CN102971430A - 与在压缩式发动机中的应用相关的方法、生物油、生物燃料、装置和生物体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在压缩式发动机中使用的方法、生物油、生物燃料、装置和/或生物体。生产生物油的方法包括生产生物体并使所述生物体消耗原料。所述生物体包含含有脂肪酸的脂类。所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：A）至少约115克/升的细胞密度；B）至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；C）至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；D）消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；E）至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；F）至少约50%的基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；和/或G）消耗的每克氧产生大于约0.4克脂肪酸的脂肪酸对氧的得率。
Description
联合研究协议参与方的名称
根据35U.S.C.§103(c)(2)，BP Biofuels UK Limited与MartekBiosciences Corporation之间于2008年12月18日签订了生物燃料领域的联合研究协议。同样根据35U.S.C.§103(c)(2)，BP Biofuels UKLimited与Martek Biosciences Corporation之间于2009年8月7日签订了生物燃料领域的联合研究协议。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2010年3月11日提交的美国临时专利申请No.61/313,055的权益。美国临时申请No.61/313,055的全部公开内容在此通过参考以其全文结合于本说明书中。
技术领域
本发明涉及适合用于压缩式发动机的方法、生物油、生物燃料、装置和/或生物体。
背景技术
温室气体水平和气候变化的问题导致开发了设法利用固定碳与释放的二氧化碳之间的自然循环的技术。随着这些技术的进步，已开发了将原料转化成生物燃料的各种技术。然而，尽管取得了上述技术进步，但对于提高可再生碳源向燃料转化的经济可行性，仍存在需求和渴望。
发明内容
本发明涉及适合用于压缩式发动机的方法、生物油、生物燃料、装置和/或生物体。本发明的方法提供了可再生碳源向燃料的经济转化。具体来说，本发明包括通过使用生物体生产生物油，将含糖的碳源例如甘蔗的粗提物转变成生物柴油。
根据某些实施方案，本发明涉及生产含有脂肪酸的生物油的方法。所述方法包括生产和/或生长生物体，其中所述生物体包含脂肪酸。生产和/或生长可以同时和/或相继完成。所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：A）至少约115克/升的细胞密度；B）至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；C）至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；D）消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；E）至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；F）至少约50%的基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；和/或G）以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，本发明涉及生产含有脂肪酸的生物油的方法。所述方法包括生产和/或生长生物体，其中所述生物体包含脂肪酸。生产和/或生长可以同时和/或相继完成。所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：至少约115克/升的细胞密度；至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；和/或以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述生物体满足或超过至少三项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述生物体满足或超过至少四项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述生物体满足或超过至少五项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述生物体消耗原料，其中所述原料包括蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘油、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖或其组合。
根据某些实施方案，所述原料包括木质纤维素衍生的材料。
根据某些实施方案，所述生物体包括红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、Pseudozyma、银耳属（Tremella）、红酵母属（Rhodotorula）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、黑粉菌属（Ustilago）、隐球酵母属（Cryptococcus）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、假丝酵母属（Candida）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述生物体包括裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶藻属（Ulkenia）、小球藻属（Chlorella）、原壁菌属（Prototheca）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述生物体包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludgenum、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、Rhodotorula hordea、赤色酵母（Sporobolomyces ruberrimus）、银耳属菌种（Tremella sp.）、黑粉菌属菌种（Ustilago sp.）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、Rhodotorula ingenosa、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Leucosporidium scottii、Pseudozymaantarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum）、Rhodotorulamuscorum、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidiumdiobovatum）、原壳小球藻（Chlorella protothecoides）或其组合。
根据某些实施方案，所述脂肪酸包含基于质量少于约1%的具有4个或更多个双键的脂肪酸。
根据某些实施方案，所述脂肪酸包含基于质量少于约35%的饱和脂肪酸。
根据某些实施方案，所述脂肪酸包括与油菜籽至少基本上相似的分布情况。
根据某些实施方案，所述消耗和生产发生在至少约20℃的温度下。
根据某些实施方案，所述方法还包括从生物体提取脂肪酸，其中所述提取具有至少约85%的基于总脂肪酸含量的重量百分数的效率。
根据某些实施方案，所述提取包括使用乙醇、己烷、醇或其组合进行溶剂提取。
根据某些实施方案，所述脂肪酸生产率满足或超过至少约30克/升/天，并且所述脂肪酸得率满足或超过消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸。
根据某些实施方案，所述24小时峰值脂肪酸生产率满足或超过至少约50克/升/天。
根据某些实施方案，6小时峰值脂肪酸生产率满足或超过至少约70克/升/天。
