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置显微镜计数，分装(每管5×106细胞)。5例患者经HCV5′端非编码区型特异性引物PCR分型，4例为1b型，1例为3型。

2、总RNA提取和cDNA第1链的合成

以Trizol提取细胞总RNA，按说明书操作。取RNA2μL测A260nm和A280nm值鉴定其浓度和纯度。另取5μ LRNA，用6g/L琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。取10μg RNA溶液，加入Oligo dT 4μL(0.4μg)，于70℃变性8min，冰浴5min。分别加入5×Buffer10μL，2.5mmol/LdNTP10μL，0.1mol/LDTT5μL，RNA酶抑制物40U和M-MLV 400U，用DEPC处理水补足体积至50μL，37℃水浴1h，95℃5min，冰浴10min，于-20℃储存。

3、引物设计及扩增

Fd和k基因PCR所用人抗体引物，根据Kang^〔6〕的设计加适当改动和简并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。

IgG1CH 3′端引物为：5′-GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG；

VH5′端引物：

P1为：5′-SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由VH1a与VH3a简并与)；

P2为：5′-SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG(由VHlf与VH3f简并)；

P3为：5′-CAGGTGCAGCTRCTCGAGTCGGG(由VH与VH4f简并)。

Ck3′端引物为：5′-GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；

Vk5′端引物为：5′-GAMATYGAGCTCACSCAGTCTCCA(由Vk1a与Vk3a简并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重链引物中分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列(下画线部分)；轻链引物中分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列(下画线部分)。每管以5μl cDNA为PCR反应的模板，分别对Fd和k基因进行扩增。

4、大肠杆菌的电穿孔转化

将2.5mL过夜培养的XL1-Blue菌液，接种在400mL含有四环素10mg/L的SB中，37℃培养至A600nm值为0.5。置冰浴中15min，于4℃离心弃上清，用100mL/L冷甘油水将细菌洗涤3次后，悬于4mL100mL/L甘油中即为感受态细胞。分装(每管0.2mL)，于液氮中冻5min后，取出，置-70℃冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书中所述方法进行电穿孔转化。

5、噬菌体抗体库的构建

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，以QIAGEN凝胶提取Kit纯化，SacI＋XbaI双酶切，再以PCR产物纯化Kit纯化。然后用T4DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌。扩增后提取质粒得到含轻链片段的pComb3。对其进行XhoI＋SpeI双酶切，并与用相应酶切的重链FdPCR产物连接，电穿孔转化XL1-Blue。转化后的细菌加2mL预热的SOC，置37℃振荡培养1h后，转移至SOC固体平板(含氨苄青霉素100mg/L，四环素10mg/L)，于37℃培养24h。用SB洗下菌苔，取20μL菌液加入20mL含氨苄青霉素的SB中，37℃培养至A600nm约为0.5。加入约1011pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃培养1h，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素，振荡培养过夜。离心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴1h后，于4℃以12000r/min离心。弃上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min离心5min，弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库，对库容测定结果为1.2*10⁷。

实施例2抗HCV核心抗原阳性噬菌粒的分离

1、噬菌体抗体库的筛选

将HCV核心抗原蛋白以每孔100ng包被ELISA板条，用30g/LBSA封闭、PBS洗后，加入噬菌体抗体库100μL(约1012cfu)，37℃温育2h。吸出噬菌体抗体液，以PBST洗1次(第2轮洗5次，第3，4，5轮各洗10次)，PBS洗1次，加入100μL洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，并含1g/LBSA)于室温静置10min。将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6μL2mol/L Tris中和，并加入2mLXL1-Blue，于37℃静置20min后，再加入20mLSB(含氨苄青霉素和四环素)，取10μL稀释铺平板测定cfu。其余细菌置37℃培养2h后，加入VCSM13和卡那霉素。噬菌体的沉淀和收集均按实施例1步骤5中的程序进行。反复进行“吸附→洗脱→扩增”4次淘洗，以使特异性噬菌体抗体高度富集。

