CN103005159A - 一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，以银杏叶为主要的固态发酵基质，以益生菌芽孢杆菌为菌株，在适宜的营养条件和培养条件下进行固态发酵，通过干燥、粉碎处理后，获得了该生物饲料添加剂，该生物饲料添加剂含有黄酮类化合物、萜内酯多种生物活性物质，能提高动物机体免疫力和抗氧化能力，同时通过生物发酵，产品中富含益生菌芽孢杆菌，能够调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长、减少动物肠道疾病的发生，提高动物机体的抗病力，能显著提高畜禽的生产性能，可替代或部分替代抗生素，从而为畜禽食品的消费使用提供了健康保障。

Description

一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物饲料研制技术领域，尤其涉及一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法。

背景技术

传统抗生素能显著提高畜禽的生产性能，但这些抗生素在畜禽体内的残留容易造成食品安全性问题，而天然植物饲料添加剂具有绿色、安全、无毒副作用或毒副作用低等特点，因此开发天然植物资源作为抗菌药物的替代物已成为饲料领域的研究热点之一。

银杏又称白果，属裸子植物银杏科的单型种，银杏叶中含有黄酮类、萜类、酚类等多种活性成分，具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化能力等作用。银杏叶及银杏叶的提取物，已经被广泛应用于医疗、食品防腐剂、植物保护和化妆品等领域，但国内对银杏叶作为饲料添加剂的研究较少。本发明旨在利用银杏叶中活性物质的药用价值，用以替代抗生素，探求银杏叶在畜禽生产中的推广应用前景。

近年来，益生菌以其独特的作用方式和生态效应，已被广泛应用于食品、医疗、畜禽和水产养殖等领域。在养殖业中相对使用抗生素而言，作为新型绿色添加剂的益生菌，由于其无残留、无污染以及不产生耐药性等特点，有其独特的优越之处，已逐步应用于畜禽业生产。

芽孢杆菌类微生物是一类好氧、可形成芽孢的革兰阳性菌，是国际公认的可在饲料制剂中食用的微生物菌种。

已有研究表明，芽孢杆菌在不利环境条件下能以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高的活性，在改善畜禽生产性能、维持肠道菌群平衡、提高消化率等方面均有较好的效果。芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中消耗大量的氧气，使肠道内氧气浓度降低，为肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等生理性厌氧菌的生长繁殖提供有利环境；同时，使得需氧的有害病原菌的生长由于缺氧而受到抑制，从而使菌群失调得以调整、肠道功能得以恢复，最终使胃肠道的微生态体系处在健康平衡的状态，动物的免疫力得到提高。芽孢杆菌在生长代谢过程中能产生多种抗菌物质，如短杆菌肽、枯草菌素和多粘菌素等，对常见的致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用。芽孢杆菌在生长的过程中，可产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等多种助消化酶，同时在消除抗营养因子上也发挥了重要作用。

目前国内关于芽孢杆菌在饲料中的应用研究也比较多，而且取得了一定的应用效果。陈家祥等(2010)研究发现，日粮中添加地衣芽孢杆菌有益于肉鸡的肠道发育和盲肠微生物区系平衡，饲养前期50mg/kg添加水平，饲养后期200mg/kg添加水平显著优化了肉鸡的肠道组织结构，抑制了盲肠中有害菌的生长。周振峰(2006)研究发现，每千克精饲料中20亿单位的地衣芽孢杆菌可显著提高泌乳奶牛产奶性能，同时奶品质有所改善，并且奶牛抵抗热应激的能力增强。

发明内容

本发明提供了一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，旨在提供以银杏叶为主要原料、以益生菌芽孢杆菌为菌株，经固态发酵制备的产品，并将制备的产品应用于饲料添加剂中，以获得更为有效的饲喂效果。

本发明的目的在于提供一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

步骤一，将固体发酵原料与微生物的营养盐溶液混合均匀，灭菌后得固体发酵基料；

步骤二，以益生菌芽孢杆菌为菌种，将菌种扩培后接种到步骤一所制备的固体发酵基料中进行发酵，

步骤三，对完成发酵后的物料进行干燥及粉碎处理，即得产品。

进一步，步骤一中所述固体发酵原料的各组成成分的重量份为：粉碎后的银杏叶5-8份、豆粕1-3份和麸皮1-2份，其中优选银杏叶7份、豆粕2份和麸皮1份。

进一步，步骤二中所采用益生菌为芽孢类益生菌。

进一步，益生菌可采用地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌。

进一步，步骤一中所述微生物营养盐溶液的组成和质量百分数为：葡萄糖1.5％、K₂HPO₄0.3％、MnSO₄0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、FeCl₃0.01％，余量为蒸馏水；其中，所述微生物营养盐溶液的pH值为7.0-7.4。

