CN102972192A - 在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，是通过芥子酶制剂促进菜粕中硫代葡萄糖苷快速降解，释放异硫氰酸酯进而发挥抑菌防病的药效，其特征在于：土壤温度在15℃以上，将田块中前茬作物产生的残体清除干净，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜粕均匀洒入田间，菜粕用量为200-400公斤/亩，再将芥子酶制剂均匀洒入田间，芥子酶制剂用量为1-1.5公斤/亩，再将土壤旋耕、浇水，使得土壤水分含量为田间最大持水量的60-70%，并覆盖塑料薄膜，土温高于25℃时，覆膜，时间为15-20天，土温低于25℃时，覆膜时间为20-30天，然后揭膜通气2-3天，即可提高菜粕抑菌防病药效。

Description

在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法

技术领域

本发明涉及一种在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法。属于农业废弃物综合利用领域。

背景技术

油菜是世界第三大油料作物,菜籽产量仅次于大豆和棉籽，是最重要的油料作物之一。自1978年以来,我国油菜种植面积和产量己稳居世界第一位,达到700万公顷,占世界油菜播种面积的26%，可产生约1000万吨的菜粕。菜粕中蛋白质含量高达40-45%，是一种优良的蛋白原料，有作为饲用蛋白开发的应用潜力，但其添加比例一般不能高于15-20%，因为菜粕中含有的植物次生代谢产物硫代葡萄糖甙（GSLs）在芥子酶的作用下可分解产生氰、噁唑烷硫酮(OZT)、异硫氰酸酯(ITCs)等有毒物质以及其它抗营养因子，影响动物的生长发育，极大影响了菜籽粕的饲用价值。菜粕经过脱毒后可以饲用，但脱毒工艺复杂，成本较高，有“三废”污染，技术推广仍然面临很大困难。因此，目前饲用菜粕还不到总量的三分之一。

菜粕除了含有高质量的氮素，磷、钾和硫的含量也均分别达到1.2-1.5%,是一种优质的有机肥。菜粕作为有机肥料使用有悠久的历史。大量的资料表明，在新开垦的土地施用菜粕能提高土壤有机质含量和土壤肥力，快速培肥土壤，提高产量；而在土壤质量恶化的耕地使用菜粕类有机肥可以显著改良土壤的物理、化学和生物学性状，起到修复土壤和克服土壤障碍因子的作用，同时减少化学肥料和农药的用量，改善农产品品质。 

虽然菜粕作为肥料的施用效果被普遍认可，然而菜粕所具有的另外一种功能—“药效”却鲜为人知，在土壤中所起的作用也远未发挥出来。在菜粕作为饲料应用时，菜粕中含有的硫代葡萄糖甙的主要分解产物异硫氰酸酯对动物具有毒害作用，是限制其饲用的不利因子；然而，菜粕施用于土壤中，硫代葡萄糖甙分解所产生的异硫氰酸酯却具有广谱杀菌活性，对土壤中的线虫、细菌、真菌等有害生物具有很强的杀生作用，可用于农作物土传病虫害的防治，因此菜粕是一种优良的“药肥双效”生物资源。但要使得菜粕施入土壤后硫代葡萄糖甙分解产生异硫氰酸酯而对病原生物起到杀伤作用，必须具备一定的施用技术，满足相应的土壤管理条件。

菜粕是油菜粕和芥菜粕的统称。虽然我国在大力研究和推广双低油菜，但至目前为止，由于双低油菜抗病虫害、低温、干旱等逆境的性能较差，目前也仅在长江中下游部分地区推广，在我国的西部和中部地区仍然以常规油菜种植为主；同时，世界范围内生物质能源产业的快速发展使得以制造生物材油为目的芥菜种植广泛兴起，大量的芥菜粕将随之产生，而芥菜粕中硫代葡萄糖甙的含量远高于油菜粕，饲用适合度更小，其处置利用将面临更大的难题。因此，大部分的菜粕在将来很长一段时间内仍然面临着合理、高效利用的困境。 另一方面，我国可耕地面积不断缩小，而社会的快速发展和人民生活水平的不断提高使得人们对农产品数量和品种的需求日趋增加，高效农业的强势推进使得设施种植业在全国范围内高速发展，设施栽培的大肥大水和高复种指数使得土壤长年处于高负荷运转状态，土壤的物理、化学和生物学性状急剧恶化，土壤质量显著下降，土传病虫害发生面积和程度不断增加，已经严重制约了设施种植业的大力发展，迫切需求新的、环境友好的土壤改良及修复产品及技术。因此，既具有很好的肥料效果又能对多种土传病菌有杀灭或抑制效果、可有效防除土传病害的十字花科芸薹属植物及其饼粕再次成为相关领域关注和研究的热点。欧美等国家已经将芥菜绿肥及芥菜粕开发为商业化的药肥产品，在蔬菜、花卉、果树等作物的根结线虫、疫病及枯黄萎病等土传病害防治中取得良好效果，显示巨大的应用潜力。

