CN103039362A - 油茶组培苗繁殖用继代培养基及其繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油茶组培苗繁殖用继代培养基，包括MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。通过上述方案中对MS基本培养基中添加特定浓度的6-苄氨基嘌呤和吲哚乙酸构成的继代培养基对油茶无菌苗进行继代培养，40天后油茶无菌苗的增殖倍数可达3.88～5.57，同时实现油茶苗的壮苗处理，不需后续再设置壮苗培养对油茶无菌苗进行培养，减短组培苗的繁殖周期、简化工艺和节省配置壮苗培养基的原料。

Description

油茶组培苗繁殖用继代培养基及其繁殖方法

技术领域

本发明涉及无性繁殖领域，具体涉及一种油茶组培苗繁殖用继代培养基及其繁殖方法。

背景技术

油茶是我国特有的优质木本油料树种，在我国油茶已有2300多年的栽培历史。其榨取的茶油色清味香，营养丰富，对高血压、高血脂、心脏病等心脑血管疾病具有良好的医疗保健作用，已被联合国列为重点推广的健康型高级食用植物油。同时，茶油的副产品茶枯和茶壳可通过综合利用提取茶皂素、磨制抛光粉和发酵高蛋白饲料等，油茶果壳可生产活性碳和提取鞣料等，因此油茶的附加值高。另外，油茶适应性广、耐瘠薄，是南方低山、丘陵和岗地很好的经济林树种之一，且不与粮棉争地，具有一年种植，多年收益的特点，被林农称为“铁杆庄稼”、“绿色油库”。因此，发展油茶产业不仅有利于缓解我国食用油长期依赖进口、供需紧张的局面，同时油茶的经济效益高，可增加农民的收益、推动农村经济的发展和提高国民的健康水平。

油茶种苗的繁育主要采用扦插育苗、芽苗砧嫁接和低产林高头换接等无性繁殖技术措施。然而，由于受到油茶优良品种无性系繁殖材料资源有限的限制，加上苗木培育时间长、苗木繁殖系数低等因素影响，难以在短时间内快速培育出大量优良无性系苗木，以满足油茶产业发展的需求，因此，迫切需求提供一种繁殖系数高、移栽成活率高的油茶组培苗的繁殖方法。

目前，关于油茶组培苗的繁殖研究较为前沿的报道有名称为“油茶离体培养诱导再生植株的研究”（毕方铖等，经济林研究，第22卷第2期，第5～9页，2004年）的科技文献，其公开了以油茶优良无性系湘林4号的茎段、幼胚、子叶在离体条件下进行诱导繁殖，茎段培养以MS为基本培养基，附加6-BA3.0mg/L+NAA1.0mg/L对芽进行诱导，诱导率达到83.33%；继续原培养基上进行继代培养得到丛生芽，对于幼胚和子叶，附加激素2，4～D2.0mg/L+KT1.0mg/L诱导，将诱导产生的愈伤组织转到附加6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L和6-BA2.5mg/L+IAA1.5mg/L的培养基上诱导出不定芽，诱导率达到90%以上，且进一步公开了将无菌苗在MS+NAA7.0mg/L培养基上诱导生根最适，但采用其公开的培养基进行诱导生根获得的再生苗大多只有一条主根、须根很少，组培苗移栽后生根困难，难以成活，因此，其实质上并未能获得能够移栽成活的组培苗。同时，其所配置的诱导培养基中的6-BA、IAA的浓度较高，在实际操作过程中诱导生芽的效果并不好。

另外，名称为“一种油茶无性系组培苗高效生根方法”（CN102007867A）的中国专利文献中公开了如下技术方案：油茶无性系组培苗高效生根方法，包括初代培养、继代培养、壮苗培养和生根培养过程，其中壮苗培养后，需在植物激素IBA1000～4000ppm的溶液中浸泡预处理5～10s，然后接种在生根培养基上培养获得有根系的油茶组培苗。采用该方案虽然能够获得油茶组培苗，但是试验研究表明，每次无菌苗进行生根接种前都必须更换新的IBA溶液对其进行浸泡，用于浸泡无菌苗的溶液不能重复使用，否则无菌苗极容易发生大面积的感染，造成无菌苗死亡和原料的浪费。同时，其提供的用于继代培养的培养基只能促进无菌苗进行增殖，而无法促进无菌苗生长（壮苗），因此在其后续阶段还需要进行壮苗培养，使得整个组培苗繁殖的工时长。另外，其初代培养中的芽诱导率和生根培养过程中的生根率还是比较低。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种油茶组培苗繁殖用继代培养基，在继代培养时可同时实现油茶无菌苗的增殖和壮苗，减少油茶组培苗的繁殖周期。

