CN103044534B

CN103044534B - 紫花苜蓿抗旱相关基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN103044534B
Application number: CN201110310769.XA
Authority: CN
Inventors: 王涌鑫; 郑彦; 刘涛; 张路培; 苗丽宏; 李聪
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN103044534A

Abstract

本发明公开了一种由紫花苜蓿抗旱相关基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白的编码基因，以及含有该基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育抗旱紫花苜蓿的方法和它们的应用。本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表达可以显著增强紫花苜蓿的抗旱性能。该基因的发现为主要农作物的抗旱研究提供了基因资源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中将发挥重要作用。

Description

紫花苜蓿抗旱相关基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种紫花苜蓿抗旱相关基因，还涉及由该基因编码的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿抗旱相关基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育抗旱紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿抗旱相关基因及其编码的蛋白和含有该基因的表达载体及细胞在培育抗旱能力提高的植物中的应用。

背景技术

紫花苜蓿是我国乃至世界上最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿在中国西北地区种植较多，而西北地区干旱、少雨的气候特点，对作物的正常生长发育非常不利，严重制约了农牧业的发展。

因此，深入研究紫花苜蓿的抗旱性，对于克服该地区干旱、风蚀等自然条件对苜蓿栽培的制约，扩大其种植范围，提高生产力，具有举足轻重的意义。

在过去的几十年里对紫花苜蓿的抗旱性研究逐步从抗旱性的鉴定方面的研究转移到提高紫花苜蓿自身抗旱性的研究上来，尤其在近几年或是近十几年中的研究，紫花苜蓿的抗旱性育种以及品种改良方面的研究工作尤为突出。

目前最为有效的和常用的方法还是传统的轮回选择法，即通过在原始群体中选株产生后代，对后代进行鉴定，再用优良的后代重组形成新的群体以提高群体的平均表现。然后可以利用系谱法对新的群体选择自交系。

随着分子生物学的发展，生物技术在育种中得到了广泛地应用。但与其他作物(如玉米、高粱等)中的研究相比，在紫花苜蓿抗旱育种中的研究还相对较少。因此，紫花苜蓿抗旱相关的分子生物学机制还有待于进一步的研究。

发明内容

本发明基于对紫花苜蓿抗旱相关的分子生物学机制的研究，一方面提供了紫花苜蓿抗旱相关基因及该基因编码的蛋白，另一方面还提供了含有所述紫花苜蓿抗旱相关基因的表达载体和细胞，以及培育抗旱紫花苜蓿的方法，还提供了它们的应用。

本发明提供了一种紫花苜蓿抗旱相关基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。

本发明还提供了一种紫花苜蓿抗旱相关基因，其中，该基因具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因。

本发明还提供了一种培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育抗旱能力提高的植物中的应用。

本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)在紫花苜蓿中被干旱逆境诱导表达，进而本发明的发明人通过转基因技术将紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)导入到紫花苜蓿中，结果表明紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表达可以显著增强紫花苜蓿的抗旱性能。本发明从紫花苜蓿中克隆的抗旱基因为主要农作物(特别是紫花苜蓿)的抗旱研究提供了基因资源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1显示了bZIP基因(SEQ ID NO：1)的实时定量PCR的分析结果，结果显示bZIP基因的表达水平能够被干旱胁迫所诱导提高。

图2显示了实施例2中进行细胞定位所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体的结构。

图3为将不含有目的bZIP基因的空表达载体转入到洋葱表皮细胞中，观察到的亚细胞定位图。

图4为将含有ZIP基因(SEQ ID NO：1)的表达载体转入到洋葱表皮细胞中，观察到的亚细胞定位图。

图5显示了实施例3中对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的bZIP基因转化所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体的结构。

具体实施方式

本发明提供了一种由紫花苜蓿抗旱相关基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。优选情况下，该蛋白具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

相应地，本发明还提供了一种紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)，其中，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。优选地，该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)是发明人通过构建紫花苜蓿干旱胁迫下特异表达的cDNA文库，并从该cDNA文库中筛选得到的。

