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CN102994407A - 黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用 - Google Patents

黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法与应用。本发明所涉及的褐藻胶裂解酶Alg2A来源土壤新分离菌株Flavobacterium sp.S20。本发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。本发明提供的褐藻胶裂解酶Alg2A可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

Description

黄杆菌属菌株与内切褐藻胶裂解酶编码基因及制备与应用
技术领域
本发明涉及一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该内切褐藻胶裂解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的内切褐藻胶裂解酶Alg2A可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。
背景技术
广阔的海洋蕴藏着丰富的海藻资源，而其中主要由蓝藻、绿藻、红藻和褐藻四大类组成。褐藻胶(algin)是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶在褐藻细胞壁中主要的存在形式为水溶性褐藻酸钠(sodium alginate)、钾等碱金属盐类和水不溶性褐藻酸(alginic acid)及其与2价以上金属离子结合的褐藻酸盐类(alginates)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(窦勇，广西轻工业，2009，10：12-13)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50ku左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(Wong TY et al.Annual Review of Microbiology，2000，54：289-340)。
褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类：1，4-β-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(Ec 4.2.2.3)和1，4-a-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。Dong Eun Kim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomyces sp.ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达(Kim et al.Marine Biotechnology.2009.11：10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。
将产酶菌株构建其基因组文库，可以突破PCR克隆基因的限制，充分挖掘和利用微生物的基因资源，再结合功能筛选的方法，能够发现全新的基因。Caswell等从Klebsiella pneumoniae PG1菌株的基因组文库中克隆到对聚古罗糖醛酸片段特异性降解的褐藻胶裂解酶基因，该酶的分子量为28kDa(Caswell et al.Gene，1989，75：127-134)。Maki和Kraiwattanapong等人从Pseudomonas sp.OS-ALG-9菌株的基因组文库中先后克隆到了两个褐藻胶裂解酶基因，一个是对聚甘露糖醛酸片段特异性降解的aly，该基因编码区长1365bp，编码了398个氨基酸，分子量约50kDa(Maki et al.Journal ofGeneral Microbiology，1993，139：987-993)。另一个是alyII，该基因编码区长2141bp，编码了713个氨基酸，分子量约79kDa(Kraiwattanaponget al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1997，61(11)：1853-1857)。迄今为止，对于黄杆菌产褐藻胶裂解酶研究较少。Takeuchi等人用柱层析法从Flavobacterium multivolum K-11所产的粗酶液中纯化到了两种褐藻胶裂解酶，一种是分子量为43kDa的聚古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)(Takeuchi et al.Food Science andTechnology International.1997.3(1)：22-26)，另一种是分子量为32kDa，对聚古罗糖醛酸片段和聚甘露糖醛酸片段这两种片段底物降解速率相同的褐藻胶裂解酶(Takeuchi et al.Food Science andTechnology International.1997.3(4)：388-392)。An等人新分离到一株产褐藻胶裂解酶的Flavobacterium sp.LXA菌株，他们从该菌株的发酵培养液中用硫酸铵沉淀法部分纯化了褐藻胶裂解酶，并将酶用于褐藻胶寡糖的生产及活性研究(An et al.Journal of Applied Microbiology.2009.106：161-170)。目前来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶基因尚未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产褐藻胶裂解酶的黄杆菌属新菌株，其为黄杆菌S20，分类命名：黄杆菌Flavobacterium sp.，保藏编号：CGMCC NO.5026。
本发明的第二个目的是提供一种新型高效的内切褐藻胶裂解酶Alg2A及其编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种制备新型高效内切褐藻胶裂解酶Alg2A的方法。
本发明的第四个目的是提供含有所述的内切褐藻胶裂解酶Alg2A基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。
本发明的另一个目的是提供新型高效内切褐藻胶裂解酶Alg2A在褐藻酸钠降解中的应用。
