CN103087171B - 一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗psma/fitc双特异性抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体。目前关于PSMA的单链抗体已经多见报道，但是关于抗PSMA/FITC双特异性抗体鲜有研究。本发明所涉及双特异性抗体具有如SEQIDNo.5的全长核酸序列。本发明采用基因重组技术生产，便于大规模生产和制备；抗体分子量小，对肿瘤组织的穿透力较强，特别是针对前列腺组织具有较厚的前列腺包膜的解剖特点，小分子抗体更容易到达病变部位；可以通过预定位技术与病变部位前列腺癌细胞相结合，进而通过半抗原携带的药物或者标记物实现前列腺癌的治疗和早期诊断。

Description

一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体及其制备方法

技术领域

    本发明涉及一种抗体，具体涉及一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体及其制备方法。

背景技术

前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤之一,它位居于欧美男性肿瘤发病率的第二位。在美国,前列腺癌的发病率占所有恶性肿瘤的第一位，死亡率仅次于肺癌。在中国近年来前列腺癌发病率也呈逐渐上升趋势。对于前列腺癌的早期诊断，日益受到学者的重视，继前列腺酸性磷酸酶 (PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)等被发现并广泛应用于前列腺癌的诊治之后，一种存在于LNCaP 系前列腺癌细胞膜中的糖蛋白——前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA )越来越引起人们的关注。目前，关于PSMA的单链抗体已经多见报道，但是关于抗PSMA的双特异性抗体，特别是抗PSMA/FITC（fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素）双特异性抗体国内外均未见报道。

早期的双特异性抗体是用化学交联技术制备的，即用化学交联剂将两种不同特异性的单克隆抗体或抗体的Fab（fragment of antigen binding）片段通过二硫键或者硫醚键连成BsAb(bispecific antibody,双特异性抗体)。但是该操作易使抗体抗原结合部位的结构发生改变而影响其活性。1983年Milstein等在单克隆抗体技术的基础上，进一步扩展杂交瘤技术，用细胞工程法制备出双特异性单克隆抗体（BispecificMonoclonalAntibody,BsMAb），即将两株各自分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞再融合得到四源杂交瘤（quadroma），或将一株杂交瘤细胞株和免疫脾细胞融合获得三源杂交瘤（trioma），均可获得同时具有两种亲代单抗特异性的BsAb。但是该方法必须从大量相似的免疫球蛋白中筛选具有双特异性的BsAb，费时费力，同时多倍体杂交瘤细胞稳定性差，需要经常进行克隆。因此上述两种方法正被迅速发展的基因工程抗体制备法所取代。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程抗体制备方法得到的用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体及其制备方法，以PSMA为靶标，能够特异性结合前列腺癌细胞和半抗原FITC。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体，其特征在于：

所述的抗体具有如SEQ ID No.5的全长核酸序列：

ccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggccgaggtgcagctgcagcagtcaggacccgacctggtgaagcctggggcctcaatgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtgaaggagagacatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaaaaatggcgttactatttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaagacactgcagtctattattgtgcaagaggggactmctatggtaactactttgactactggggccaaggcaccagtctcacagtctcctcagccaaaacgacmcccaagcttggaggtggcggatccgaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaccttctctgactactggatgaactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcagatccgtaacaaaccgtacaactacgaaacctactacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacacctctaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgcaccggttcttactacggtatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgaccggtctgcagactagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggactacaaagacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcagtctctggttcactctcagggtaacacctacctgcgttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaagttctgatctacaaagtttctaaccgtttctctggtgttccgtctcgtttctctggttctggttctcagaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagtctacccacgttccgtggaccttcggtcagggtaccaaagttgaactgaaacgtgctggaggtggcggatccgacattcagatgacacagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctatactgcaacaaacttagcagatggtgtgccctcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtctgatgattctgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggcaccaccaccaccaccactgactcgagcac；

上述核酸序列的长度为1783。

一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：抗PSMA/FITC双特异性抗体核酸序列的设计与合成：

根据VL_PSMA、VH_PSMA、VL_FITC、VH_FITC的核酸序列和VH_PSMA-L-VL_FITC； VH_FITC-L-VL_PSMA的连接形式设计相应的引物，如下表所示；

步骤二：抗PSMA/FITC双特异性抗体表达载体的构建：

采用Pfu Taq酶经过PCR扩增的VH_PSMA-L-VL_FITC； VH_FITC-L-VL_PSMA基因片段分别经双酶切后，通过T4连接酶将基因片段和表达载体pET26b在16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α后，提质粒后经XbaI和XhoI双酶切鉴定证实1600bp处可以观察到目的大小片段命名为pET-PHscFv；