其采取的方案为：一种油茶组培苗繁殖用继代培养基，其特征在于：包括MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。

通过上述方案中对MS基本培养基中添加特定浓度的6-苄氨基嘌呤（6-BA）和吲哚乙酸（IAA）构成的继代培养基对油茶无菌苗进行继代培养，40天后油茶无菌苗的增殖倍数可达3.88～5.57，同时实现油茶苗的壮苗处理，不需后续再设置壮苗培养对油茶无菌苗进行培养，减短组培苗的繁殖周期、简化工艺和节省配置壮苗培养基的原料。

本发明的另一目的是提供一种油茶组培苗的繁殖方法，一种油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：包括对油茶植株上截取消毒得到的茎段进行初代培养、继代培养和将继代培养后的无菌苗进行生根培养，所述继代培养所用的继代培养基为MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。

通过上述组培方案和继代培养基的相配合作用，可在较短的时间内获得大量的油茶组培苗。

本申请中进一步的技术方案为，所述生根培养所用的生根培养基为1/2～1/8MS+IBA2.4～4.8mg/L+NAA2.2～4.6mg/L。所述初代培养所用的初代培养基为MS+6-BA0.6～1.0mg/L+IAA0.07～1.3mg/L。采用上述生根培养基进行培养可使得油茶无菌苗的生根率达60～91.4%，平均每株无菌苗可生1.5～3.18根根系，根系长度可达2.8cm左右，获得的组培苗的根系质量好，从而提高油茶组培苗的移栽成活率。同时，为实现组培苗的大量繁殖，可进行一次继代培养，然后再将一次培养的丛生芽分别截取成含有一个嫩芽的无菌苗进行二次继代培养，以提高继代培养的增殖系数。

其中，MS是指按照相关标准或手册或教科书配置的常用于植物组培苗繁殖的基本培养基，1/2～1/8MS是指大量元素为按手册或标准或教科书中配置的标准MS培养基中大量元素浓度的1/2～1/8倍、微量元素与按手册或标准或教科书中配置的标准MS培养基中微量元素相同的培养基。IBA2.4～4.8mg/L是指配置好后的培养基中的IBA的浓度为2.4～4.8mg/L，本申请中其他处所采用的上述表述方式均应如此理解。当然，对于本领域技术人员采用常用的无机盐、有机物对手册或标准或教科书中配置MS基本培养基所列举的原料无机盐、有机物进行等同替换或小范围改动某种无机盐的浓度且对MS基本培养基培养性能不发生大的改变的方案也应属于本申请中MS基本培养基所指的范围内。本申请中，优选采用硝酸钾(KNO₃)、硝酸铵(NH₄NO₃)、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、氯化钙（GaCl₂）、硫酸锌（ZnSO₄﹒7H₂O）、硼酸（H₃BO₃）、钼酸钠（NaMo0₄﹒5H₂O）、硫酸铜（CuSO₄﹒5H₂O）、氯化钴（CoCl₂﹒6H₂0）、碘化钾（KI）等无机盐和蔗糖、维生素、氨基酸等有机化合物配置MS基本培养基。

该繁殖方法还包括将生根培养后得到的组培苗移栽至炼苗基质上进行炼苗处理，炼苗基质由28～32重量份锯屑/稻壳、23～27重量份黄心土、4～6重量份草木灰、28～32重量份东北泥炭、4～6重量份珍珠岩和4～6重量份蛭石混合构成。由于后续的移栽所选用的基质对组培苗移栽的成活率影响巨大，申请人通过长期试验发现，通过将组培苗移栽至上述炼苗基质中进行炼苗，油茶组培苗能够健壮生长，成活率高，提高后续油茶苗上山移栽的成活率。