进一步，步骤一中，将固态发酵原料与微生物的营养盐溶液按1g∶1.2-2.0mL的配比比例进行混合。

进一步，步骤二中用液体种子接种，液体种子培养基采用典型的牛肉膏蛋白胨培养基，在温度37℃，转速180r/min的条件下，摇床培养36-48h，培养好的液体种子中，细胞数为5×10⁷-6×10⁷CFU，接种量为5％-20％g/ml；发酵条件为：湿度80～90％，温度32-38℃，发酵时间36-60h。

进一步，该制备方法所获得的银杏叶生物饲料添加剂在应用时，包括：按W/W计，在基础日粮中添加0.1％-1.0％的银杏叶生物饲料添加剂，混合均匀，用于畜禽养殖用的饲料。

本发明提供的银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，以银杏叶为主要的固态发酵基质，以益生菌芽孢杆菌为菌株，在适宜的营养条件和培养条件下进行固态发酵，通过干燥、粉碎处理后，获得了该生物饲料添加剂，该生物饲料添加剂含有黄酮类化合物、萜内酯多种生物活性物质，能提高动物机体免疫力和抗氧化能力，同时通过生物发酵，产品中富含益生菌芽孢杆菌，能够调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长、减少动物肠道疾病的发生，提高动物机体的抗病力，能显著提高畜禽的生产性能，可替代或部分替代抗生素，从而为畜禽食品的消费使用提供了健康保障。

附图说明

图1是本发明实施例提供的银杏叶生物饲料添加剂的制备方法的流程图；

图2是本发明实施例提供的地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物对21日龄肉鸡免疫器官指数的影响柱状图；

图3是本发明实施例提供的地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物对42日龄肉鸡免疫器官指数的影响柱状图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

图1示出了本发明实施例提供的银杏叶生物饲料添加剂的制备方法的实现流程。

该制备方法包括以下步骤：

步骤S101，将固体发酵原料与微生物的营养盐溶液混合均匀，灭菌后得固体发酵基料；

步骤S102，以益生菌芽孢杆菌为菌种，将菌种扩培后接种到步骤S101所制备的固体发酵基料中进行发酵，

步骤S103，对完成发酵后的物料进行干燥及粉碎处理，即得产品。

在本发明实施例中，步骤S101中固体发酵原料的各组成成分的重量份为：粉碎后的银杏叶5-8份、豆粕1-3份和麸皮1-2份，其中优选银杏叶7份、豆粕2份和麸皮1份。

在本发明实施例中，步骤S102中所采用益生菌为芽孢类益生菌。

在本发明实施例中，益生菌可采用地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌。

在本发明实施例中，步骤S101中微生物营养盐溶液的组成和质量百分数为：葡萄糖1.5％、K₂HPO₄0.3％、MnSO₄0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、FeCl₃0.01％，余量为蒸馏水；其中，微生物营养盐溶液的pH值为7.0-7.4。

在本发明实施例中，步骤S101中，将固态发酵原料与微生物的营养盐溶液按1g∶1.2-2.0mL的配比比例进行混合。

在本发明实施例中，步骤S102中用液体种子接种，液体种子培养基采用典型的牛肉膏蛋白胨培养基，在温度37℃，转速180r/min的条件下，摇床培养36-48h，培养好的液体种子中，细胞数为5×10⁷-6×10⁷CFU，接种量为5％-20％g/ml；发酵条件为：湿度80～90％，温度32-38℃，发酵时间36-60h。

在本发明实施例中，该制备方法所获得的银杏叶生物饲料添加剂在应用时，包括：按W/W计，在基础日粮中添加0.1％-1.0％的银杏叶生物饲料添加剂，混合均匀，用于畜禽养殖用的饲料。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的动物饲料添加剂。益生菌、银杏叶有效成分都能较好地提高动物的生长性能，但如同时使用效果更佳；即合生元的使用效果比单一使用益生菌、中草药显著的多。而且通过发酵，能较好地改善银杏叶的适口性，增加益生菌代谢过程中产生的具有生理活性的次级代谢产物。同时，产品芽孢杆菌在不利环境条件下能以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高的活性，在改善畜禽生产性能、维持肠道菌群平衡、提高消化率等方面均有较好的效果。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种动物饲料添加剂，包括以下步骤制备而成：