步骤三：抗PSMA/FITC双特异性抗体的表达和纯化：

将pET-PHscFv载体转化BL21感受态细胞后获得pET-PHscFv的大肠杆菌表达株，第二日，挑取单克隆细胞接种LB培养基中扩增培养，第三日经IPTG后16℃低温过夜诱导可以获得可溶形式表达的抗体片段；15%的SDS-PAGE凝胶电泳结果显示IPTG诱导后有一个明显的诱导条带，通过镍柱亲和纯化后可以获得纯化的抗PSMA/FITC双特异性抗体。

    本发明具有以下优点：

1、抗PSMA/FITC双特异性抗体采用基因重组技术生产，便于大规模生产和制备；

2、抗PSMA/FITC双特异性抗体分子量小，对肿瘤组织的穿透力较强，特别是针对前列腺组织具有较厚的前列腺包膜的解剖特点，小分子抗体更容易到达病变部位；

3、本发明的抗PSMA/FITC双特异性抗体可以通过预定位技术与病变部位前列腺癌细胞相结合，进而通过半抗原携带的药物或者标记物实现前列腺癌的治疗和早期诊断。

附图说明

图1为抗PSMA/FITC双特异性抗体基因全长结构示意图。

图2为抗PSMA/FITC双特异性抗体的表达纯化图，其中1为诱导前，2为IPTG诱导后，3为洗脱峰，4为穿过峰。

图3为Western Blot 鉴定BsMAB的活性图，其中1为LNCAP细胞，2为Hela细胞，3为Hek293细胞。LNCAP为PSMA阳性细胞，而Hela 和 Hek293均为PSMA表达阴性细胞，Western Blot结果证实抗PSMA/FITC双特异性抗体能够与PSMA特异性结合。

图4为抗PSMA/FITC双特异性抗体与半抗原结合活性ELISA检测图，随着抗原浓度的增高，其显色逐渐增强，说明双特异性抗体与抗原之间存在剂量依赖性。其检测滴度可达10⁵，证明表达纯化的抗PSMA/FITC双特异性抗体具有良好的灵敏度，能够满足实验检测的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）是指具有两种抗原结合特性的抗体。这类抗体的两个抗原结合位点可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇，其中一个抗原结合位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物( 如药物、效应细胞等) 结合。实际上双特异性抗体是一种杂合分子，两条重链之间与两条轻链之间的结构不同，两个Fab片段也不同。

PSMA是存在于前列腺腺上皮细胞胞膜的一种II型固有膜蛋白，具有较高的组织特异性，早在1998年Bostwick等在对187份前列腺标本的免疫学研究中就发现从良性前列腺上皮到前列腺癌高度恶性细胞，PSMA的表达大幅度提高，在癌组织中染色强度最强。在多种组织的良、恶性肿瘤大样本研究发现，在鉴别前列腺癌和其他系统恶性肿瘤时的特异性为94.5%，而在鉴别和其他尿路上皮癌时特异性为82.9%。同时，GHOSH A和Troyer等的研究均证实PSMA不像PSA 那样被分泌入血，即使在明显进展期前列腺癌患者血清中也不能检出PSMA，具有良好的组织定位特点。因此PSMA是前列腺癌分子影像学研究的重要分子靶标。本研究是在前期PSMA单克隆抗体研究的基础上，针对单克隆抗体存在的分子量较大，不易穿越肿瘤内的血管屏障以及可能存在免疫原性等问题，利用基因重组技术将轻链可变区和重链可变区基因连接而成的具有特异性抗原结合功能的小分子片段。由于不存在FC段，单链抗体（single—chain antibody fragment，scFv）几乎不存在免疫原性，同时PSMA-scFv在保持抗原亲和性的基础上还具有分子量小、穿透力强、体内半衰期短，易与效应分子结合等优点。因此PSMA-scFv可能成为前列腺癌分子影像学研究的重要分子探针。