具体的截取接种茎段和初代培养、继代培养、生根培养操作分别为：

所述的接种茎段是从油茶树上截取的生长健壮的接种枝，将接种枝上的每片叶片截去3/4～5/6进行清洗消毒后再截去剩余的叶片和接种枝基部，然后按一腋芽一茎段进行截取得到。

初代培养：将消毒后的接种茎段接种至设有初代培养基的接种瓶内，并将接种瓶用封口膜封口扎紧，再将接种瓶避光处理4～6天，然后进行光照培养30～40天，初代培养基为MS+6-BA0.6～1.0mg/L+IAA0.07～1.3mg/L；

继代培养：将初代培养得到的无菌苗转移至设有继代培养基的接种瓶内同时进行壮苗和增殖培养，培养35～45天，继代培养基为MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L；

生根培养：将继代培养得到的丛生芽切成1.2～2.0cm分别含有嫩芽的无菌苗并接种至设有生根培养基的接种瓶内进行培养生根，培养25～35天，生根培养基为1/2～1/8MS+IBA2.4～4.8mg/L+NAA2.2～4.6mg/L。

按上述组合的参数实施本发明的技术方案，初代培养的芽诱导率可达93.3%，继代培养中无菌苗的增殖系数可达5.0以上，生根培养的生根率可达91.4%，每株组培苗平均具有3.18根根系，相对于实现本发明目的的其他技术参数方案在繁殖系数和获取的组培苗质量上有显著的提高。

附图说明

图1a、1b为初代培养；

图2a、2b为继代培养；

图3a、3b为生根培养；

图4a、4b、4c为炼苗处理。

具体实施方式

以通过具体实施方式，来对本发明作进一步的说明。其中操作1是配置各种培养基和获取繁殖用接种茎段，操作2是在不同初代培养基中对接种茎段进行初代培养，操作3是在不同继代培养基中对初代培养后获得无菌苗进行继代培养，操作4是在不同生根培养基中对继代培养后获得无菌苗进行生根培养，操作5是在不同炼苗基质中对生根培养获得组培苗进行炼苗处理。

操作1：配置培养基和获取繁殖用茎段

（a）配置培养基

分别称取以下无机盐、有机物、植物激素以及有机附加物待用；

无机盐：大量元素包括硝酸钾(KNO₃)、硝酸铵(NH₄NO₃)、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、氯化钙（GaCl₂）等；微量元素包括硫酸锌（ZnSO₄﹒7H₂O）、硼酸（H₃BO₃）、钼酸钠（NaMo0₄﹒5H₂O）、硫酸铜（CuSO₄﹒5H₂O）、氯化钴（CoCl₂﹒6H₂0）、碘化钾（KI）等；

有机物：包括蔗糖、维生素类和氨基酸等；

植物激素：有生长素吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），细胞分裂素6-苄氨基嘌呤（6-BA）和赤霉素。

有机附加物：有机附加物包括人工合成或天然的有机物，如果汁、卡拉胶。

按相关标准或操作手册或教科书中记载的方案配置MS基本培养基，然后分别取不同浓度和种类的植物激素与MS基本培养基配置成各种型号的初代培养基、继代培养基和生根培养基，并杀菌处理后待用。

（b）获取繁殖用接种茎段

接种材料采集：供试材料取自于安徽黄山市林科所油茶良种基地，品种有黄山1号、2号、4号和长林4号、27号、56号等六个品种。采集时间在4月～8月，选在晴天无露水时间段，以树体中上部当年生无感染、无病虫害、生长健壮的嫩梢，作为油茶外植体初代培养材料。将采回的油茶外植体分成四份，三份用塑料保鲜袋装好封口，贮藏在3～5℃的冰箱里，备不同日期接种成活率对比试验。

接种枝的处理：将接种枝（外植体）上的每片叶片剪去3/4～5/6，放入烧杯中用洗衣液泡洗二次，然后再用清水洗去洗衣液，洗净后用自来水再缓冲1h。将缓冲1h的油茶接种枝沥净水放到生物净化工作台上，用75%的酒精浸泡30s后倒去酒精，又快速倒入配比1‰的升汞溶液浸泡灭菌10～20min，根据油茶接种枝嫩度来确定灭菌时间。灭菌时将容器轻轻摇晃，使接种枝各个部位都接触到升汞溶液，灭菌后即去净升汞溶液，再用无菌水连续冲洗8遍以上，每遍晃动冲洗30s左右，然后用无菌吸水纸吸干并剪去剩余的叶片和截去接种枝的基部，然后由接种枝底部至稍部，以一个腋芽为一茎段截取，作为一个接种茎段待用。