2、单克隆噬菌体抗体的制备及鉴定

将经第4轮筛选、洗脱的噬菌体感染XL1-Blue后划平板，过夜培养。随机挑选细菌菌落，接种于4mL含氨苄青霉素和四环素的SB中，置37℃振荡培养过夜。取200μL加到4mL含同样量抗菌素的SB中，再37℃振荡培养2h，加入40μL的VCSM13培养2h后，加卡那霉素至70mg/L，置30℃振荡培养过夜。离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，置4℃保存。将待检噬菌体抗体与等量10g/LBSA混合后，置室温孵育20min，加到已经HCV核心抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗体进行结合反应，以TMB显色。实验中采用VCSM13作为阴性对照。

3、抗HCV核心抗原抗体基因的分离与鉴定

将筛选到的阳性克隆，采用Qiagen小量质粒抽提试剂盒，送公司进行测序，获得表达抗体基因的序列。

实施例3抗HCV核心抗原Fab抗体的表达载体构建与表达

1、设计引物

根据已经测定的抗体重链和轻链基因序列，分别设计扩增出抗体基因的重链可变区和轻链可变区的引物，如下表1：

表1抗体扩增引物

2、PCR扩增抗体的各链基因可变区

采用阳性噬菌体DNA为模板，采用不同配对引物组合，并使用高保真的PrimStar(购自TAKARA Inc.)基因进行PCR扩增以获得各个抗体可变区基因编码片段。条件如下：

50μl PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

其中引物组合：

(1)VH1_UP+VH1_DOWN：扩增产物为VH1，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(2)VK1_UP+VK1_DOWN:扩增产物为VK1，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

(3)VH2_UP+VH2_DOWN：扩增产物为VH2，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

(4)VK2_UP+VK2_DOWN:扩增产物为VK2，核苷酸序列SEQ ID NO:8所示。

3、PCR产物的电泳分离及纯化：

将4种PCR扩增产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）分离目的基因条带20分，电泳胶在凝胶成像系统下切取含有目的基因片段凝胶条；采用DNA凝胶回收试剂盒（SolarbioInc）按说明书进行纯化:

(1)按1：3重量/积体比加入溶胶液，置于55度水浴10分钟，期间颠倒混合数次以保证充分溶胶;

(2)加入7：10从中体积比的异丙醇混匀后加到吸附柱，8000rpm,4度离心1分，将收集柱中液体再加到柱中再吸附一次，8000rpm，4度再离心1分，弃取废液;

(3)向吸附柱中加入0.5ml漂洗液，12000rpm,4度离心30秒，重复一遍，弃去收集柱中废液，吸附柱以12000rpm,4度离心3分

(4)将吸附柱转移到一新的收集管，向吸附柱中央加30微升无菌水（或10mM Tris-EDTA溶液，pH>8.0为佳），放置于60-70度烤箱内5分，取出后12000rpm,4度离心2分，收集柱内即纯化的DNA片段;

(5)用Nano-1000微量分光光度计测定DNA浓度后，置于-20度冰箱内备用。

4、PCR产物克隆到pMD-18T载体及鉴定

纯化的PCR产物按TaKaRa公司T载体说明，连接到pMD-18T载体中，获得相应的4种重组质粒，目标产物分别命名pMD-VH1，pMD-VK1,pMD-VH2,pMDVK2（参见图1）。

（1）连接反应

连接反应的组成是：

pMD-18T                    0.5ul

PCR产物(>100ng)            4.5ul

Sol I(T4 Ligase,Buffer)    5.0ul

混匀后，置16度水浴3小时，进行连接反应；

（2）大肠杆菌的转化

采用化学感受菌（DH5a,购自Solarbio Inc）进行转化：取3微升连接反应液加到50微升感受态菌中，置于冰上30分，转移到42度水浴90秒进行热冲击后，转移到冰上置5分，加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有氨苄青霉素（100mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

（2）重组克隆的筛选鉴定

A）重组克隆的菌落PCR筛选：

从转化平板上挑取10个分离良好的单菌落，接种在10个加有无菌水的PCR管中进行充分混匀，分别吸取5微升加入有含有氨苄青霉素的1ml LB中，作相应的编号离心管用于37度摇床培养；另外10个PCR管中的5微升将被作为菌落PCR的模板，进行PCR反应；

PCR反应程序：

进行筛选时，延伸时间可根据所扩目标基因片段长度进行调整，循环次数也可按时间安排调整；PCR结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，扩增出基因产物并且大小是较目标基因片段略大100bp者是为阳性克隆；根据阳性克隆的编号将相应的离心管中菌液转接到加有5ml含氨苄青霉素(100mg/ml)的试管中摇过夜。