有关以菜粕或者菜粕与其他成份配合作为肥料使用防治病虫害的专利报道有：申请（专利）号：93115650.5，由辣椒树脂、氯化稀土、菜籽饼或棉籽饼、硫酸锌、盐酸按一定配比制成。本发明同时具有杀虫、杀菌和促进植物生产的功能。申请（专利）号：200610128495.1：本发明公开了一种防治蔬菜根结线虫病的复合有机改良剂及其制作方法，具体是将以上所述菜籽饼、松锯末、蓖麻叶三种成分中其中的菜籽饼、松锯末充分腐熟后，晾干粉碎备用；申请（专利）号：201010130961.6，一种复合微生物肥料及其制备方法。 其特征是它由油菜菜籽饼、作物秸秆、真菌菌体、细菌菌体和水按照一定比例制备而成， 本发明通过2次固体发酵法，将真菌和细菌进行混合。还有其他以菜粕为主要原料或者为配料与其他肥料复配生产有机肥的专利。

综合以上材料可以看出,所有的公开专利都是菜粕与化学肥料、有机肥料或其他营养成分复配获得具有促生长、防病虫作用的肥料。虽然也有研究报道施用菜粕或者其复配肥料可以减轻多种作物病虫害的发生，但最后都归结为菜粕的肥效促进了作物生长而提高作物本身的抗病性，而均未涉及到利用菜粕中含有的硫代葡萄糖甙分解所产生的异硫氰酸酯而起到对病害的防控作用。

最近研究发现，菜粕中硫代葡萄糖甙（GSLs）的水解率低是造成土壤中异硫氰酸酯（ITCs）浓度低、影响杀菌效果的主要原因。影响GSLs水解的因子有菜粕破碎程度、芥子酶活性、土壤温度、水分含量等。Morra在实验室条件下加大材料破碎程度和增加土壤水分含量，使得GSLs的水解率由15%提高到30%，而田间状态下，GSLs水解率仍然低于15%。Gimsing等在田间状态下，采用高、低GSLs含量的两种材料， 优化材料破碎度和土壤水分含量，检测土壤中GSLs和ITCs的浓度，发现经过12天，两种材料GSLs的水解率仍然只有26%和56%，大部分的GSLs仍然未被水解，但研究发现GSLs的水解率和土壤中芥子酶的活性呈正相关。含有GSLs的植物组织（包括菜粕）同时含有芥子酶，在完整的植物细胞中，二者分布在细胞的不同部位，而当植物受到昆虫攻击、机械损伤或病原菌侵染时，芥子酶就会被释放出来，催化GSLs水解产生杀生化合物。而大量的研究发现菜粕本身含有的芥子酶由于受其含量、活性等因素的影响不能够满足GSLs在短时间内大量水解的需求，通过外源添加芥子酶能显著促进GSLs在短时间内大量水解、释放ITCs而增强生物熏蒸效果。Omirou等在室内培养条件下，在1kg土壤中（含有1.5g 菜粕）添加活性单位为3U的植物源芥子酶制剂，使得菜粕中的GSLs在3天内水解率达100%，土壤中ITCs的浓度是对照的5-6倍，而对照GSLs在8天后水解率仍为40%。 可见，通过外源添加芥子酶能显著提高GSLs的降解率而增强杀菌效果。以上实验使用的芥子酶均为植物源芥子酶，且实验过程仅限于实验室内，均未解决田间应用的实际问题。