PSMA在前列腺癌中具有特异的高度表达，在用7Ell-CS 所检测的所有184份前列腺标本中，Bostwick等均发现了阳性免疫反应，且从良性上皮组织到前列腺癌高度恶性细胞，阳性率大幅度提高，分别为69.5% 、80.2 %，而且在癌组织中染色强度最强，他们还在 200份前列腺标本的队列研究中获得类似结果。李虹等用免疫组化法比较PSMA和前列腺特异性抗原（Prostate Specific Antigen ，PSA）在不同前列腺病变组织中的表达差异, 发现PSMA 在前列腺癌中明显高表达， PSA 在前列腺良性增生组织中高表达, 组织PSMA 对前列腺癌的阳性检出率明显高于PSA (分别为94.28% 和 78.57% ).同时, PSMA的表达受雄激素的影响。wright等对比前列腺癌组织中PSMA与PSA的表达， 发现皋酮和二氢皋酮使 PSMA表达 明显降低，而PSA表达升高，在药物或手术去势患者中PSMA的表达升高，PSA 降低，故认为 PSMA 是观察复发及免疫或基因治疗效果的较好瘤标。在服SQ 还原酶抑制剂治疗 BPH 的人群中，因PSA 水平下降，故 PSMA较PSA在筛选前列腺癌患者时更具优势。

异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）是目前应用最广泛的荧光素分子，由于FITC 含有硫氰酸基团，因此可以和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记，并通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。广泛应用于医学，农学和畜牧研究以及细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。 

异硫氰酸荧光黄( FITC) 是一种具有抗原性的荧光素分子，由于FITC半抗原具有稠杂环结构，与一定的载体蛋白偶联后具有很强的免疫原性，极易与免疫球蛋白形成稳定的结合物，并且不影响抗体结合抗原的活性。因此在FITC常常被作为半抗原经偶联后生产抗半抗原抗体用于免疫测定，通过文献的检索国内仲发明、李琦、庄然等都先后研究过FITC-抗FITC系统在酶联免疫实验和免疫组化实验中的应用；国外的Vysa以及Harmer也先后分析和研究了FITC-抗FITC系统在酶免研究中的应用。而且通过研究进一步证实了FITC-抗FITC系统所具有的独特优势：（1）它可结合于任何一种蛋白质上，甚至多糖上。结合的方法也己经较好地确立，且FI T C 也已获得化学纯的制品。（2）其结合情况可用分光光度计或荧光显微镜测定。（3）荧光素FIT C与生物素不同，并不见于动物组织或体液中，因此在免疫反应中可以有效的信号降低背景。（4）亲和素和生物素间的结合只有在非常强的变性条件下才能解离，因此它不能用于细胞分析，然而FITC一抗FITC系统的反应条件相对温和，使之用于体内分析成为可能。（5） 由于每个免疫球蛋白分子平均可以结合3~ 5 个FITC 分子，可以有效地提高酶联免疫吸附试验(ELISA) 的敏感性、特异性。

抗PSMA/FITC双特异性抗体可以与前列腺癌细胞表面特异性表达的PSMA抗原以及半抗原FITC相结合，使半抗原FITC携带的效应分子与肿瘤细胞特异性结合。根据功能的不同，效应分子可以分别选择生物毒素、放射性核素以及顺磁性氧化铁纳米颗粒、Gd³⁺等。

以下具体说明抗体的制备过程：

一、抗PSMA/FITC双特异性抗体核酸序列的设计与合成：

根据VL_PSMA、VH_PSMS、VL_FITC、VH_FITC的核酸序列和PSMAV_H-L-FITCV_L；FITCV_H-L-PSMAV_L的连接形式设计相应的引物，如下表1所示，由于重组抗体在大肠杆菌中的表达往往是以包涵体的形式出现，因此我们在实验中引人了pelB前导序列，可以促进重组蛋白的正确折叠和可溶性表达，同时也有利于重组蛋白分泌到细胞周质中。而在PSMA scFv的3’端我们引入了一个能编码6×His-Tag的序列，可与上游的表达序列形成融合蛋白，它通常不影响表达产物的生物学活性。

表1  PCR引物序列

二、抗PSMA/FITC双特异性抗体表达载体的构建

采用Pfu Taq酶经过PCR扩增的PSMAVH-L-FITCVL和FITCVH-L-PSMAVL基因片段分别经双酶切后，通过T4连接酶将基因片段和表达载体pET26b在16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α后，提质粒后经XbaI和XhoI双酶切鉴定证实1600bp处可以观察到目的大小片段命名为pET-PHscFv。抗PSMA/FITC双特异性抗体基因全长结构示意图如图1。