B）小提质粒DNA：

按质粒DNA小量抽提试剂盒说明（Solarbio Inc）进行：收集过夜菌1.5ml到1.5微量离心管中，10000rpm离心1分沉淀细菌，弃上清，加0.25ml溶液I充分悬浮菌体沉淀，加入溶液II0.25ml轻轻倾倒数次以混匀，室温放2分（溶液应已经完全清亮），加0.35ml溶液III后迅速颠倒混5-10次使蛋白质和基因组沉淀析出，12000rpm，4度离心10分，将上清轻轻到至吸附柱中，8000rpm，4度离心30秒，将收集管中液体再加至吸附柱中吸附一次，离心去除刻液后，向吸附柱中加入0.5ml漂洗液，12000rpm，4度离心1分，重复一次，弃去收集管中废液，将吸附柱再12000rpm,4度离心3分，向吸附柱中央加入50微升无菌水（或10mM Tris-EDTA溶液，pH>8.0为佳），放置于60-70度烤箱内5分，取出后12000rpm,4度离心2分，收集柱内即纯化的DNA质粒，用Nano-1000微量分光光度计测定DNA浓度后，可进行下一步酶切反应，多余部分置于-20度冰箱内备用。

C）双酶切鉴定重组质粒：

重组质粒（以pMD-VH1举例）的双酶切反应组成如下;

反应液经混匀后置于37度水浴中3小时，进行酶切反应。反应结束后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，能够切出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆，保存质粒；此前的过夜菌为甘油菌：1.5菌液离心收集后，弃上清加入不含抗生素的含15-25%甘油，优先地20%的LB培养基，悬浮后作为冻存甘油管备用（冻2管）。

D）重组质粒的序列测定：

将冻存的甘油管送测序公司（如上海美季生物工程有限公司）进行M13正向测序，获得测序结果与设计的基因序列及Genebank序列进行比对。

5、各个抗体重链或轻链基因的表达载体的构建

参见图2-图9，将经过测序验证的抗体基因重链可变区与表达重链的载体pFAB1和pFAB_pelB_1进行亚克隆，获得重组表达载体分别命名为：pFAB-VH1CH,pFAB_pelB-VH1CH,pFAB-VH2CH,pFAB_pelB-VH2CH;

将经过测序验证的抗体基因轻链可变区与表达轻链的载体pFAB2和pFAB_pelB_2进行亚克隆，获得重组表达载体分别命名为：pFAB-VK1CK,pFAB_pelB-VK1CK,pFAB-VK2CK,pFAB_pelB-VK2CK：

（1）基因片段与表达载体的准备：

经过测序验证的重组克隆pMD-VH1，pMD-VK1,pMD-VH2,pMD-VK2与pFAB1，pFAB_pelB1，pFAB2，pFAB_pelB2分别采用NcoI/NheI及NcoI/BsiW I双酶切，酶切条件：

纯化的pMD-VH1等（1ug）:      10.0ul

Buffer:                      2.0ul

Nco I(5U/ul):                0.5ul；

Nhe I(5U/ul):                0.5ul；

ddH₂O:                       7.0ul

反应混合后置于37度水浴中，温育3小时。

酶切完成后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，并分别回收各个片段。

（2）连接反应

连接反应组成(以pFAB-VH1CK的连接反应举例)：

混匀后，置16度水浴3小时，进行连接反应；

（3）大肠杆菌的转化

采用化学感受菌（DH5a,购自Solarbio Inc）进行转化：取3微升连接反应液加到50微升感受态菌中，置于冰上30分，转移到42度水浴90秒进行热冲击后，转移到冰上置5分，加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有卡那霉素（50mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

(4)克隆的筛选鉴定

A）重组克隆的菌落PCR筛选：

从转化平板上挑取10个分离良好的单菌落，接种在10个加有无菌水的PCR管中进行充分混匀，分别吸取5微升加入有含有卡那霉素（50mg/ml）的1ml LB中，作相应的编号离心管用于37度摇床培养；另外10个PCR管中的5微升将被作为菌落PCR的模板，进行PCR反应；