目前市售的芥子酶均从十字花科芸薹属植物中提取获得，提取步骤复杂，成本较高，致使芥子酶价格昂贵。首先，植物原料来源困难，在耕地面积紧张、集约化程度高的国家和地区，花费2-3个月时间种植作物用来提取芥子酶难度很大；其次，植物生长地域、季节和气候等因素直接影响其体内酶的生成量，使得酶提取的产量和质量都不稳定；另外，复杂的提取工艺及提取芥子酶后产生的下脚料处置困难也是限制该方法的重要瓶颈。而利用微生物发酵生产芥子酶可满足任何规模、任何时间的需求，产率高、质量稳定，具有巨大优势。

关于微生物源芥子酶，国外开展了以下研究：Ohtsuru 筛选获得能产生胞内芥子酶的黑曲霉菌株，并进行酶的分离纯化、酶学特性及影响酶活性的因子研究，但没有具体应用;Tani 对阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）产生的芥子酶进行了分离纯化和酶学特性研究。Palop 报道敏捷乳酸菌（Lactobacillus agilis）通过产生芥子酶促进GSL分解生成甲基ITC。Rakariyatham先后筛选获得多株产芥子酶的曲霉属和尖孢镰刀菌属的真菌，通过紫外诱变获得芥子酶产量提高3.5倍的高产菌株 。Ishimoto 分离到一株镰刀菌菌株Ls-F-in-4-1（Fusarium spp），该菌株产生的芥子酶将GSLs分解产生苯甲基ITCs，从而有效防控由终极腐霉（ Pythium ultimum）引起的豌豆土传病害的发生。国内仅有吴宏伟等研究从米曲霉培养物中分离到芥子酶，但没有进一步的研究报道。申请人于2012年3月15日向国家知识产权局提交了名称为产芥子酶的深绿木霉菌株及其应用的发明专利申请，申请号为201210068201.6，首次提及通过深绿木霉菌株提取芥子酶，目前，国内外还没有利用深绿木霉生产的芥子酶应用于田间提高菜粕类有机肥抑菌防病功能的报道。

 发明内容

本发明的目的在于：一方面，在每年数百万吨的菜粕中，仅有约1/3的菜粕经处理后以较低的比例添加到饲料中，大量的菜粕尤其是硫代葡萄糖苷含量高的菜粕至今没有技术可操作、经济可行的利用途径，大部分菜粕仍作为普通有机肥粗放施入到土壤中，远远没有发挥其应有的功效。另一方面，菜粕在田间状态下，GSLs水解率仍然低下，没有充分发挥其对土壤中有害生物的杀生效果等一系列问题，提出了一种在田间通过芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种在田间通过芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，是通过芥子酶制剂促进菜粕中硫代葡萄糖苷快速降解，释放异硫氰酸酯进而发挥抑菌防病的药效，其特征在于：土壤温度在15℃以上，将田块中前茬作物产生的残体清除干净，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜粕均匀洒入田间，菜粕用量为200-400公斤/亩，再将芥子酶制剂均匀洒入田间，芥子酶制剂用量为1-1.5公斤/亩，再将土壤旋耕、浇水,使得土壤水分含量为田间最大持水量的60-70%,并覆盖塑料薄膜,土温高于25℃时，覆膜持续时间为15-20天，土温低于25℃时，覆膜持续时间为20-30天,然后揭膜通气2-3天，即可提高菜粕抑菌防病药效。

在本发明中，所用菜粕的硫代葡萄糖苷含量至少为40μmol/g，芥子酶制剂中芥子酶活性为100-200U/g。

在本发明中，所述的芥子酶制剂由深绿木霉液体纯培养获得，具体方法为对深绿木霉进行纯培养，获得液体纯培养物，将液体纯培养物过四层纱布，收集纱布上的菌丝，将菌丝经超声波破碎后静置、离心，收集上清液即获得芥子酶液，将芥子酶液用载体吸附后，自然晾干或30℃烘干后即为芥子酶制剂。