(1)发酵培养基的制备：

将固体培养基与营养盐溶液混合均匀，灭菌，得发酵培养基；其中，所述的固体培养基由银杏叶粉末、豆粕和麸皮组成；所述营养盐溶液主要由葡萄糖、K₂HPO₄、MnSO₄、MgSO₄·7H₂O和FeCl₃组成；

(2)向步骤(1)所制备的发酵基料中接种芽孢杆菌，按常规发酵方法和设备进行发酵；

(3)在低于70℃条件下完成发酵物料的干燥，粉碎，即得。

上述制备方法中，步骤(1)中，优选将固体培养基与营养盐溶液按照1g∶1.1-1.5mL(更优选为1g∶1.2mL的配比比例)的配比比例混合均匀，灭菌，得发酵培养基；所述的固体培养基优选按照以下方法配制而成：将银杏叶粉末、豆粕和麸皮按照银杏叶粉末∶豆粕∶麸皮＝∶5-8∶1-3∶1-2(更优选为7∶2∶1的重量配比比例)的重量配比混合均匀；

营养盐溶液的配制优选如下：每100mL营养盐溶液中含有以下重量的组分：葡萄糖1-2g，K₂HPO₄0.1-0.5g，MnSO₄0.1-0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1g，FeCl₃0.005-0.2g，余量为蒸馏水；更优选为每100mL营养盐溶液中含有以下重量的组分：葡萄糖1.5g，K₂HPO₄0.3g，MnSO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeCl₃0.01g，余量为蒸馏水。

步骤(2)中，使用的益生菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)等芽孢类益生菌，这些微生物可以从自然界中筛选、诱变获得，也可以从商业途径购买得到(例如可以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)。

步骤(2)中，液体种子培养基采用典型的牛肉膏蛋白胨培养基，在温度37℃，转速180r/min的条件下，摇床培养36-48h。培养好的液体种子中，细胞数为5×10⁷-6×10⁷CFU(CFU：菌落形成单位)。接种时，接种量为5％-20％(g/ml)；发酵条件为：湿度80～90％，温度32-38℃，发酵时间36-60h。更优选的发酵条件为接种量为10％(g/ml)；湿度85％，温度37℃，发酵时间48h。

上述任何一项制备方法所得到的产品。

上述的产品作为饲料添加剂的应用，包括：按W/W计，在基础日粮中添加0.1％-1.0％的该产品，混合均匀，或制粒后，用于牛、猪或鸡等畜禽养殖用的饲料。

有益效果：以银杏叶为主要的固态发酵基质，以益生菌芽孢杆菌为菌株，在适宜的营养条件和培养条件下进行固态发酵，通过干燥、粉碎等后处理，获得一种生物饲料添加剂。产品中含有黄酮类化合物、萜内酯等多种生物活性物质，能够提高动物机体免疫力和抗氧化能力。同时，通过生物发酵，产品中富含益生菌芽孢杆菌，能够调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长、减少动物肠道疾病的发生，提高动物机体的抗病力。本产品能显著提高畜禽的生产性能，可替代或部分替代抗生素，广泛用于猪、鸡、马、牛、鱼、虾等多种畜禽、水产动物中。

初步应用试验表明，在肉鸡日粮中添加0.3％-0.6％的地衣芽胞杆菌或纳豆芽胞杆菌银杏叶发酵物均能在一定程度上改善肉鸡的饲料效率(21-42d及1-42d)，促进胸腺(21d和42d)和脾脏(21d)的发育。

本发明饲料添加剂的应用方法：在基础日粮中添加0.1-1％(w/w)的本发明饲料添加剂，混合均匀，按常规饲喂方法投喂，也可以制粒后按常规饲喂方法投喂。

实施例1：地衣芽孢杆菌的银杏叶固态发酵

1、营养盐溶液的配制：按葡萄糖1.5％(即每100mL营养盐溶液中含葡萄糖1.5g，下同)，K₂HPO₄0.3％，MnSO₄0.02％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeCl₃0.01％的量依次称取并溶解于水中，配成营养盐溶液；