PCR反应程序：

进行筛选时，延伸时间可根据所扩目标基因片段长度进行调整，循环次数也可按时间安排调整；PCR结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，扩增出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆；根据阳性克隆的编号将相应的离心管中菌液转接到加有5ml含卡那霉素（50mg/ml）LB的试管中摇过夜。

B）小提质粒DNA：

按质粒DNA小量抽提试剂盒说明（Solarbio Inc）进行：收集过夜菌1.5ml到1.5微量离心管中，10000rpm离心1分沉淀细菌，弃上清，加0.25ml溶液I充分悬浮菌体沉淀，加入溶液II0.25ml轻轻倾倒数次以混匀，室温放2分（溶液应已经完全清亮），加0.35ml溶液III后迅速颠倒混5-10次使蛋白质和基因组沉淀析出，12000rpm，4度离心10分，将上清轻轻到至吸附柱中，8000rpm，4度离心30秒，将收集管中液体再加至吸附柱中吸附一次，离心去除刻液后，向吸附柱中加入0.5ml漂洗液，12000rpm，4度离心1分，重复一次，弃去收集管中废液，将吸附柱再12000rpm,4度离心3分，向吸附柱中央加入50微升无菌水（或10mM Tris-EDTA溶液，pH>8.0为佳），放置于60-70度烤箱内5分，取出后12000rpm,4度离心2分，收集柱内即纯化的DNA质粒，用Nano-1000微量分光光度计测定DNA浓度后，可进行下一步酶切反应，多余部分置于-20度冰箱内备用。

C）双酶切鉴定重组质粒：

重组质粒（以pFAB-VH1CH举例）的双酶切反应组成如下;

反应液经混匀后置于37度水浴中3小时，进行酶切反应。反应结束后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（10V/Cm胶）20分，结果凝胶成像分析，能够切出基因产物并且大小是与目标基因片段一致者是为阳性克隆，保存质粒；此前的过夜菌为甘油菌：1.5菌液离心收集后，弃上清加入不含抗生素的含15-25%甘油，优先地20%的LB培养基，悬浮后作为冻存甘油管备用。

6、分泌型FAB的表达载体构建

参见图9-图13，将pFAB_pelB-VH1CH,pFAB_pelB-VH2CH两个重组载体按上述方法，亚克隆到pFAB_pelB-VK1CK,pFAB_pelB-VK2CK以构建出四种载体，将前面克隆的两条重链基因的四种表达盒子，通同样的亚克隆技术，构建FAB抗体表达载体分别命名为：

pFAB_pelB-VH1CH-VK1CK,pFAB_pelB-VH1CH-VK2CK,pFAB_pelB-VH2CHVK1CK,

pFAB_pelB-VH2CH_VK2CK四种载体，能够表达具有双特异识别的位点的FAB抗体。操作过程同上述步骤5。

7、各个抗体重链或轻链基因的表达

(1)BL21菌感受态菌的转化

将经过亚克隆并PCR和酶切鉴定的各个重组表达载体pET41-HCVCore_N,pET41-HCVCore_M,pET41-HCVCore_C,pET41-HCVCore_120,pET41HCVCore_191及pET41a空载体转化菌BL21：取前述鉴定准确的各个重组质粒0.5微升，加入50微升BL21感受态菌（Solarbio Inc），置冰上30分，转移至42度水浴热休克90秒后，移至冰上置5分，向转化管中加入无抗生长素的LB培养基1ml，转移到37度摇床慢摇45分，5000rpm,4度离心10分，弃去多余的培养基，将留下约200微升的菌轻轻吹吸数后加到含有卡那霉素（50mg/ml）的LB琼脂平板，均匀涂布至干，置于37度培养箱培养过夜。

(2)转化克隆的培养、自诱导表达

从生长并分离良好的转化平板上，任意挑取6个克隆，接种到含有3ml自诱导表达培养基（0.02%葡萄糖，0.2%的乳糖，50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4,10mM Mg2SO4,10mM MgCl2,2%蛋白胨，1.5%酵母抽提物）中，挑一个转化克隆接种于含卡那霉素（50mg/ml）和2%葡萄糖3ml LB培养基中作为阴性对照，从空载体转化板挑一克隆接种于3ml自诱导表达培养基作阳性载体对照，过夜后收集表达菌体。