操作2：初代培养

接种室及设备消毒灭菌：先将接种室的紫外灯打开消毒灭菌30min，之后接通净化工作台电源，启动鼓风机、照明开关、红外接种环灭菌器，用75%的酒精喷雾净化工作台内壁；75%的酒精擦洗剪刀、镊子，并放入50℃～825℃红外接种环灭菌器高温灭菌，达到灭菌效果后取出冷却；将消毒好的无菌水、无菌纸、无菌吸水纸摆放在净化工作台上备用。

接种：将截取的接种茎段接种到含有如表1所示的各种型号的初代培养基的接种瓶内，并编号初1组～初6组，每组10瓶，每瓶接种3支接种茎段，封口膜扎紧瓶口，置于培养室培养。初代接种培养需在温室暗处理5天后启动光照，培养室温度25～28℃、湿度60%，每天光照时间10h，光照强度1000～1500LX。

观察各接种瓶内接种茎段的初代培养状况，培养结果具体如表1所示。

表1不同型号的初代培养基对接种茎段初代培养的培养结果

表1中初代培养的试验结果表明，以初6组中初代培养基培养的效果最好，不仅芽诱导成活率高达93.3%，而且腋芽长势较好，如图1a、1b所示；其次为初5组培养基芽诱导成活率也达76.7%，腋芽长势较好；初4组培养基芽诱导成活率虽然也达73.3%，但腋芽长势一般。初1组、初2组培养基虽然芽诱导成活率较高，但腋芽长势不好，初3组培养基接种失败。

操作3继代培养

以初代培养获得的5叶1顶芽、长度在1.2cm左右的无菌新芽为材料，分别接种至如表2中所示的设有不同型号的继代培养基的接种瓶内，标号继1～继11组，每组10瓶，每瓶接3枝。

观察各接种瓶内的培养状况，结果具体如表2所示。

表2不同型号的继代培养基进行继代培养的培养结果

由表2中记载的结果可知，在11个继代培养组中，以继6组、继7组、继8组、继9组的继代培养基对无菌苗的壮苗、增殖培养为最好，如图2a、2b所示；当6-BA2.0～3.0mg/L+IAA0.07～0.1mg/L时，增殖系数均在5.0以上，丛生芽生长健壮。而6-BA0.6～1.5mg/L+IAA0.06～1.0mg/L的五个处理方法和6-BA2.0～3.0mg/L+IAA1.5mg/L的两个处理方法，其增殖系数均低于5.0。

操作4生根培养

将继代增殖培养获得的丛生芽切成1.5cm左右的茎段，接种到含有如表3中所示的不同型号的生根培养基的接种瓶内进行生根培养，编号生1～生3组，观察各接种瓶内的培养状况，培养结果具体如表3所示。

由表3可知，经过10天生根培养，组培苗开始有根原基出现，30天后，生1组培养基243株接种无菌苗中有222株生根，生根率达91.4%，总根系707条，平均每株3.18条根系，最长根系达2.8cm，如图3a、3b所示。生2组培养基50株接种无菌苗中有40株生根，生根率为80%。生3组培养基60株接种无菌苗中有36株生根，生根率为60%。因此，可以看出生1组所用的培养基培养效果最佳。

表3不同生根培养基进行生根培养的结果

操作5炼苗处理

将生根培养后具有完整根系的油茶组培苗从接种瓶中取出，用自来水把根部培养基冲洗干净，分别移栽到装有黄心土加泥炭、轻介质营养土和多种类营养土的3种不同基质的塑料盆中培养，基质用高猛酸钾1∶2500溶液消毒。观察移栽后组培苗生长状况。

黄心土加泥炭基质配制：48～52%黄心土+48～52%东北泥炭，pH3.6。用于移栽炼苗的小塑料盆的底层放1/4清水沙透气，上层将配制的营养土装至盆的3/4，炼苗30株，栽后浇透定根水（配制的消毒液），套上薄膜保湿（湿度76%左右），置于25～28℃温室中培养，光照时间10h，光照强度1000～1500LX。