三、抗PSMA/FITC双特异性抗体的表达和纯化

将pET-PHscFv载体转化BL21感受态细胞后获得pET-PHscFv的大肠杆菌表达株，第二日，挑取单克隆细胞接种LB培养基中扩增培养，第三日经IPTG后16℃低温过夜诱导可以获得可溶形式表达的抗体片段。15%的SDS-PAGE凝胶电泳结果显示IPTG诱导后有一个明显的诱导条带，通过镍柱亲和纯化后可以获得纯化的抗PSMA/FITC双特异性抗体。抗PSMA/FITC双特异性抗体的诱导表达与纯化的SDS-PAGE凝胶电泳结果见图2。

以下具体说明抗PSMA/FITC双特异性抗体的活性测定：

一、抗PSMA/FITC双特异性抗体的抗PSMA结合活性；

 分别将前列腺癌细胞LNCAP，宫颈癌细胞Hela和Hek293细胞裂解后，通过Western Blot鉴定BsMAB可以有效的识别前列腺癌细胞，而在宫颈癌细胞Hela和Hek293细胞中表达为阴性。证明抗PSMA/FITC双特异性抗体具有抗PSMA结合活性。Western Blot 鉴定抗PSMA/FITC双特异性抗体的活性见图3。

二、抗PSMA/FITC双特异性抗体的抗FITC结合活性

使用包被液将FITC半抗原固定到酶标版后，将已经纯化的抗PSMA/FITC双特异性抗体按照不同浓度1:10³到1：10⁶加入酶标孔中，经过37℃孵育1h后，加入辣根过氧化物酶标记的抗HIS抗体，PBST 洗涤后，加入TMB显色底物，室温反应10-15min后用终止液终止反应，490nm测定OD值。证明抗PSMA/FITC双特异性抗体具有抗FITC结合活性。其抗体滴度达到10⁵。抗PSMA/FITC双特异性抗体的与半抗原结合活性ELISA检测见图4。

以下为相关抗体的具体序列：

1、抗PSMA单链抗体具有如SEQ ID No.1的重链可变区核酸序列：

atggccgaggtgcagctgcagcagtcaggacccgacctggtgaagcctggggcctcaatgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtgaaggagagacatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaaaaatggcgttactatttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaagacactgcagtctattattgtgcaagaggggactmctatggtaactactttgactactggggccaaggcaccagtctcacagtctcctcagccaaaacgacmcccaagctt

2、抗PSMA单链抗体具有如SEQ ID No.2的轻链可变区核酸序列：

gacattcagatgacacagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctatactgcaacaaacttagcagatggtgtgccctcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtctgatgattctgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg

3、抗FITC单链抗体具有如SEQ ID No.3的重链可变区核酸序列：

gactacaaagacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcagtctctggttcactctcagggtaacacctacctgcgttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaagttctgatctacaaagtttctaaccgtttctctggtgttccgtctcgtttctctggttctggttctcagaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagtctacccacgttccgtggaccttcggtcagggtaccaaagttgaactgaaacgtgct

4、抗FITC单链抗体具有如SEQ ID No.4的轻链可变区核酸序列：

gaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaccttctctgactactggatgaactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcagatccgtaacaaaccgtacaactacgaaacctactacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacacctctaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgcaccggttcttactacggtatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttcta

5、抗PSMA/FITC双特异性抗体具有如SEQ ID No.5的全长核酸序列：

ccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggccgaggtgcagctgcagcagtcaggacccgacctggtgaagcctggggcctcaatgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtgaaggagagacatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaaaaatggcgttactatttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaagacactgcagtctattattgtgcaagaggggactmctatggtaactactttgactactggggccaaggcaccagtctcacagtctcctcagccaaaacgacmcccaagcttggaggtggcggatccgaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaccttctctgactactggatgaactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcagatccgtaacaaaccgtacaactacgaaacctactacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacacctctaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgcaccggttcttactacggtatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgaccggtctgcagactagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggactacaaagacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcagtctctggttcactctcagggtaacacctacctgcgttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaagttctgatctacaaagtttctaaccgtttctctggtgttccgtctcgtttctctggttctggttctcagaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagtctacccacgttccgtggaccttcggtcagggtaccaaagttgaactgaaacgtgctggaggtggcggatccgacattcagatgacacagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctatactgcaacaaacttagcagatggtgtgccctcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtctgatgattctgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggcaccaccaccaccaccactgactcgagcac

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  中国人民解放军第四军医大学

<120>  一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体及其制备方

       法

<130>  2012

<160>  13

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  384

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atggccgagg tgcagctgca gcagtcagga cccgacctgg tgaagcctgg ggcctcaatg     60

