CN103060353B - 海藻酸裂解酶生物合成基因簇 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸裂解酶生物合成基因簇，所述基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为algV1、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇来源于解藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）ATCC17749。本发明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解海藻酸裂解酶的生物合成机制，为海藻酸裂解酶的大规模应用提供丰富的物质和遗传信息。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体地说，是关于海藻酸裂解酶的生物合成基因簇。
背景技术
海藻酸（Alginate），又称褐藻胶，是褐藻细胞壁的主要成分之一。某些细菌家族如固氮菌属（Azotobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）等也产海藻酸，作为细菌的荚膜多糖（Gregory L，Larry HK.Characterization of theexocellular polysaccharides from Azotobacter chroococcum[J].CarbohydrateResearch,1988,181(1):143-152；Alferd L,Russell SJ.A polysaccharide resemblingalginic acid from a Pseudomonas microorganism[J].Nature,1964,204(10):187-188）。海藻酸分子是由α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）两种残基以1,4-键连接而成，研究发现海藻酸分子由3种模块构成，即：均聚古洛糖醛酸片段（Poly-gulutonate，PG）、均聚甘露糖醛酸片段（Poly-mannuronate，PM）和甘露糖醛酸-古洛糖醛酸混合嵌合片段（MG-block）（Gacesa P.Alginates[J].Carbohydr Polymers,1988,8(3):161-182）。
海藻酸裂解酶，又名解藻酸裂解酶，存在于多种生物体中，如海藻、软体动物、真菌、细菌、噬菌体、病毒等。根据不同的底物特异性，海藻酸裂解酶可分为特异性降解古洛糖醛酸片段的聚古洛糖醛酸裂解酶poly（α-L-guluronate）lyase和特异性降解甘露糖醛酸偏酸的聚甘露糖醛酸裂解酶poly（β-D-mannuronate）lyase（Wong TY，Preston LA,Schiller NL.ALGINATELYASE:Review of Major Sources and Enzyme Characteristics,Structure-FunctionAnalysis,Biological Roles,and Applications[J].Annual Review of Microbiology，2000,54(1):289-340）。海藻酸裂解酶通过β-消除反应将海藻酸降解为一系列不饱和的海藻寡糖，分布于多糖裂解酶（polysaccharide lyase，PL）第5，6，7，14，15，17，18家族中（http://www.cazy.org/Polysaccharide-Lyases.html）。海藻酸裂解酶及其降解海藻酸所产生的海藻寡糖在医药、食品和生物研究领域都具有重要作用。
解藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）是一类革兰氏阴性的海洋细菌，按照伯杰氏细菌手册记载，是一类不产海藻酸裂解酶的细菌。但Kitamikado等人研究发现V.alginolyticus ATCC17749株可产胞外海藻酸裂解酶（Tseng C-H.,Yamaguchi K.,Nishimura M.,Kitamikado M.Alginate Lyase from Vibrioalginolyticus ATCC17749[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1992,58(11):2063-2067），并且分离纯化到一种分子量为47kDa的专一性降解聚甘露糖醛酸片段的海藻酸裂解酶，并且发现该菌株中存在不止一种海藻酸裂解酶（Kitamikado M,TsengCH,Yamaguchi K,Nakamura T.Two types of alginate lyases[J].Appl EnvironMicrobiol,1992,58(8):2474-2478），但此后关于V.alginolyticus ATCC17749海藻酸裂解酶的研究一直未有报道。
发明内容
本申请的发明人在对V.alginolyticus ATCC17749的研究过程中，从该菌株中克隆得到五个海藻酸裂解酶编码基因，生物信息学分析显示五个基因在染色体上成簇排列。
因此，本发明的目的在于提供海藻酸裂解酶生物合成基因簇。
本发明的海藻酸裂解酶生物合成基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为algV1、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇来源于Vibrio alginolyticusATCC17749。
根据本发明，所述algV1基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第11909-12952个碱基处，长度为1044个碱基对，编码347个氨基酸。
根据本发明，所述algV2基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第6948-8513个碱基处，长度为1566个碱基对，编码521个氨基酸。
根据本发明，所述algV3基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第4747-6498个碱基处，长度为1752个碱基对，编码583个氨基酸。
根据本发明，所述algV4基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第2259-4424个碱基处，长度为2166个碱基对，编码721个氨基酸。