轻介质营养土基质配制：48～52%黄心土+28～32%东北泥炭+9～11%珍珠岩+9～11%蛭石，缓施肥3kg/m³，pH4.7。用于移栽炼苗的小塑料盆的底层放1/4清水沙透气，上层将配制的营养土装至盆的3/4，炼苗30株，栽后浇透定根水（配制的消毒液），套上薄膜保湿（湿度76%左右），置于25～28℃温室中培养，光照时间10h，光照强度1000～1500LX。

多种类营养土基质配制：28～32%锯屑（或稻壳）、23～27%黄心土、4～6%草木灰、28～32%东北泥炭、4～6%珍珠岩、4～6%蛭石，缓施肥3kg/m³，pH4.86。用于移栽炼苗的小塑料盆的底层放1/4清水沙透气，上层将配制的网袋营养土装至盆的3/4，炼苗240株，栽后浇透定根水（配制的消毒液），套上薄膜保湿（湿度76%左右），置于25～28℃温室中培养，光照时间10h，光照强度1000～1500LX。

结果：

（a）移栽后第三天，以黄心土加泥炭为基质移栽的组培苗基本都掉叶，只剩下顶叶，3～5天组培苗全部死亡，而以轻介质营养土和多种类营养土为基质移栽的组培苗长势较好。

（b）移栽后半个月，以轻介质营养土为基质移栽的组培苗长势一般，由于该营养土水份易蒸发，因此一周左右浇水一次，保持营养土水分。以多种类营养土为基质移栽的组培苗长势良好，营养土保水保湿性能好。

（c）移栽后一个月，以轻介质营养土移栽的部分组培苗开始发新叶，长势较慢，保存率85%以上；以多种类营养土移栽的组培苗基本都长出1～3片新叶，生长健壮，再经过一个月的培育，保存率高达96.9%，如图4a、4b、4c所示。此后可再转移至大田炼苗，需要保湿保温遮荫处理。

Claims (7)

1.一种油茶组培苗繁殖用继代培养基，其特征在于：包括MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。 

2.一种油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：包括对油茶植株上截取消毒得到的接种茎段进行初代培养、继代培养和将继代培养后的无菌苗进行生根培养，所述继代培养所用的继代培养基为MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。 

3.如权利要求1所述的油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：所述生根培养所用的生根培养基为1/2～1/8MS+IBA2.4～4.8mg/L+NAA2.2～4.6mg/L。 

4.如权利要求2所述的油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：所述初代培养所用的初代培养基为MS+6-BA0.6～1.0mg/L+IAA0.07～1.3mg/L。 

5.如权利要求2所述的油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：该繁殖方法还包括将生根培养后得到的组培苗移栽至炼苗基质上进行炼苗处理，炼苗基质由28～32重量份锯屑/稻壳、23～27重量份黄心土、4～6重量份草木灰、28～32重量份东北泥炭、4～6重量份珍珠岩和4～6重量份蛭石混合构成。 

6.如权利要求2或3或4或5所述的油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于：所述的接种茎段是从油茶树上截取的生长健壮的接种枝，将接种枝上的每片叶片截去3/4～5/6进行清洗消毒后再截去剩余的叶片和接种枝基部，然后按一腋芽一茎段进行截取得到。 

7.如权利要求2～6中任意一项所述的油茶组培苗的繁殖方法，其特征在于，具体的操作步骤为： 

初代培养：将消毒后的接种茎段接种至设有初代培养基的接种瓶内，并将接种瓶用封口膜封口扎紧，再将接种瓶避光处理4～6天，然后进行光照培养30～40天，初代培养基为MS+6-BA0.6～1.0mg/L+IAA0.07～1.3mg/L； 

继代培养：将初代培养得到的无菌苗转移至设有继代培养基的接种瓶内同时进行壮苗和增殖培养，培养35～45天，继代培养基为MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L； 

生根培养：将继代培养得到的丛生芽切成1.2～2.0cm分别含有嫩芽的无菌苗并接种至设有生根培养基的接种瓶内进行培养生根，培养25～35天，生根培养基为1/2～1/8MS+IBA2.4～4.8mg/L+NAA2.2～4.6mg/L。 

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