本发明所提供的内切褐藻胶裂解酶Alg2A，来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株Flavobacterium sp.S20，其氨基酸序列具有如下特征之一：
1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-288或23-288位氨基酸残基序列，其中1-22位为信号肽，23-288位为有活性的褐藻胶裂解酶Alg2A的氨基酸。
2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-288或23-288位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻酸钠活性的蛋白质。
3)与序列表中的SEQ ID NO.2所限定的氨基酸序列的同源性达到80％及以上且具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质。
本发明还提供了内切褐藻胶裂解酶Alg2A的编码基因(命名为alg2A)，具有下述核苷酸序列特征之一：
1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；
2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；
3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解褐藻酸盐蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
本发明的褐藻胶裂解酶Alg2A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的Alg2A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。
制备重组酶Alg2A的方法，是将编码基因alg2A克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶。
所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶Alg2A的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。
用于重组表达内切褐藻胶裂解酶Alg2A的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。
本发明的Alg2A来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株Flavobacterium sp.S20，通过对Flavobacterium sp.S20基因组DNA文库的活性筛选，获得能够降解褐藻酸钠的阳性克隆，进一步通过测序、同源比对的方法获得内切褐藻胶裂解酶Alg2A的全长编码序列，该基因编码区长867bp，编码了288个氨基酸，分子量约33kD，属于褐藻胶裂解酶家族2。大肠杆菌重组表达获得的Alg2A，以褐藻酸钠为底物时，在45℃、pH8.5的条件下具有最高酶活性，比活达300U/mg。相对于褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段(polyM)这两种底物，Alg2A对聚古洛糖醛酸片段(polyG)有更高的降解活性。
本发明的内切褐藻胶裂解酶Alg2A可广泛应用化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。
附图说明
图1：内切褐藻胶裂解酶Alg2A的蛋白质三维结构模型
图2：重组内切褐藻胶裂解酶Alg2A表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：M：蛋白质标识物(marker)，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1：重组菌破壁后上清，上样量10μl，泳道2：重组菌破碎后上清经镍柱纯化的流出液，上样量10μl，泳道3：100mmol的咪唑洗脱收集液，上样量10μl。
图3：pH值对内切褐藻胶裂解酶Alg2A的活性影响曲线。
图4：温度对内切褐藻胶裂解酶Alg2A的活性影响曲线。
图5：温度对内切褐藻胶裂解酶Alg2A的稳定性影响曲线。
图6：pH值对内切褐藻胶裂解酶Alg2A的稳定性影响曲线。
图7：内切褐藻胶裂解酶Alg2A的底物偏好性曲线。
图8：内切褐藻胶裂解酶Alg2A降解褐藻酸钠所得产物的电喷雾质谱(ESI-MS)分析图。
黄杆菌属的菌株，其为黄杆菌S20，分类命名：黄杆菌Flavobacterium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.5026，保藏日期2011年07月05日。
具体实施方式
实施例1黄杆菌属新菌株Flavobacterium sp.S20的培养及产褐藻胶裂解酶
所采用的菌种为黄杆菌S20，挑取Flavobacterium sp.S20菌株(CGMCC NO.5026)的单克隆接种到50ml液体培养基中，接着放入温度为30℃、转数为220rpmin的摇床培养48小时后，将培养液离心收集Flavobacterium sp.S20菌体且保留上清培养基。用5ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH7.0)重悬菌体后超声破菌。
使用的液体培养基配方为(g/L)：牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1.0g、NaCl 5.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2 0.2g、KH2PO41.0g、FeSO4·7H2O 0.02g，pH值为7.0。
酶活力单位(U)定义：每分钟催化褐藻酸钠产生1μmol还原糖所需要的酶量。根据二硝基水杨酸测褐藻胶裂酶酶活的方法(Qing-Da An et al.Process Biochemistry，2008，43：842-847)，测得Flavobacterium sp.S20菌株的液体培养基中酶活为0.37U/ml，而该菌体裂解液酶活为1.34U/ml，所以用50ml液体培养基培养Flavobacterium sp.S20菌株48h得到的培养液总褐藻胶裂解酶酶活是1.71U/ml。
实施例2 Flavobacterium sp.S20菌株基因组DNA的提取