2、固体培养基的制备：按银杏叶粉末∶豆粕∶麸皮＝7∶2∶1的比例称取三者，混匀；

3、按每10g固体培养基加12mL营养盐溶液的比例将上述两者混合，搅拌均匀，配制成发酵培养基；将配制好的发酵培养基在121℃温度下灭菌1h，取出，冷却；

4、在接种室进行常规的无菌操作，每10g发酵培养基接种地衣芽孢杆菌2mL(地衣芽孢杆菌的培养采用液体法，常规的种子液体培养法，37℃、180r/min下摇瓶培养)，37℃下培养48h，发酵结束；

5、在低于80℃的条件下干燥，粉碎，即得。

实施例2：纳豆芽孢杆菌的银杏叶固态发酵

1、营养盐溶液的配制：按葡萄糖1.5％(即每100mL营养盐溶液中含葡萄糖1.5g，下同)，K₂HPO₄0.3％，MnSO₄0.02％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeCl₃0.01％的量依次称取并溶解于水中，配成营养盐溶液；

2、固体培养基的制备：按银杏叶粉末∶豆粕∶麸皮＝7∶2∶1的比例称取三者，混匀；

3、按每10g固体培养基加12mL营养盐溶液的比例将上述两者混合，搅拌均匀，配制成发酵培养基；将配制好的发酵培养基在121℃温度下灭菌1h，取出，冷却；

4、在接种室进行常规的无菌操作，每10g发酵培养基接种纳豆芽孢杆菌2mL(地衣芽孢杆菌的培养采用液体法，常规的种子液体培养法，37℃、180r/min下摇瓶培养)，37℃下培养48h，发酵结束；

5、在低于80℃的条件下干燥，粉碎，即得。

试验例1：本发明饲料添加剂中蛋白酶活性及活菌数的检测

1、检测对象：本发明实施例1和2所制备的动物饲料添加剂，分别编号为产品1和2。

2、检测方法：

蛋白酶活的测定方法

(1)酶的提取：准确称取固体酶制剂1g，加入一定体积的蒸馏水，充分震荡后，过滤备用；

(2)酶活的测定：吸取0.5％酪蛋白溶液2mL于试管中，30℃水浴中加入预热的酶液1mL，立即计时，反应10min后由水浴锅取出，并立即加入10％三氯乙酸溶液3mL，放置15min后用滤纸过滤。取2支试管，分别加入样品滤液和水各1mL，然后加入0.55mol/L的Na₂CO₃5mL，混合均匀后再加入酚试剂1mL，立即混匀，在30℃显色15min。以加水的一管做空白，在680nm处测样品的吸光度值，在标准曲线上查得所生成的酪氨酸微克数；

(3)酶活的表示方法：1g固体酶制剂在30℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μmol酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位。酶活力单位为μg/g。

活菌数的测定方法

采用稀释涂布平板法。在无菌操作室称取1g固态发酵培养物，置于灭过菌的50mL离心管中，加入20mL无菌水，充分震荡均匀。然后吸取0.5mL稀释液，按10倍梯度进行稀释涂布平板，置于37℃培养箱内培养1d，1d后进行菌落计数。

3、检测结果如下：

产品名称	蛋白酶活力(μg/g)	菌落数(CFU/g绝干重)
			产品1	1735	1.233×1011
产品2	2856	2.619×1010

试验方法：

选用1日龄(1d)健康、体重相近的AA肉仔鸡300只(P＞0.05)，按单因子完全随机设计分为5个处理，每个处理60只(含6个重复，每个重复10只鸡)。分别为基础日粮对照组(Contr.组)、0.3％地衣芽胞杆菌发酵银杏叶添加组、0.6％地衣芽胞杆菌发酵银杏叶添加组，0.3％纳豆芽胞杆菌发酵银杏叶添加组和0.6％纳豆芽胞杆菌发酵银杏叶添加组。试鸡自由采食和饮水，喂养时遵循少喂勤添的原则，采用常规管理与免疫，试验期42d。期间共进行两次称重(21和42d)，称重前一天19:00断料，不断水，第二天08:00空腹称重和结料，计算采食量(FI)、体增重(BWG)及料重比(F/G)。整个饲养过程中不饮用电解多维或与VE相关的物质。

试验日粮参照NRC(1994)建议的家禽营养需要，采用玉米-豆粕型日粮。日粮分前期(0-21d)和后期(21-42d)两个阶段，采用重量替代法配制，在不同的日粮处理组中，用同样重量的麸皮来替代等量的银杏叶发酵物，日粮组成及主要营养水平见表1。日粮组成及主要营养水平见表1。