在本发明中，将对深绿木霉进行纯培养，获得液体纯培养物是指：将深绿木霉接种到试管斜面培养基中进行活化培养，再将斜面培养好的菌株接种到对应的容量为250ml且装有80ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转速160-180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养24-36小时，然后再以体积比5-10%的接种量分别接入到容量为2000ml且装有800ml液体生产培养基的大三角瓶中，将大三角瓶置于转速180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养72-96小时，当液体培养物刚开始出现黄颜色时结束培养，获得深绿木霉液体纯培养物；

所述的试管斜面培养基为PDA培养基，配制方法为：马铃薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，琼脂15-20克，水1000毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000毫升，121℃高压灭菌20min；

所述的液体种子培养基和液体生产培养基为：燕麦20 g , FeSO₄·7H₂O 0.001g, MnCl₂·4H₂O 0.001g,ZnSO₄·7H₂O 0.001g，溶解在1000毫升水中，121℃高压灭菌25min。

在本发明中，将菌丝经超声波破碎后静置、离心，收集上清液即获得芥子酶液是指：将从纱布上收集的菌丝与PH7.0的磷酸缓冲液以重量比1：5均匀混合，在功率为200W超声波破碎仪中破碎10分钟 ，然后将破碎好的菌丝液置于4℃冰箱中放置1小时，然后在4℃，4000  r/min离心15 min，取离心后上清液即为芥子酶液；

 PH7.0的磷酸缓冲液是指：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠3.58g溶解在1000毫升水中；

在本发明中，将芥子酶液用载体吸附所用的载体为过60目筛的草炭粉，该草炭粉经121℃，灭菌40分钟后使用，芥子酶液与草炭粉的混合比例为体积比1：8-1：10 ，混合后的混合物自然风干或30℃烘干后过40目筛，即获得芥子酶制剂。

本发明的优点在于：首先，本发明以常见、容易获得的菜粕为使用的主体原料，通过外源添加芥子酶并采用简单的方法调控土壤条件，创造促进菜粕中硫代葡萄糖苷快速降解释放杀生气体的环境条件，达到杀灭或抑制土壤中有害生物的目的；另外，该方法不但提高了菜粕的杀菌、防病功效，充分发挥了菜粕的“药效”，而且经过土壤覆盖和适宜的保湿过程，也加快了菜粕中有机大分子物质的矿化过程、促进菜粕的降解和养分转化，提高其肥料有效性，增强土壤的肥力并同时增加了土壤中微生物的数量、活性和生物多样性，也间接起到了抑制病原菌生长的作用。整个施用过程简单，易于操作；施用后能显著改良土壤质量、平衡土壤养分及丰富土壤微生物的种群结构，发挥对作物促生、防病的效果，从而减少化肥、农药的使用量，为资源循环利用、环境保护及农产品的安全生产开辟新的思路。

我们对来自江苏、山东、安徽、江西、湖北、四川、陕西、甘肃等十多个省的菜粕，开展了对常见植物病原菌的生长抑制作用和对农作物病害的防控效果研究，研究发现90%以上的菜粕对病原菌的菌丝和分生孢子或者菌核有30-100%的生长抑制作用，对辣椒、番茄等土传病害的防控效果可达60-100%，但要使其发挥防病功效，对菜粕施用时的菜粕颗粒大小、芥子酶含量、土壤疏松情况、土壤水分含量、土壤温度及土壤覆盖状况等均有一定要求。

试验表明，菜粕施入土壤后，外源添加芥子酶并调节土壤到合适的水分含量，然后覆盖塑料薄膜维持土壤湿度，可以显著提高菜粕对病原菌的生长抑制效果。不但为大量菜粕的高效利用开辟了新途径，实现了农业废弃物的高端循环利用，而且对设施栽培土壤性状改良、土传病害防控及设施土壤的可持续利用和设施农业的持续发展具有重大意义 

具体实施方式

实施例1

本实施例中采用的深绿木霉是本案申请人在中国微生物菌种保藏中心登记保藏的深绿木霉，其保藏号为：CGMCC NO.5609，该深绿木霉已经通过201210068201.6的中国发明专利申请案为向公众公开。

深绿木霉培养基的配制

试管斜面培养基的配制：马铃薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，琼脂15-20克，水1000毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至1000毫升，适当冷却到60℃左右分装到试管中，装量为试管高度的1/5-1/6，用试管塞塞好试管口，121℃高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用，斜面高度不超过试管高度的1/3。