 

aagatttcct gcaaggcttc tggatacaca ttcactgact acaacatgga ctgggtgaag    120

 

gagagacatg gaaagagcct tgagtggatt ggagatatta atcctaaaaa tggcgttact    180

 

atttacaacc agaagttcaa gggcaaggcc acattgactg tagacaagtc ctccaccaca    240

 

gcctacatgg agctccgcag cctgacatct gaagacactg cagtctatta ttgtgcaaga    300

 

ggggactmct atggtaacta ctttgactac tggggccaag gcaccagtct cacagtctcc    360

 

tcagccaaaa cgacmcccaa gctt                                           384

 

 

<210>  2

<211>  324

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gacattcaga tgacacagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc     60

 

atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag    120

 

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatact gcaacaaact tagcagatgg tgtgccctca    180

 

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct    240

 

gatgattctg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg    300

 

gggaccaagc tggaaataaa acgg                                           324

 

 

<210>  3

<211>  351

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gactacaaag acatccagat gacccagtct ccgtcttctc tgtctgcttc tgttggtgac     60

 

cgtgttacca tcacctgccg tgcttctcag tctctggttc actctcaggg taacacctac    120

 

ctgcgttggt accagcagaa accgggtaaa gctccgaaag ttctgatcta caaagtttct    180

 

aaccgtttct ctggtgttcc gtctcgtttc tctggttctg gttctcagac cgacttcacc    240

 

ctgaccatct cttctctgca gccggaagac ttcgctacct actactgcca gcagtctacc    300

 

cacgttccgt ggaccttcgg tcagggtacc aaagttgaac tgaaacgtgc t             351

 

 

<210>  4

<211>  355

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg     60

 

tcttgcgctg cttctggttt caccttctct gactactgga tgaactgggt tcgtcaggct    120

 

ccgggtaaag gtctggaatg ggttgctcag atccgtaaca aaccgtacaa ctacgaaacc    180

 

tactacgctg actctgttaa aggtcgtttc accatctctc gtgacacctc taaaaacacc    240

 

gtttacctgc agatgaactc tctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcaccggt    300

 

tcttactacg gtatggacta ctggggtcag ggtaccctgg ttaccgtttc ttcta         355

 

 

<210>  5

<211>  1783

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg     60

 

ccgaccgctg ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatggc tatggccgag    120

 

gtgcagctgc agcagtcagg acccgacctg gtgaagcctg gggcctcaat gaagatttcc    180

 

tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa ggagagacat    240

 

ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaaaa atggcgttac tatttacaac    300

 

cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccaccac agcctacatg    360

 

gagctccgca gcctgacatc tgaagacact gcagtctatt attgtgcaag aggggactmc    420

 

tatggtaact actttgacta ctggggccaa ggcaccagtc tcacagtctc ctcagccaaa    480

 

acgacmccca agcttggagg tggcggatcc gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt    540

 

ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg tcttgcgctg cttctggttt caccttctct    600

 

gactactgga tgaactgggt tcgtcaggct ccgggtaaag gtctggaatg ggttgctcag    660

 

atccgtaaca aaccgtacaa ctacgaaacc tactacgctg actctgttaa aggtcgtttc    720

 

accatctctc gtgacacctc taaaaacacc gtttacctgc agatgaactc tctgcgtgct    780

 

gaagacaccg ctgtttacta ctgcaccggt tcttactacg gtatggacta ctggggtcag    840

 

ggtaccctgg ttaccgtttc ttctcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac    900

 

aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg accggtctgc agactagaaa    960

 

taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa tacctgctgc cgaccgctgc   1020

 

tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggct atggactaca aagacatcca   1080

 

gatgacccag tctccgtctt ctctgtctgc ttctgttggt gaccgtgtta ccatcacctg   1140

 

ccgtgcttct cagtctctgg ttcactctca gggtaacacc tacctgcgtt ggtaccagca   1200

 

gaaaccgggt aaagctccga aagttctgat ctacaaagtt tctaaccgtt tctctggtgt   1260

 

tccgtctcgt ttctctggtt ctggttctca gaccgacttc accctgacca tctcttctct   1320

 

gcagccggaa gacttcgcta cctactactg ccagcagtct acccacgttc cgtggacctt   1380

 

cggtcagggt accaaagttg aactgaaacg tgctggaggt ggcggatccg acattcagat   1440

 

gacacagtct ccagcctccc tatctgtatc tgtgggagaa actgtcacca tcacatgtcg   1500

 

aacaagtgag aatatttaca gtaatttagc atggtatcag cagaaacagg gaaaatctcc   1560

 

tcagctcctg gtctatactg caacaaactt agcagatggt gtgccctcaa ggttcagtgg   1620

 

cagtggatca ggcacacagt attccctcaa gatcaacagc ctgcagtctg atgattctgg   1680

 

gacttattac tgtcaacatt tttggggtac tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct   1740