(3)重组蛋白表达水平的丙烯酰胺凝胶电泳分析

收集样品处理：向菌体沉淀中100ul PB溶液（50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4，pH7.2）充分悬浮后，加入2*上样缓冲液（2xSDS凝胶加样缓冲液:100mmol/L Tris—HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，4%SDS(电泳级)，0.2%溴酚蓝，20%甘油）100微升，混匀后85度以上煮5分钟，样品用于丙烯酰胺电泳上样（或可冻于-20度备用）。丙烯酰胺凝胶电泳：常规配制12%丙烯酰胺凝胶，电泳按蛋白Marker、阴性对照、载体对照、克隆1-6、蛋白Marker上样，60伏稳压电泳30分，调整到90伏稳压90分结束，进行考马氏亮蓝染色及脱色程序后，在凝胶成像系统下拍照并扫描分析各蛋白的相对浓度，确凿各相对表达水平，选择表达重组蛋白较高者以保存。

(4)建立高表达种子库

选择重组蛋白表达相对的克隆的培养，转接50ml培养基（卡那霉素（50mg/ml）和2%葡萄糖的LB）在37度摇床培养，待菌体OD600达到1.5左右时无菌离心收集菌，以1/4体积的含15%甘油的LB悬浮充分后，按每管1ml分装，冻存于-80度冰箱，即种子库。

(5)重组核心抗原片段融合蛋白表达

A）自诱导表达发酵培养基配制：按前述自诱导表达培养配制含有0.02%葡萄糖，0.2%的乳糖，50mM Na2HPO4,50mM NaH2PO4,10mM Mg2SO4,10mM MgCl2,2%蛋白胨，1.5%酵母抽提物的发酵培养基，分装后进行常规高压菌。

B)种子液的培养：取种子一管，接入加有50mg/ml的卡那霉素的100ml LB的烧瓶（500ml瓶），37度，250rpm振荡培养过夜。

C)按5%接种量接种子液，向培养基加入种子液，26-32度，优选地用28度，300rpm振荡过夜进行自诱导表达，表达结束离心收集菌体，称湦重后进行下一步纯化（或者冻于-20度保存备用）

实施例4抗HCV核心抗原Fab抗体的纯化与分析鉴定

FAB抗体的表达采用二种策略，因此纯化也是采用二套程序，通过包涵体变复性的工艺及直接亲和层析的纯化工艺，纯化得到具有较高亲和力，且具有不同的识别位点的重组FAB抗体。具体实施过程包括：

1、表达菌体的裂解

经过诱导表达的菌体采用化学裂解法，按每克湿菌加入5-10ml细菌裂解液（2%Triton-X100,10-50ug/ml溶菌酶，1mM DTT,0.2M磷酸盐缓冲液，优选采用默克公司的BugBuster溶液）充分悬浮菌体，37度慢摇温育1小时;于4度12000转/分高速离心20分，收集上清即用于下一步亲和层析纯化。

2、包涵体的洗涤、溶解

（1）包涵体的洗涤：

用包涵体洗涤液I（50mM Tris-HCl(pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇，0.5%Triton X-100）按每克湿菌重加入10ml将包涵体粗制品重悬，并连续搅拌2小时,以10000rpm离心15min，重复洗涤一次。用包涵体洗涤液II（2M Urea，50mM Tris-HCl(pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇，2%Triton X-100）同样按每克湿重加10ml溶液重悬后，充分搅拌2小时，以12000rpm离心收集包涵体沉淀物。

（2）包涵体的变性：

用包涵体变性液（8M尿素，20mM Tris-HCl(pH9.0),2mM EDTA,10mMβ-巯基乙醇）重悬包涵体沉淀，并于室温搅拌2小时使充分变性溶解，以12000rpm离心20分，收集上清即为包涵体变性液，对其进行浓度测定。

3、离子交换及分子凝胶层析

(1)阴离子交换：经过变性溶解的抗体溶液通过包涵体变性液稀释，并调节pH为8.0,离子强度小于0.05，尿素浓度降低为4M。以5ml/min的流速上样，采用含有4M尿素的0.1-0.5MNaCl的稀释液进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白峰，并进行SDS-PAGE分析鉴定。