液体种子培养基和液体生产培养基的配制：分别称取燕麦20 g , FeSO₄·7H₂O 0.001g, MnCl₂·4H₂O 0.001g,ZnSO₄·7H₂O 0.001g，溶解在1000毫升水中，然后分装，装液量为80ml /250ml、 800ml/2000ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。

实施例2：

芥子酶制剂的制备

将实施例1中深绿木霉保藏菌种接种到试管斜面培养基中进行试管斜面活化，然后，用接种环将活化好的菌种接种到装有80ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，将三角瓶置于摇床培养24小时，摇床的转速160r/min，培养温度为28±2℃；结束后以5%接种量（V/V）接入装有800ml液体生产培养基的2000ml三角瓶中，将三角瓶置于摇床培养，摇床的转速180r/min，培养温度为28±2℃，培养3-4天当液体培养物开始变黄时即可结束培养；将液体培养物经四层纱布过滤，收集纱布上的菌丝，将菌丝与PH7的磷酸缓冲液一重量比1：5均匀混合后经200W功率超声波破碎10分钟，4℃放置1小时后再在4℃，4000 r/min离心15分钟，收集上清液即为芥子酶液，将芥子酶液与过60目筛且高温灭过菌的草炭粉以体积比1：8-1：10混合，混合后的混合物自然风干或30℃烘干后过40目筛，即获得芥子酶制剂，制剂中芥子酶活力为100-200U/g。

实施例3

菜粕对植物病原真菌菌丝和孢子或菌核的生长抑制作用

所有参加试验的病原真菌都可以从中科院微生物菌种保藏中心获得。将所有参加试验的病原真菌接种到PDA平板中，28-30℃培养5天后用打孔器打孔获得直径4毫米的菌丝块备用。

菜粕中挥发性分解产物对植物病原真菌菌丝的生长抑制作用： 在培养皿（直径8.5cm,高1.3cm）中倒入 PDA 培养基，放至常温时接种直径为5 mm菌碟；往培养皿皿盖中央加入0.2g，0.4g，0.6g，0.8g，1.0g，1.2g过2mm筛的菜粕粉末，以菜粕：水=1:5的比例加入灭菌水充分混合，对照仅加入灭菌水6mL，重复3次。然后将接种了微生物的那一半培养皿倒扣在培养皿盖子上， 用封口膜密封，28℃恒温培养。分别在12h后测量瓜果腐霉的菌落直径，24h后测量立枯丝核菌菌落直径，72h后测量其余四种病原真菌的菌落直径，每处理重复 3次。计算各化合物对菌丝生长的抑制率，抑制率 (% ) = [ (对照菌落增长直径-处理菌落增长直径 ) / (对照菌落增长直径 ) ] × 100%。

菜粕中非挥发性分解产物对植物病原真菌菌丝的生长抑制作用：称取菜粕粉末放入250mL三角瓶中，加入100mL无菌水。分别加入2g，6g，10g，14g菜粕。对照的试管中只加无菌水。45℃振荡12h，12000r/min离心20min,取上清液于超净工作台上用孔径为0. 22μm微孔滤膜过滤。取1mL滤液添加到5mL40℃熔融的 PDA 培养基中混匀，平铺于直径5cm的培养皿中，至常温时接种直径为5mm的菌块，用封口膜密封，28℃倒置培养。测量菌斑直径，计算抑制率，方法同上，实验结果见表1。

表 1菜粕分解产物对植物病原真菌的菌丝生长的抑制作用

病原菌	EC50V（g/L）	EC50nv（g/L）
			黄瓜立枯丝核菌	6.70±0.009 bc	0.326±0.028 b
西瓜枯萎病菌	6.30±0.066 c	0.145±0.005 b
			辣椒疫霉菌	7.63±0.316 ab	7.171±0.261 a
瓜果腐霉菌	8.78±0.720 a	0.221±0.011 b
			黄瓜黑星病菌	4.76±0.357 d	0.103±0.008 b
油菜菌核病菌	1.54±0.179 e	0.068±0.007 b