取2ml过夜培养的黄杆菌S20新鲜菌液，离心(12,000rmp，3min)收集菌体。用磷酸盐缓冲液(20mM，pH7.0)洗菌体三次，加入650μl DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl；100mM Na2EDTA；100mM Na3PO4；1.5M NaCl；1％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵；pH8.0)，混匀后，置-80℃冷冻，接着放置在65℃水浴中融化，如此反复冻融三次。冷却后加入4μl溶菌酶(100mg/L)于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)30min，接着加入3μl蛋白酶K(20mg/mL)后继续振荡30min，最后加入50μl 20％(w/v)十二烷基硫酸钠，混匀后，65℃保温2h(每隔20min上下颠倒离心管混匀)。12,000rpm室温离心10min，收集上清液，加入500μl的饱和酚：氯仿：异戊醇(体积比为25∶24∶1)由提两次，接着加入250μl氯仿：异戊醇(体积比为24∶1)抽提一次后加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置20min后，12,000rpm离心15min。沉淀用体积浓度为70％的乙醇漂洗，干燥后用60μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMNa2EDTA，pH8.0)溶解，加入1μl核糖核酸酶(去除RNA)后放入-20℃保存。
实施例3 Flavobacterium sp.S20菌株总基因组DNA文库的构建与从文库中筛选表达褐藻胶裂解酶活性的克隆
用Sau3A I酶对抽提出的黄杆菌S20菌株基因组DNA进行随机酶切，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物获得3-10kb的DNA片段。将这些片段与经BamHI酶切并用碱性磷酸酶去除5’端磷酸基的pGEM11z载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，转化产物涂布于含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，40μg/ml)、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，40μg/ml)、Amp(氨苄西林，50μg/ml)的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养12～16h。将长出的白色大肠杆菌转化子挑取到96孔培养板孔中(200μl LB培养基/孔)，37℃培养12～16h后每个培养板孔中加入150μl体积浓度为50％甘油，然后保存于-80℃，保存于96孔培养板孔中的所有白色大肠杆菌转化子即为黄杆菌S20菌株的基因组DNA文库克隆。Sau3A I酶、BamHI酶及碱性磷酸酶均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。
将Flavobacterium sp.S20菌株的基因组文库克隆接种于96孔培养板中，每个孔装有200μl Luria-Bertani培养基(含氨苄西林50μg/ml)，37℃培养12h后离心收集菌体。每孔加入20μl磷酸缓冲液(20mM，pH7.0)后，将菌体放置-80℃冷冻，接着置于37℃融化，如此重复冻融三次使菌体破裂。用前面所述的二硝基水杨酸法检测所有文库克隆的菌体裂解液是否有酶活，结果显示编号为VII 2H的文库克隆表达褐藻胶裂解酶活性，将该文库克隆所含的重组质粒命名为pGEM11z-VII 2H。
实施例4重组质粒pGEM11z-VII 2H上表达褐藻胶裂解酶活性的基因的测序及其序列分析
将表达褐藻胶裂解酶活性重组质粒pGEM11z-VII 2H送去英潍捷基公司测序。用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
NCBI分析结果显示重组质粒pGEM11z-VII 2H上携带一个褐藻胶裂解酶基因(命名为alg2A)，该基因编码区长867bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。alg2A和Lacinutrix sp.5H-3-7-4的全基因组序列(NCBI注册号：CP002825.1)中的520个核苷酸有71％的同源性。
alg2A编码的褐藻胶裂解酶Alg2A由288个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质的理论分子量约为33kD。用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART，http://smart.embl-heidelberg.de/)分析褐藻胶裂解酶Alg2A的结构信息，结果显示N端开始至第22个氨基酸是信号肽序列，而第23-288位氨基酸属于褐藻胶裂解酶家族2。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对褐藻胶裂解酶Alg2A的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的Alg2A蛋白质三维结构模型如图1所示。
序列表
SEQ ID NO.1
ATGAGCATACAATTTTCAAAAATCTTATTACTAACGGTTCTA
GCAACTGCTACAATTAGTAATGCACAGGATAAAAAATCAAA
AAGCAAAACTGCTAAAATTGATTGGTCTCATTGGACGGTTAC
TGTGCCTGAGGAGAATCCAGATAAACCAGGTAAGCCGTACT
CTTTAGGGTATCCTGAAATACTAAATTATGCTGAGGATAAAA
TCGCATCCAAGTACATGTACGATGACCCAAAAGACAAGTCT
GTTGTTTTTTATGCCTTTCCTTCGGGAGTGACCACGGCTAATA
CGCATTATTCTCGTTCTGAGCTAAGAGAGACAATGGAAACTG
GTAGCAATAAGGTCAACTGGACATTTGCAAAAGGCGGTAAA
ATGAGAGGTACGTATGCTATTGACGACATTTCAAAAGAGCC
AGATGGCAAATACAGCCGCGTTATTATTGCGCAAATTCACGG
TGTATTAACGGATGAACAACGTGATTTAATTGGTCAAAAAG
ACAACAATGCACCGCCTATTTTGAAAGTGTATTGGGATAAAG
GAAAAATTCGTGTGAAAACAAAAGTACTTAAAGATTTGAAC