(2)Superdex G200凝胶过滤：凝胶过滤柱Superdex-G200用洗脱液（4M尿素,50mMTris-HCl(pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,10mMβ-巯基乙醇）平衡，收集重组经过离子交换的纯化抗体，以1.0ml/min流速上样，以洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白峰，并作SDS-PAGE分析鉴定重组抗体。

4、FAB抗体的复性

将分别表达的Fab抗体重链和轻链包涵体变性液按等分子摩尔数比例混匀，采用含复性洗脱液（2M尿素，50mM Tris-HCl(pH9.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇）进行4度透析复性24小时，中间更换4次透析液，透析结束后以12000rpm，4度离心收集上清，即得复性的重组抗体。

5、ProteinA柱亲和层析纯化

分泌表达FAB抗体细菌则首先采用低渗法裂解细胞，离心收集细胞周质上清,具体步骤包括：经离心收集菌体用含0.8mg/ml的25mmol/L的Tris-Cl(pH7.3)缓冲液（按1：20重量/体积比）充分悬浮,冰浴30min;1000rpm,重新离心收集菌体,再加入前述体积的2倍双蒸水重悬浮,冰浴30min;同样条件离心,上清即大肠杆菌周质蛋白。

上述周质溶液可以与已经复性好的FAB抗体溶液一样，可用ProteinA亲和层析法进行一步纯化：

ProteinA亲和层析柱（Qiagen Inc）经上样缓冲液（10mM Tris，0.15M NaCl，0.2% NP-40，pH7.4）充分平衡后，加入复性液，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。用漂洗液（0.5% BSA,10mM Tris，0.15M NaCl，0.2%NP-40，pH7.4）充分洗柱到流出液的OD280<=0.01，取10ul漂洗时开始的流出样品用于SDS-PAGE分析。新配置100mM甘氨酸(pH2.5)抗体洗脱液，（以1ml收集管为例）在预装有100μl洗脱液（1MTris（pH8.0））的收集管中收集流出液，使抗体中和并复性稳定。第1次洗脱用400μl抗体洗脱液，第2，3次用200μl。用BCA法测定抗体浓度，并保存于-20度以下。

6、FAB抗体的识别特性分析

根据HCV核心抗原成熟蛋白的推定氨基酸殘基序列，以每15个殘基的长度进行全分子的合成肽的化学合成，并保证合成肽之间有5个氨基酸殘基的重叠，每上合成肽均用BSA偶联（委托上海生工生物工程有限公司合成），以用于作分析抗体识别特征的包被抗原，采用双抗体夹心法ELISA分析，结果所得的FAB抗体具有不同识别位，其中两种识别序列为：FPGGGQIV和EDGVNYATGN

具体操作过程：

1)在包被溶液中稀释合成的偶联多肽（一般0.5-4μg/ml），将该稀释后的捕获抗原100μl/孔加入到酶标板内，按常规对包袱抗原每种作三复孔；

2)将板封好防止蒸发，在4℃孵育过夜。

3)吸干每一板孔并加洗液400μl洗涤，重复3次。板中液体移出并将板子在干净的纸巾上吸附；

4)加200-300μl/孔封闭液封板，室温孵育1小时；5)每孔加100μl适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打板子1分钟。贴上封板膜，室温孵育2小时；

6)重复步骤3；

7)每孔加100μl经过适当稀释的生物素化的检测抗体（鼠抗人抗体），贴上新的封板膜，室温孵育2小时；

8)重复步骤3；

9)每孔加100μl经过适当稀释的Avidin-HRP酶结合物30分；

10)重复步骤3；

11)每孔加100μl底物溶液，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应；

12)每孔加50μl终止液，轻轻振荡板子确保充分混匀；

13)在30分钟内在酶标仪上对结果进行判读；

14)数据分析和计算。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>浙江家和制药有限公司

<120>全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>129

<212>PRT

<213>重链可变区VH1

<400>1

Met Asp Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

            20                  25                  30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys

        35                  40                 45

Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu

    50                  55                 60

Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ile Thr

65                  70                  75                 80

Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

                85                  90                  95

Phe Cys Ala Arg Ala Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Tyr Asp Tyr