注：EC_50V菜粕挥发性分解产物抑制菌丝生长50%的浓度，单位g/L（挥发空间）。EC_50 nv菜粕非挥发性分解产物抑制菌丝生长50%的浓度，单位g/L（培养基）。不同字母表示不同处理之间有显著差异( P = 0. 05)。

结果表明： 菜粕的挥发性和非挥发性分解产物对辣椒土传病原菌的菌丝生长均具有抑制作用，菜粕挥发性分解产物对6种病原菌的抑制作用差异达显著水平，而非挥发性分解产物对6种病原菌的抑制作用差异不显著，对辣椒疫霉菌的抑制作用最弱。而且两大类分解产物都是对油菜菌核病菌的抑制作用最强，其次是对黄瓜黑星病菌。由 EC₅₀值可以看出，菜粕所产生的挥发性物质对油菜菌核病菌的生长抑制作用最大，其次是对黄瓜黑星病菌。

实施例 4  菜粕施入土壤中对辣椒病原菌菌丝生长的抑制效果

将菜粕分别以不同用量0.2%（w/w）、0.25%（w/w）、0.3%（w/w）、0.4%（w/w）添加到800g新鲜菜园土中，混合均匀后，加入蒸馏水，保持土壤水分含量为最大持水量的70%。将菜园土装入口径为15cm的干燥器中，将3根直径为8mm的空心的塑料管呈三角形分布插入土中，支撑起干燥器中的圆盘状平台。分别将接种了病原菌的菌丝块（5mm）、直径为5.5cm的PDA平板（不盖培养皿皿盖）放置在干燥器中的平台上。将干燥器的盖子和接缝处涂上凡士林进行密封。设置两个对照：空白对照，菜园土不加菜粕；化学熏蒸对照，菜园土中添加棉隆（即98%棉隆微粒剂，用量为45kg/ha）。密封好干燥器后，将其放置于35℃培养箱中，3d后打开干燥器，取出培养皿，测量菌落的直径，计算抑制率，计算公式同实施例3，实验结果见表2。

表2   不同用量菜粕对植物病原菌菌丝生长的抑制作用

结果显示：土壤中添加菜粕后对辣椒病原菌菌丝生长有强烈的抑制作用，且随着用量的增加，抑制效果越明显 。400kg/亩菜粕用量的条件下，除对瓜果腐霉的抑制率为78.18%，对其余5种病原菌的抑制率都达到100%，与棉隆化学熏蒸达到相同的效果。但相同菜粕用量下对不同的病原菌的抑制作用不同。

实施例5 

不同土壤水分含量下，施用菜粕对植物病原菌的生长抑制作用 

在干燥器内模拟田间状态，菜粕的施用方法同实施例4，菜粕用量0.25%（w/w），设置不同的土壤含水量分别为田间最大持水量的50%、60%、70%、80%、90%，放置于35℃的培养箱培养3d后测量菌落直径，计算抑制率，计算公式同实施例3，实验结果见表3。

表3  不同土壤水分含量对菜粕抑菌作用的影响

表3的结果可以得出，综合对6种病原菌的抑制效果,可以看出土壤持水量70%时菜粕对辣椒植物病原菌菌丝生长的抑制作用最强。土壤水分含量低于70%时,抑制作用随着土壤水分含量的降低而减弱,而随着土壤持水量增高至80%、90%，对菌丝生长的抑制作用也逐渐降低。可见土壤适当的水分含量对于菜粕发挥抑菌功能有着较大的增效作用。 

实施例6 田间施用芥子酶制剂对菜粕抑制病原菌生长的增强效果

实验在蔬菜大棚中进行，大棚土壤中人工接种辣椒疫霉,接种浓度为1000个孢子/克土, 土壤温度20-25℃,试验设以下处理：1）对照，即不施用菜粕和芥子酶制剂；2）只施用芥子酶制剂；3）只施用菜粕；4）菜粕+芥子酶制剂处理。土壤中菜粕用量400公斤/亩，芥子酶制剂（由实施例2提供）用量1.5公斤/亩,每个小区面积20平方米,每处理3个重复，实验中将对应的菜粕或芥子酶制剂或菜粕和芥子酶制剂洒入田间（对照组不洒），旋耕浇水，使土壤水分含量为田间最大持水量的70%。土壤覆盖塑料薄膜20天后，揭膜晾晒2天后，采集30厘米深的土样，测定土壤中辣椒疫霉的数量。结果如表4。