根据本发明，所述algV5基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第1-2256个碱基处，长度为2256个碱基对，编码751个氨基酸。
根据本发明，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
本发明具有如下有益效果：
本发明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解海藻酸裂解酶的生物合成机制，为海藻酸裂解酶的大规模应用提供丰富的物质和遗传信息。
附图说明
图1为algV1-algV5基因的PCR扩增产物的电泳鉴定图。其中，M为DNAMarker；1为algV1；2为algV2；3为algV3；4为algV4；5为algV5。
图2为PCR所用引物在海藻酸裂解酶生物合成基因簇上的分布位置图。
图3为AlgV1-AlgV5重组蛋白的SDS-PAGE检测图。其中，M为ProteinMarker；C为阴性对照；1为AlgV1；2为AlgV2；3为AlgV3；4为AlgV4；5为AlgV5。
图4为AlgV1-AlgV5重组蛋白活性的定性测定结果图。其中，a为阴性对照；b为AlgV1；c为AlgV2；d为AlgV3；e为AlgV4；f为AlgV5。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明中的菌株和质粒信息如下：
Vibrio alginolyticus ATCC17749购自北京微生物菌株保藏中心，菌种保藏编号1.1833。pMD18-T载体购自Takara公司。
本发明中的培养基和培养条件信息如下：
V.alginolyticus ATCC17749的培养基配方如下：
液体培养基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠3%、海藻酸钠0.5%；
固体培养基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠3%、海藻酸钠0.5%、琼脂1.8%；
培养条件为37℃培养24~36h。
本发明中的主要试剂信息如下：
限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶和Protein Marker均购自TaKaRa公司。细菌基因组抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。氯化十六烷基吡啶（CPC）和海藻酸钠购自生工生物工程（上海）有限公司。DNA Marker的片段大小依次为0.5、1.1、1.6、2.6、3.1、4.1、5.4、7.1、9.3和17kb。
本发明中所涉及的一般操作方法，包括大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒DNA的抽提、聚丙烯酰胺凝胶电泳等相关的分子生物学操作参见文献（萨姆布鲁克J,弗里奇EF.分子克隆手册（第2版）[M].北京:科学出版社,1998.1595-1595）。
实施例1、海藻酸裂解酶基因簇的克隆
1.1海藻酸裂解酶基因的克隆
设计并合成一系列引物用于从V.alginolyticus ATCC17749的基因组上扩增海藻酸裂解酶基因algV1、algV2、algV3、algV4和algV5，引物序列及特征如表1所示。
表1、用于PCR扩增algV1-algV5基因的引物特征
注：ggatcc为BamHI酶切位点；catatg为NdeI酶切位点；ccatgg为NcoI酶切位点
然后，使用细菌基因组抽提试剂盒抽提V.alginolyticus ATCC17749的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。
PCR反应的总体积为50μL，反应组分为：10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μL，25mmol/L dNTP4μL，5pmol/μL正反向引物各10μL，DNA模板2.5μL，Taq DNA聚合酶1.0μL，用无菌重蒸水补齐剩余体积，各组分充分混合后进行反应。反应条件如下：97℃预变性5min；95℃30s，退火温度1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR扩增结果如图1所示，将algV1、algV2、algV3和algV5基因的PCR扩增产物采用NdeI/BamHI联合酶切后装载于NdeI/BamHI线性化的载体质粒pET-28a(+)上，构建得到相应的表达质粒pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV4和pET28a-algV5。将algV3基因的PCR扩增产物采用NcoI/BamHI联合酶切后装载于NcoI/BamHI线性化的载体质粒pET-28a(+)上，构建得到相应的表达质粒pET28a-algV3。所得克隆委托上海美吉生物医药科技有限公司测序，表明获得五个海藻酸裂解酶基因。
1.2海藻酸裂解酶基因簇间隔区的克隆
根据1.1中获得的海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列，设计并合成一系列引物用于从V.alginolyticus ATCC17749的基因组上扩增五个海藻酸裂解酶基因algV1、algV2、algV3、algV4和algV5的间隔区序列，引物序列及特征如表2所示。
表2、用于PCR扩增间隔区的引物特征
PCR反应体系和条件同1.1，将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体上，然后委托上海美吉生物医药科技有限公司测序，结果从V.alginolyticus ATCC17749的基因组上获得六个海藻酸裂解酶基因间隔区片段，分别为algV54、algV43、algV32、algV21-1、algV21-2和algV21-3，其中algV21-1、algV21-2和algV21-3相互重叠。
1.3、海藻酸裂解酶基因簇完整序列的拼接
将1.1中获得的algV1、algV2、algV3、algV4和algV5基因序列和1.2中获得的algV54、algV43、algV32、algV21-1、algV21-2和algV21-3基因间隔区片段序列拼接，获得海藻酸裂解酶基因簇的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO：23所示。基因和引物在染色体上的位置如图1所示，基因特征如表3所示。
表3、海藻酸裂解酶生物合成基因簇的基因特征
综上所述，通过PCR扩增从V.alginolyticus ATCC17749的基因组上获得五个海藻酸裂解酶编码基因algV1、algV2、algV3、algV4和algV5，上述基因在染色体上成簇排列。