所述cDNA文库的构建方法包括：利用30％(w/v)PEG8000对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.保定苜蓿，北京中畜东方草业科技有限责任公司)进行模拟干旱处理12个小时，收获植株，放于-80℃作为实验组。没有经过干旱处理的植株为对照组。利用PCR-Selected cDNA Subtraction Kit(Clontech，Mountain View，CA，USA)构建了紫花苜蓿干旱胁迫下特异表达的cDNA文库。

在文库的构建过程中，获得了525个单菌落并全部进行测序。经过去除载体序列和冗余序列，最终获得了130条EST序列。这些序列的大小从250bp到1000bp。其中，长度为567bp的EST序列引起了实验者的关注，并对利用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分别对该EST序列进行了5’RACE和3’RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQ IDNO：2)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下：

A.准备基本液体：2.0μl 5×第一链缓冲液，1.0μl DTT(20mM)，1.0μldNTP Mix(10mM)；

B.制备用于5’RACE的cDNA：2.75μl RNA，1.0μl 5’-CDS引物A(ACGCGACGGTTTCAACATCCCTCTC)；

制备用于3’RACE的cDNA：3.75μl RNA，1.0μl 3’-CDS引物A(GAGCTGATGCTGTGGCTGCTGGTTG)；

C.将准备好的液体放于72℃3分钟，再放于42℃冷却2分钟。

D.向B中5’RACE的cDNA中加入1μl的SMARTer IIA oligo。

E.制备5’RACE和3’RACE的cDNA反应液：4.0μl的步骤A得到的缓冲液，0.25μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1.0μl SMARTScribe逆转录酶(100U)。

F.将步骤E中的液体加入到步骤C中，完成3’RACE的cDNA合成反应液的制备；将步骤E中的液体加入到步骤D中，完成5’RACE的cDNA合成反应液的制备。

G.将制备好的反应液放于42℃中90分钟，最后70℃中10分钟，完成cDNA的合成。

其中，3’RACE反应体系为：94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟，共30个循环。5’RACE反应体系为：94℃30秒，65℃30秒，72℃3分钟，共40个循环。

取PCR产物于1.0(W/V)％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，连接回收产物与pEGM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并测序，测序结果显示该基因具有SEQ ID：No：1所示的核苷酸序列(1781bp)。

本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有具有以下核苷酸序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明提供的基因可以通过现有的方法构建到表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物选择性标记(如BAR基因、GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(如潮霉素、卡那霉素等)。

本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有具有以下核苷酸序列的基因：SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述细胞可以为单子叶植物的细胞，也可以为双子叶植物的细胞，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄或苜蓿等的细胞。优选为苜蓿细胞，更优选为紫花苜蓿细胞。

本发明还提供了一种培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将具有SEQ ID No：1所示的核苷酸的基导入到紫花苜蓿细胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

根据本发明所述将有本发明提供的基因导入到紫花苜蓿细胞中的方法为基因工程领域常规的方法，例如可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，之后将转化的植物细胞培育成植株。

本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育抗旱能力提高的植物中的应用。优选地，所述植物为紫花苜蓿。

实施例1

bZIP基因的实时定量PCR分析

为了进一步研究从抑制差减杂交文库中获得的bZIP基因(SEQ ID NO：1所示的基因)的表达情况，利用实时定量PCR的方法进行了分析，具体步骤如下：

以50天大小的紫花苜蓿植株(Medicago sativa L.cv.保定苜蓿，北京中畜东方草业科技有限责任公司)为实验材料，分别用30％(w/v)PEG 8000处理0、15、30分钟和1、6、12、24小时，提取总RNA。5μg的总RNA被用于第一链cDNA的制备，具体步骤如下：首先加入0.5μl 50μM oligo(dT)(Invitrogen)、1μl 10mM dNTP Mix和5μl DEPC-treated water，65℃热激5分钟，放于冰上冷却1分钟；其次，加入4μl 5×First Strand Buffer、2μl 0.1M dithiothreitol(DTT)、1μl 40U/μl RNaseOUT(Invitrogen)和200USuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)，放于25℃5分钟、50℃60分钟和70℃15分钟。合成的cDNA放于-20℃保存。