表1日粮组成及营养水平(风干基础，％)

注：1)*为计算值。

2)^a：每kg饲粮提供：铁，60mg；铜，7.5mg；锌，65mg；锰，110mg；碘，1.1mg；硒，0.4mg；维生素A，4500IU；维生素D₃，1000IU；20mg；维生素K，1.3mg；维生素B₁，2.2mg；维生素B₂，10mg；维生素B₃，10mg；胆碱，400mg；维生素B₅，50mg；维生素B₆，4mg；维生素H，0.04mg；维生素B₁₁，1mg；维生素B₁₂，1.013mg。

分别于第21和42d 08:00开始采样。从每个处理组中各随机抓取6只鸡(每重复1只)，称重后颈静脉放血致死后，分离免疫器官，胸腺、脾脏和法氏囊。分别称重后，计算免疫器官指数。

试验结果：由表2可见，与对照组相比，日粮中添加0.3％或0.6％的地衣芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物均能够显著提高21-42d及1-42d肉鸡的饲料效率；其中日粮中添加0.3％或0.6％的纳豆芽孢杆菌的提高作用最显著。就免疫器官指数而言，与对照组相比，21d时，日粮中添加0.3％或0.6％的纳豆芽孢杆菌对肉鸡脾脏指数的提高作用最为显著(图2)，42d时，0.6％地衣芽孢杆菌和0.3％-0.6％纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物添加组的胸腺指数有显著增加，而0.3％地衣芽孢杆菌和0.6％纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物添加组的脾脏指数有显著增加(图3)。

试验结论：在肉鸡日粮中添加0.3％-0.6％的地衣芽胞杆菌或纳豆芽胞杆菌银杏叶发酵物均能在一定程度上改善肉鸡的饲料效率(21-42d及1-42d)，促进胸腺(21d和42d)和脾脏(21d)的发育。

表2地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌银杏叶发酵物对肉鸡生产性能的影响

注：BWG＝每日每只鸡增重；FI＝每日每只鸡采食量；F/G＝料重比。

本发明实施例提供的银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，以银杏叶为主要的固态发酵基质，以益生菌芽孢杆菌为菌株，在适宜的营养条件和培养条件下进行固态发酵，通过干燥、粉碎处理后，获得了该生物饲料添加剂，该生物饲料添加剂含有黄酮类化合物、萜内酯多种生物活性物质，能提高动物机体免疫力和抗氧化能力，同时通过生物发酵，产品中富含益生菌芽孢杆菌，能够调节动物肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，促进动物生长、减少动物肠道疾病的发生，提高动物机体的抗病力，能显著提高畜禽的生产性能，可替代或部分替代抗生素，从而为畜禽食品的消费使用提供了健康保障。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

步骤一，将固体发酵原料与微生物的营养盐溶液混合均匀，灭菌后得固体发酵基料；

步骤二，以益生菌芽孢杆菌为菌种，将菌种扩培后接种到步骤一所制备的固体发酵基料中进行发酵，

步骤三，对完成发酵后的物料进行干燥及粉碎处理，即得产品。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述固体发酵原料的各组成成分的重量份为：粉碎后的银杏叶5-8份、豆粕1-3份和麸皮1-2份，其中优选银杏叶7份、豆粕2份和麸皮1份。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所采用益生菌为芽孢类益生菌。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，益生菌可采用地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述微生物营养盐溶液的组成和质量百分数为：葡萄糖1.5％、K₂HPO₄0.3％、MnSO₄0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、FeCl₃0.01％，余量为蒸馏水；其中，所述微生物营养盐溶液的pH值为7.0-7.4。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，将固态发酵原料与微生物的营养盐溶液按1g∶1.2-2.0mL的配比比例进行混合。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中用液体种子接种，液体种子培养基采用典型的牛肉膏蛋白胨培养基，在温度37℃，转速180r/min的条件下，摇床培养36-48h，培养好的液体种子中，细胞数为5×10⁷-6×10⁷CFU，接种量为5％-20％g/ml；发酵条件为：湿度80～90％，温度32-38℃，发酵时间36-60h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该制备方法所获得的银杏叶生物饲料添加剂在应用时，包括：按W/W计，在基础日粮中添加0.1％-1.0％的银杏叶生物饲料添加剂，混合均匀，用于畜禽养殖用的饲料。

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