表4  添加芥子酶制剂对菜粕抑制辣椒疫霉的增强效果

由表4可见，在土壤中添加芥子酶制剂后，硫代葡萄糖苷的降解率从30%提高到86.2，明显；添加芥子酶的处理中，病原菌的数量是不加芥子酶处理的1/3， 表明土壤添加芥子酶后提高了硫代葡萄糖苷降解率的同时显著增加了对辣椒疫霉的生长抑制效果。

Claims (6)

1.一种在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，是通过芥子酶制剂促进菜粕中硫代葡萄糖苷快速降解，释放异硫氰酸酯进而发挥抑菌防病的药效，其特征在于：土壤温度在15℃以上，将田块中前茬作物产生的残体清除干净，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜粕均匀洒入田间，菜粕用量为200-400公斤/亩，再将芥子酶制剂均匀洒入田间，芥子酶制剂用量为1-1.5公斤/亩，再将土壤旋耕、浇水,使得土壤水分含量为田间最大持水量的60-70%,并覆盖塑料薄膜,土温高于25℃时，覆膜，时间为15-20天，土温低于25℃时，覆膜时间为20-30天,然后揭膜通气2-3天，即可提高菜粕抑菌防病药效。

2.根据权利要求1所述的在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，其特征在于：所用菜粕的硫代葡萄糖苷含量至少为40μmol/g，芥子酶制剂中芥子酶活性为100-200U/g。

3.根据权利要求1或2所述的在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，其特征在于：所述的芥子酶制剂由深绿木霉液体纯培养获得，具体方法为对深绿木霉进行纯培养，获得液体纯培养物，将液体纯培养物过四层纱布，收集纱布上的菌丝，将菌丝经超声波破碎后静置、离心，收集上清液即获得芥子酶液，将芥子酶液用载体吸附后，自然晾干或30℃烘干后即为芥子酶制剂。

4.根据权利要求3所述的在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，其特征在于：将对深绿木霉进行纯培养，获得液体纯培养物是指：将深绿木霉接种到试管斜面培养基中进行活化培养，再将斜面培养好的菌株接种到对应的容量为250ml且装有80ml液体种子培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转速160-180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养24-36小时，然后再以体积比5-10%的接种量分别接入到容量为2000ml且装有800ml液体生产培养基的大三角瓶中，将大三角瓶置于转速180r/min、温度为28±2℃的摇床上培养72-96小时，当液体培养物刚开始出现黄颜色时结束培养，获得深绿木霉液体纯培养物；

所述的试管斜面培养基为PDA培养基，配制方法为：马铃薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，琼脂15-20克，水1000毫升，pH自然，马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000毫升，121℃高压灭菌20min；

所述的液体种子培养基和液体生产培养基为：燕麦20 g , FeSO₄·7H₂O 0.001g, MnCl₂·4H₂O 0.001g,ZnSO₄·7H₂O 0.001g，溶解在1000毫升水中，121℃高压灭菌25min。

5.根据权利要求3所述的在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，其特征在于：将菌丝经超声波破碎后静置、离心，收集上清液即获得芥子酶液是指：将从纱布上收集的菌丝与PH7.0的磷酸缓冲液以重量比1：5均匀混合，在功率为200W超声波破碎仪中破碎10分钟 ，然后将破碎好的菌丝液置于4℃冰箱中放置1小时，然后在4℃，4000  r/min离心15 min，取离心后的上清液即为芥子酶液；

 PH7.0的磷酸缓冲液是指：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠3.58g溶解在1000毫升水中。

6.根据权利要求3所述的在田间施用芥子酶制剂提高菜粕抑菌防病药效的方法，其特征在于：将芥子酶液用载体吸附所用的载体为过60目筛的草炭粉，该草炭粉经121℃，灭菌40分钟后使用，芥子酶液与草炭粉的混合比例为体积比1：8-1：10 ，混合后的混合物自然风干或30℃烘干后过40目筛，即获得芥子酶制剂。