用于实时定量PCR的引物为：

引物1：5’-3’：ACCAAGACTGAAAAGCCTTC

引物2：5’-3’：TTCTCCATCAGTGGTCGGTG。

A SYBR green reporter assay kit被用于实时定量PCR反应。Medicagotruncatula的18S rRNA被用于内标。对于每个基因做3次重复实验。反应体系如下：2μl 10×PCR buffer，2μl 25mM Mg²⁺，0.5μl 25mM dNTP，0.5μl 10μM forward primer，0.5μl 10μM reverse primer，1μl 20×SYBR Green MasterMix(Invitrogen)，0.2μl 5U/μl Taq(Invitrogen，11304-029)，1μl cDNA，最后用超纯水将总体积补到20μl。反应条件如下：95℃溶解DNA 2分钟，然后进行40个循环的扩增反应，95℃10秒钟，60℃30秒钟，70℃45秒钟。最后用2^-ΔΔCt统计方法对PCR结果进行分析。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，bZIP基因(SEQ ID NO：1)的表达水平能够被干旱胁迫所诱导提高。

实施例2

bZIP基因的亚细胞定位

植物表达载体的构建：1)RNA提取(Trizol法提取)，2)反转录(M-MLV，promega公司)，3)PCR扩增：以反转录的cDNA为模板，利用Taq酶做PCR，将设计好的酶切位点(NcoI和SpeI)连入PCR产物，4)PCR产物和载体进行酶切处理，5)酶切产物连接，载体结构如图2所示。

转化大肠杆菌进行检测，利用基因枪，将不含有目的bZIP基因的空表达载体转入到洋葱表皮细胞，观察其亚细胞定位(如图3所示)；利用基因枪，将含有目的基因的载体导入到洋葱表皮细胞中，观察其亚细胞定位(如图4所示)。

图3中，通过A和B的比较可以看出，不含有目的bZIP基因的空表达载体在细胞的各部分均有表达；而通过图4中A和B的比较可以看出，含有ZIP基因(SEQ ID NO：1)的表达载体仅在细胞核中表达。

实施例3

农杆菌介导的bZIP基因转化紫花苜蓿植株

一、材料与试剂

1、植物材料

供试苜蓿品种为紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.保定苜蓿，北京中畜东方草业科技有限责任公司)。

发芽7天的无菌苗子叶为遗传转化的受体材料。

2、农杆菌菌株和质粒载体

所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：GV3103(北京天恩泽基因科技有限公司)，农杆菌培养基：

质粒载体：pCAMBIA1302(购自上海希匹吉生物技术有限公司)。将bZIP基因插入到pCAMBIA1302中，具体步骤如下：

1)RNA提取(Trizol法提取)，2)反转录(M-MLV，promega公司)，3)PCR扩增：以反转录的cDNA为模板，扩增得到bZIP基因序列(引物为：5’-3’：GGGGCTCCCATGGATGGGAAATAGTGACGAAGAGAAATC Nco I和5’-3’：CGCGGCTCTGATCAACCAGCAGCCACAGCATCAGCTCTAGSpe I)，3)PCR扩增产物在浓度为1％(W/V)琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并回收目标大小的PCR扩增产物，并用Nco I和Spe I对pCAMBIA1302载体和PCR产物进行双酶切处理，4)酶切反应结束后，用1.0％(W/V)琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收含有目的条带的片段，通过T4 DNA连接酶，将其连接起来，5)将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α内，得到插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体，其含有CaMV35s启动子、bZIP基因(SEQ ID NO：1)以及一个抗潮霉素筛选基因，进行遗传转化的时候可通过潮霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质粒载体的结构图3所示。

将插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体导入到根癌农杆菌：GV3103中，具体步骤如下：

1)取-70℃保存的根癌农杆菌：GV3103于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

2)挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。

3)取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600＝0.5。

4)转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。

5)加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。

6)加入4ml预冷的含15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

7)农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

8)取1μg左右的质粒DNA加入到200ml GV3103感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。