            100                 105                 110

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

        115                 120                 125

Ser

<210>2

<211>124

<212>PRT

<213>重链可变区VH2

<400>2

Met Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

            20                  25                  30

Asp Tyr Pro Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys

        35                  40                  45

Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ile Thr

65                  70                  75                  80

Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

                85                  90                  95

Phe Cys Ala Arg Gly Gly Gly Val Arg Arg Gln Val Met Asp Tyr Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

        115                 120

<210>3

<211>113

<212>PRT

<213>重链可变区VK1

<400>3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

            20                  25                   30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                   45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

                85                  90                  95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105                 110

Thr

<210>4

<211>114

<212>PRT

<213>重链可变区VK2

<400>4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

            20                  25                   30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile

    50                  55                  60

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn

65                  70                  75                  80

Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

                85                  90                  95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

        100                 105                 110

Arg Thr

<210>5

<211>387

<212>DNA

<213>重链可变区VH1

<400>5

atggatcaga tccagttggt gcagtctgga cctgagctga agaagcctgg agagacagtc      60

aagatctcct gcaaggcttc tgggtatacc ttcacaaact atggaatgaa ctgggtgaag      120

caagctccag gaaagggttt aaagtggatg ggctggataa acaccaacac tggagagcca      180

acatatgctg aagagttcaa gggacggttt gccttctctt tggaaacctc tgccatcact      240

gcctatttgc agatcaacaa cctcaaaaat gaggacacgg ctacatattt ctgtgcaaga      300

gcggggggag attactacga tagtagctac gactatgcta tggactactg gggtcaagga      360

acctcagtca ccgtctcctc agctagc                                          387

<210>6

<211>372

<212>DNA

<213>重链可变区VH2

<400>6

atggcccaga tccagttggt gcagtctgga cctgagctga agaagcctgg agagacagtc      60

aagatctcct gcaaggcttc tggttatacc ttcacagact atccaatgaa ctgggtgaag      120

caagctccag gaaagggttt aaagtggatg ggctggataa acactgagac tggtgagcca      180

acatatgctg aagagttcaa gggacggttt gccttctctt tggaaacctc tgccatcact      240

gcctatttgc agatcaacaa cctcaaaaat gaggacacgg ctacatattt ctgtgctaga      300

gggggtgggg tccgacgcca ggttatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc      360

tcctcagcta gc                                                372

<210>7

<211>345

<212>DNA

<213>轻链可变区VK1

<400>7

atggaagaca ttgtgctgac ccaatcccca gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg      60

gccaccatct cctgcaaggc cagccaaagt gttgattatg atggtgatag ttatatgaac      120

tggtaccaac agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatgctgc atccaatcta      180

gaatctggga tcccagccag gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac      240

atccatcctg tggaggagga ggatgctgca acctattact gtcagcaaag taatgaggat      300

ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gtacg                      345

<210>8

<211>349

<212>DNA

<213>轻链可变区VK2

<400>8

atggccgaca ttgtgatgtc acagtctcca tcctccctgg ctgtgtcagc aggagagaag      60

gtcactatga gctgcaaatc cagtcagagt ctgctcaata gtagaacccg aaagaactac      120

ttggtttggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tgctgatcta ctgggcatcc      180

actagggatt ctggggtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agatttcact      240

ctcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac ctggcagttt attactgcaa gcaatcttat      300

aatctgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa aaccgtacg                  349

Claims (10)

1.一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：（1）重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；（2）轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

2.一种DNA分子，编码权利要求1所述的基因工程Fab抗体的重链或/和轻链。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：它编码所述基因工程Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，以及编码所述基因工程Fab抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

4.一种表达载体，包含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

5.一种原核宿主细胞，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于：它是大肠杆菌。

7.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于：它是大肠杆菌BL21。

8.权利要求1所述的基因工程Fab抗体在制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病的试剂或药物中的用途。

9.一种制备权利要求1所述的基因工程Fab抗体的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；

（2）用步骤（1）所述的表达载体转化原核宿主细胞；

（3）在适合所述的基因工程Fab抗体表达的条件下培养步骤（2）所得的原核宿主细胞；

（4）分离纯化获得所述的基因工程Fab抗体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的表达载体为分泌型表达载体，该分泌型表达载体能在分泌信号引导下使所述基因工程Fab抗体的多肽链被分泌到原核宿主细胞周质中。

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