实施例2、海藻酸裂解酶的活性鉴定
2.1海藻酸裂解酶在大肠杆菌中的表达
将实施例1.1中获得的pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV3、pET28a-algV4和pET28a-algV5表达质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用于基因表达。将包含表达质粒的重组大肠杆菌接种于含有卡那霉素（终浓度为50μg/mL）的LB液体培养基中培养12~16h，以1%接种量将上述一级培养物分别接种于30mL的含有卡那霉素（终浓度为50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃培养约2.5h至OD600=0.6~0.8时，添加IPTG（终浓度为1mmol/L）于16℃诱导表达8.5h。收集菌体，通过SDS-PAGE电泳检测各基因在大肠杆菌中的表达。
以诱导前的菌体作为阴性对照，SDS-PAGE的检测结果如图3所示，重组蛋白AlgV1、AlgV2、AlgV3、AlgV4和AlgV5的理论大小分别为41kDa、62kDa、68kDa、83kDa和87kDa，结果显示获得了与理论值相符的蛋白表达条带。
2.2海藻酸裂解酶活性测定
2.2.1定性测活
将包含pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV3、pET28a-algV4和pET28a-algV5表达质粒的重组大肠杆菌接种于添加了卡那霉素（终浓度为50μg/mL）和IPTG（终浓度为1mmol/L）的海藻酸钠固体培养基中，28℃培养48h后，在培养基表面覆盖一层10%CPC，观察透明圈的产生情况。
以包含空白pET-28a(+)质粒的重组大肠杆菌作为阴性对照，结果如图4所示，包含pET28a-algV1、pET28a-algV2和pET28a-algV3的重组大肠杆菌出现了透明圈，表明AlgV1、AlgV2、AlgV3在大肠杆菌中具有分泌的海藻酸裂解酶活性，而包含pET28a-algV4和pET28a-algV5的重组大肠杆菌未出现透明圈，表明AlgV4和AlgV5在大肠杆菌中为不可分泌表达的蛋白质或不具有海藻酸裂解酶活性。
2.2.2定量测活
将包含pET28a-algV1、pET28a-algV2、pET28a-algV3、pET28a-algV4和pET28a-algV5表达质粒的重组大肠杆菌于16℃诱导表达过夜，用分光光度计测定菌液的菌密度A600，取10OD即10/A600mL的菌体量离心。一方面，收集培养上清用于海藻酸裂解酶的活性测定；另一方面，在收集的菌体中加入1mLpH8.0，50mmol/L的磷酸钠缓冲液悬浮，超声破碎（功率400W，40次），于4℃，15000r/min离心，取上清，即粗酶液进行海藻酸裂解酶的活性测定。
活性测定方法如下：在0.3mL酶反应体系（pH8.0，50mmol/L磷酸钠缓冲液，0.2%（w/w）海藻酸钠，0.4mol/L氯化钠）中加入100μL适当稀释的粗酶液，37℃保温20min后，加入1.0mL10mmol/L HCl终止反应，在235nm下测定吸光值。
一个酶活单位的定义为：235nm下吸光值每分钟增加0.1所需的酶量为一个酶活单位。
结果如表3所示。
表3、重组大肠杆菌的海藻酸酶活性的定量测定
如表3所示，酶活测定结果显示AlgV1、AlgV2、AlgV3、AlgV4、AlgV5重组蛋白都具有海藻酸裂解酶活性，其中AlgV2总酶活最高，可达到4347U/L，并且，AlgV1、AlgV2和AlgV3的重组大肠杆菌的培养上清中都检测到海藻酸裂解酶活性，即为分泌型海藻酸裂解酶，而AlgV4和AlgV5为非分泌型海藻酸裂解酶，此结果与实施例2.2.1中的定性测活结果一致。
综上所述，本发明从V.alginolyticus ATCC17749的基因组上获得algV1、algV2、algV3、algV4和algV5五个海藻酸裂解酶编码基因，且上述五个基因在基因组上成簇排列。进一步的功能测定显示algV1、algV2、algV3、algV4和algV5基因的编码蛋白产物都具有海藻酸裂解酶活性，其中，algV1、algV2和algV3基因的编码产物在大肠杆菌中为可分泌表达，algV4和algV5基因的编码产物在大肠杆菌中为不可分泌表达。有机体内存在多个海藻酸裂解酶可能是为了有利于菌株更好地利用环境中的海藻酸，从而适应环境的变化。
Claims (5)
1.海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为algV1、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇来源于Vibrio alginolyticus ATCC17749，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNO：23所示，其中，所述algV1基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第11909-12952个碱基处，长度为1044个碱基对，编码347个氨基酸。
2.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV2基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第6948-8513个碱基处，长度为1566个碱基对，编码521个氨基酸。
3.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV3基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第4747-6498个碱基处，长度为1752个碱基对，编码583个氨基酸。
4.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV4基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第2259-4424个碱基处，长度为2166个碱基对，编码721个氨基酸。
5.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV5基因位于SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的第1-2256个碱基处，长度为2256个碱基对，编码751个氨基酸。
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