9)再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。

提取导入有bZIP基因的农杆菌的质粒并测序，结果显示导入基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1一致，表明含有目的基因bZIP的表达载体没有发生丢失现象。

二、实验方法

1、农杆菌的培养

将导入有bZIP基因的农杆菌于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YMB固体培养基上划平板，放于培养箱内，28℃培养。两天后，从平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的20ml YMB液体培养基中，180rpm，28℃培养。用摇好的菌液划平板，28℃培养，待长出单菌落后，将平板放于4℃保存。

2、bZIP基因的转化

在平板上挑取单菌落，接种于20ml含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YMB液体培养基内，在恒温摇床上于28℃，180rpm培养。两天以后回收菌株，将菌液倒于10ml离心管中，4000rpm，离心10min。倒掉上清，用灭好菌的不含抗生素的改良的SH液体培养基重悬菌体，使菌液的OD₆₀₀值为0.6-0.8，待用。4外植体的准备：将4-5天大小的紫花苜蓿子叶用小刀从无菌苗上切下，切成3-4mm长的小块，切下来的外植体放于改良的SH液体培养基内，防止干枯，待用。外植体准备完成后，将浸泡于改良的SH液体培养基内的外植体，倒于事先灭好菌的滤头里，回收外植体。将回收的外植体放于准备好的菌液中，进行农杆菌浸染。每隔一会，摇动几下，有助于农杆菌吸附到外植体上。浸染15分钟后，倒于无菌的滤头上，回收外植体。将外植体放于无菌的滤纸上，吸干外植体外面的菌液。将外植体摆放于不含头孢霉素的共培养培养基内的滤纸上，用Parafilm将培养皿封好，放于黑暗处，28℃培养4天。

经根癌农杆菌侵染后的外植体，放在共培养培养基上暗培养4天后，转移到含有2mg/L 2，4-D、0.2mg/L KT、30mg/L潮霉素和300mg/L Cef的改良的SH固体培养基上，诱导产生愈伤组织；待培养20天后，将诱导产生的愈伤组织转移到含有0.2mg/L KT、30mg/L潮霉素和250mg/L Cef的UM培养基上，诱导产生胚状体；当胚状体成熟以后(大约培养30天)，将胚状体移植到1/2MS培养基上，诱导生根，从而完成植株的再生。

再生过程中各步培养基的组成如下：

共培养培养基：改良的SH培养基+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L KT；

诱导愈伤培养基：改良的SH培养基+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L KT+300mg/LCef+30mg/L Hyg；

胚状体诱导培养基：UM培养基+0.6mg/L KT+250mg/L Cef+30mg/LHyg；

生根培养基：1/2MS培养基+250mg/L Cef+30mg/L Hyg。

对比例1

转空载体对照植物的获得

用质粒pCAMBIA1302转化农杆菌，获得重组农杆菌，用重组农杆菌转化紫花苜蓿，得到转空载体的对照植株，方法如实施例2。

实施例4

将30株的对比例1中得到的转空载体的紫花苜蓿和30株的实施例3中得到的转插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体的紫花苜蓿进行抗旱实验，具体方法如下：1)将植株从土壤中取出，用水清洗掉根上的土；2)将清洗好的植株放入含有30％(w/v)PEG8000的Hoagland Complete植物液体生长液中进行模拟干旱处理2天。

结果显示，转pCAMBIA1302空载体的紫花苜蓿全部枯死，而转插入有bZIP基因的pCAMBIA1302载体的紫花苜蓿有28株存活，且大部分叶片保持绿色，植株生长良好。

由此可以看出，本发明提供的紫花苜蓿抗旱相关基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表达可以显著增强紫花苜蓿的抗旱性能。该基因的发现为主要农作物(特别是紫花苜蓿)的抗旱研究提供了基因资源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中将发挥重要作用。

Claims

1.一种由紫花苜蓿抗旱相关基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.一种紫花苜蓿抗旱相关基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求2所述的基因。

5.一种培育抗旱紫花苜蓿的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求2所述的基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。

6.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求4所述的表达载体在培育抗旱能力提高的植物中的应用，所述植物为紫花苜蓿。