GCGCCTTATAAAGAAATGCTTTTAGAACATGCTTGGGGTGAT
GATGAAGGTCGAAATTTTAAAGAGAAAATCGATTTAAACAC
AAGGTTTACTCTAGAAGTGAAAGTTTCGGATGGGCGAATGG
AAGTGATTTTAAATGATACAGAATCATTGGTTTACGATGATA
TTCACATGAAAAAATGGGGGATATTCGAAAATTATTTTAAAG
CAGGGAATTATTTTCAATCTAAAACACCAGGTACCTTTGCAA
AGGTAAAAATATATTCTTTACAAGTTACTCATTAG
SEQ ID NO.2
MSIQFSKILLLTVLATATISNAQDKKSKSKTAKIDWSHWTVTVP
EENPDKPGKPYSLGYPEILNYAEDKIASKYMYDDPKDKSVVFY
AFPSGVTTANTHYSRSELRETMETGSNKVNWTFAKGGKMRGT
YAIDDISKEPDGKYSRVIIAQIHGVLTDEQRDLIGQKDNNAPPIL
KVYWDKGKIRVKTKVLKDLNAPYKEMLLEHAWGDDEGRNFK
EKIDLNTRFTLEVKVSDGRMEVILNDTESLVYDDIHMKKWGIFE
NYFKAGNYFQSKTPGTFAKVKIYSLQVTH
实施例5 alg2A基因在大肠杆菌中的重组表达
以上述的重组质粒pGEM11z-VII 2H为模板，用下述引物对进行PCR扩增。引物对如下：正向引物Alg2A-F：
(CATATGCAGGATAAA
AAATCAAAAAGCAAAACTG)，反向引物Alg2A-R：
(CTCGAGATGAG
TAACTTGTAAAGAATAT)，正向引物下划线标注的是限制性内切酶Ned I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。Taq DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒-50℃退火30秒-72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物用Ned I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产物pET-21a载体用Ned I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。Ned I和Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。
将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET-21a载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株后涂布于含有50μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/ml氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物Alg2A-F和反向引物Alg2A-R进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去英潍捷基公司测序，结果表明，在pET-21a的Ned I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO 1所示的alg2A基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET21a-Alg2A。
将pET21a-Alg2A转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行褐藻胶裂解酶Alg2A诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶Alg2A的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的褐藻胶裂解酶Alg2A在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。实施例6褐藻胶裂解酶Alg2A的酶学性质分析
(1)pH和温度对酶活性的影响
将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的Alg2A酶液以及不同pH值的20mM Tris-HCl缓冲液(pH范围为6.0-10.0)按8∶2∶10(体积比)的比例混合后，在40℃反应10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示Alg2A在pH 8.5时达到最大活力，表明Alg2A的最适反应pH为8.5(如图3)
在最适pH下，将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的Alg2A酶液以及20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)按8∶2∶10(体积比)的比例混合，分别在不同温度(20℃-70℃)反应10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示Alg2A在45℃时达到最大活力，表明Alg2A的最适反应温度为45℃(如图4)。
将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的Alg2A酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液按8∶2∶10(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力，接着用购于博彩公司的蛋白质定量试剂盒测定Alg2A酶液的蛋白含量，结果表明重组Alg2A对褐藻酸钠的比活为300U/mg。
(2)pH和温度对酶稳定性的影响
将在不同温度(20℃-50℃)下热处理1h后的Alg2A酶液与质量浓度为1％褐藻酸钠底物溶液按2∶8(体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，结果表明Alg2A在低于40℃的温度下具有较好的热稳定性(如图5)。