 

ggaaataaaa cggcaccacc accaccacca ctgactcgag cac                     1783

 

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gacattgtgc tcacccagwc tsmh                                            24

 

 

<210>  7

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ccgttagatc tcgarbttdg tscs                                            24

 

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

caggtsmarc tgcagsagtc wgg                                             23

 

 

<210>  9

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

tgaccacacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc                                   32

 

 

<210>  10

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ccggaattcg acattgtgct cacccagtct cca                                  33

 

 

<210>  11

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc ccgttttatt tccagcttgg tccc           54

 

 

<210>  12

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtccagc tgcagcagtc t              51

 

 

<210>  13

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

cccaagcttg tgaggagact gtgagagtgg tgcc                                 34

 

 

Claims (2)

1.一种用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体，其特征在于：

编码所述抗体的核酸序列为如SEQ ID No.5的全长核酸序列：

ccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggccgaggtgcagctgcagcagtcaggacccgacctggtgaagcctggggcctcaatgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtgaaggagagacatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaaaaatggcgttactatttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaagacactgcagtctattattgtgcaagaggggactmctatggtaactactttgactactggggccaaggcaccagtctcacagtctcctcagccaaaacgacmcccaagcttggaggtggcggatccgaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaccttctctgactactggatgaactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcagatccgtaacaaaccgtacaactacgaaacctactacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacacctctaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgcaccggttcttactacggtatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgaccggtctgcagactagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggctatggactacaaagacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcagtctctggttcactctcagggtaacacctacctgcgttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaagttctgatctacaaagtttctaaccgtttctctggtgttccgtctcgtttctctggttctggttctcagaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagtctacccacgttccgtggaccttcggtcagggtaccaaagttgaactgaaacgtgctggaggtggcggatccgacattcagatgacacagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgaacaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctatactgcaacaaacttagcagatggtgtgccctcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtctgatgattctgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggcaccaccaccaccaccactgactcgagcac；

上述核酸序列的长度为1783个核苷酸。

2.制备如权利要求1所述的用于前列腺癌早期诊断和治疗的抗PSMA/FITC双特异性抗体的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：抗PSMA/FITC双特异性抗体核酸序列的设计与合成：

根据VL_PSMA、VH_PSMA、VL_FITC、VH_FITC的核酸序列和VH_PSMA-L-VL_FITC； VH_FITC-L-VL_PSMA的连接形式设计相应的引物，如下表所示；

其中：

VL_PSMA为抗PSMA单链抗体轻链可变区，其核酸序列为SEQ ID No.2；

VH_PSMA为抗PSMA单链抗体重链可变区，其核酸序列为SEQ ID No.1；

VL_FITC为抗FITC单链抗体轻链可变区，其核酸序列为SEQ ID No.4；

VH_FITC为抗FITC单链抗体重链可变区，其核酸序列为SEQ ID No.3；

步骤二：抗PSMA/FITC双特异性抗体表达载体的构建：

采用Pfu Taq酶经过PCR扩增的VH_PSMA-L-VL_FITC、VH_FITC-L-VL_PSMA基因片段分别经双酶切后，通过T4连接酶将基因片段和表达载体pET26b在16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α后，提质粒后经XbaI和XhoI双酶切鉴定证实1600bp处可以观察到目的大小片段，将该片段命名为pET-PHscFv；

步骤三：抗PSMA/FITC双特异性抗体的表达和纯化：

将pET-PHscFv载体转化BL21感受态细胞后获得pET-PHscFv的大肠杆菌表达株，第二日，挑取单克隆细胞接种LB培养基中扩增培养，第三日经IPTG后16℃低温过夜诱导可以获得可溶形式表达的抗体片段；15%的SDS-PAGE凝胶电泳结果显示IPTG诱导后有一个明显的诱导条带，通过镍柱亲和纯化后可以获得纯化的抗PSMA/FITC双特异性抗体。