将在30℃，不同的pH(pH4-10)预孵育24h后的Alg2A酶液与质量浓度为1％褐藻酸钠底物溶液按2∶8(体积比)的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不经过pH处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，结果显示在pH5～10的范围内，Alg2A酶活仍保持60％以上，表明Alg2A对pH值耐受范围较广(如图6)。
(3)Alg2A的底物偏好性
将纯化的Alg2A分别与质量浓度为1％的褐藻酸钠、聚甘露糖醛酸片段(polyM)和聚古洛糖醛酸片段(polyG)三种不同底物按2∶8(体积比)的比例混合，然后在30℃，pH8.5条件下反应。取不同反应时间点的产物测其235nm紫外吸收值，发现随着酶解时间延长，235nm吸收值逐渐增加，根据紫外法测褐藻胶裂解酶的原理(Qing-Da An et al.Process Biochemistry，2008，43：842-847)，证实Alg2A是裂解酶。另外，如图7所示，Alg2A对聚古洛糖醛酸片段降解速率快于对褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段的降解，表明Alg2A偏好降解聚古洛糖醛酸片段。
实施例7金属离子对Alg2A活性的影响
将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的Alg2A酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)按8∶2∶10(体积比)的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为5mM或10mM，然后在45℃反应10分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时Alg2A的活性(设定为100％)，结果如下表所示。实验结果显示，K+、Na+能增加Alg2A活性，Li+、Mg2+对Alg2A活性基本无影响，Ca2+、Fe2+等其他离子对酶活呈现抑制作用。
表1：金属离子对Alg2A活性的影响
Figure BDA0000121176720000101
实施例8 Alg2A降解褐藻酸钠所得产物的电喷雾质谱(ESI-MS)分析
将质量浓度为1％褐藻酸钠底物、纯化的Alg2A酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液按8∶2∶10(体积比)的比例混合后，在pH8.5，45℃条件下反应，选取不同酶解时间(0.5、1、1.5、2小时)的产物进行电喷雾质谱分析。电喷雾质谱条件为采用正离子模式，离子源电压：4.5kV；鞘气流速：30arb；毛细管温度：275～300℃；管镜电压：250V；扫描范围：150-2000。
其中酶解2小时的电喷雾质谱图如图8所示。质谱图上显示Alg2A降解褐藻酸钠2小时的产物中有一系列不同聚合度的褐藻酸钠寡糖，该结果充分证明了Alg2A属于内切褐藻胶裂解酶。因此，内切褐藻胶裂解酶Alg2A可被用于褐藻酸钠寡糖的制备以及与褐藻酸钠降解相关的领域，包括化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等。

Claims (7)

1.黄杆菌属的菌株，其为黄杆菌S20，分类命名：黄杆菌Flavobacterium sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.5026，保藏日期2011年07月05日。
2.一种来源于权利要求1所述菌株(Flavobacterium sp.S20)的内切褐藻胶裂解酶基因Alg2A，其核苷酸序列具有如下特征之一：
1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；
2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；
3)具有与序列表中SEQ ID NO.1所限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解褐藻酸盐的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
3.按照权利要求2所述的内切褐藻胶裂解酶基因编码的内切褐藻胶裂解酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一：
1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-288或第23-288位氨基酸残基序列；
2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-288或23-288位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后，具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质；
3)与序列表中SEQ ID NO.2所限定的氨基酸序列的同源性达到80％及以上且具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质。
4.一种制备如权利要求3所述的内切褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：是将权利要求2所述的内切褐藻胶裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶；
所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：用于重组表达内切褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种。
6.一种如权利要求3所述的内切褐藻胶裂解酶在褐藻酸盐降解中的应用，其特征在于：具有如下用途之一或二种以上；
1)用于断裂褐藻酸盐或褐藻多糖的糖苷键，获得褐藻酸盐寡糖；
2)用于降解红藻、或褐藻细胞壁中的褐藻酸盐组分，抽提原生质体，原生质体可用于食品及藻类研究；
或3)用于破坏致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)所形成的菌膜中褐藻酸钠成分，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的肺囊肿性纤维化症或其他感染。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述内切褐藻胶裂解酶Alg2A与其他褐藻胶降解酶混合后，用于协同断裂褐藻酸盐糖苷键方面的应用。
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