根据某些实施方案，所述消耗和生产在氮限制条件下发生。
根据某些实施方案，所述原料包含至少一种有机酸。
根据某些实施方案，所述消耗和生产在约8或更低的pH下发生。
根据某些实施方案，所述方法还包括通过酯化、加氢或其组合将脂肪酸转变成生物燃料。
根据某些实施方案，本发明涉及通过本说明书中公开的任何方法、装置和/或生物体制备的含脂肪酸的生物油。
根据某些实施方案，本发明涉及从本说明书中公开的任何生物油制成的生物燃料。
根据某些实施方案，本发明涉及适合用于压缩式发动机的生物燃料。所述生物燃料包含的脂肪酸甲酯分布情况为基于总脂肪酸的重量百分数约50%至约70%的油酸，和/或基于总脂肪酸的重量百分数约15%至约35%的亚麻酸，其中所述生物燃料从微生物生产。
根据某些实施方案，所述脂肪酸甲酯分布情况源自于由来自原生藻菌界、真菌界的生物体或其组合产生的脂类。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的装置。所述装置包括原料流、与所述原料流相连的容器、配置在所述容器中的生物体以及与所述容器相连的含脂肪酸流。所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：A）至少约115克/升的细胞密度；B）至少约49%的基于干重的脂肪酸含量（细胞内和/或细胞外）；C）至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；D）消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；E）至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；F）至少约50%的基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；和/或G）以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的装置。所述装置包括原料流、与所述原料流相连的容器、配置在所述容器中的生物体以及与所述容器相连的含脂肪酸流。所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：至少约115克/升的细胞密度；至少约49%的基于干重的脂肪酸含量（细胞内和/或细胞外）；至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；和/或以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述装置中的生物体满足或超过至少三项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述装置中的生物体满足或超过至少四项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述装置中的生物体满足或超过至少五项所述度量标准。
根据某些实施方案，所述生物体包括来自于原生藻菌界、真菌界的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述容器以分批方式、连续方式或其组合来运行。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体。所述生物体包括至少约2.9的脂肪酸效率总指数1（OILE1）。OILE1被定义为：OILE1=C*D*F，其中C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体。所述生物体包括至少约4,958的脂肪酸效率总指数（OILE）。OILE被定义为：OILE=A*B*C*D*E*F*G，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；并且G=以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体。所述生物体包括至少约235的脂肪酸效率总指数2（OILE2）。OILE2被定义为：OILE2=A*B*C*D*F，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体。所述生物体包括至少约142的脂肪酸效率总指数4（OILE4）。OILE4被定义为：OILE4=A*B*C*D*F*G，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；并且G=以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括天然存在的生物体、遗传修饰的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体消耗碳原料，其中所述碳原料包含至少约10%的消耗的总氮。
根据某些实施方案，所述分离的生物体当在糖和甘油上生长时产生的脂肪酸与在主要为单独的糖上生长时相比，高出大于约50%。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体。所述生物体包括至少约4.4的脂肪酸效率总指数3（OILE3）。OILE3被定义为：OILE3=D*E*F，其中D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定脂肪酸效率总指数1（OILE1）为至少约2.9的生物体，以及分离所述生物体。OILE1被定义为：OILE1=C*D*F，其中C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定脂肪酸效率总指数（OILE）为至少约4,958的生物体，以及分离所述生物体。OILE被定义为：OILE=A*B*C*D*E*F*G，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；并且G=以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定脂肪酸效率总指数2（OILE2）为至少约235的生物体，以及分离所述生物体。OILE2被定义为：OILE2=A*B*C*D*F，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定脂肪酸效率总指数4（OILE4）为至少约142的生物体，以及分离所述生物体。OILE4被定义为：OILE4=A*B*C*D*F*G，其中A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；并且G=以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述鉴定的生物体包括天然存在的生物体、遗传修饰的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述鉴定的生物体消耗碳原料，其中所述碳原料包含至少约10%的消耗的总氮。
根据某些实施方案，所述鉴定的生物体当在糖和甘油上生长时产生的脂肪酸与在主要为单独的糖上生长时相比，高出大于约50%。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定脂肪酸效率总指数3（OILE3）为至少约4.4的生物体，以及分离所述生物体。OILE3被定义为：OILE3=D*E*F，其中D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，本发明涉及用于生产生物油的分离的生物体，其中所述生物体包括至少约5.1的脂肪酸效率总指数1（OILE1）。OILE1被定义为：OILE1=C*D*F，其中C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；并且F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
根据某些实施方案，所述分离的生物体具有至少约115克/升的细胞密度。
根据某些实施方案，所述分离的生物体具有至少约49%的基于干重的脂肪酸含量。
根据某些实施方案，所述分离的生物体具有至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率。
根据某些实施方案，所述分离的生物体具有消耗的每克氧产生大于约0.4克脂肪酸的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述分离的生物体是真菌、藻类和/或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、Pseudozyma、银耳属（Tremella）、红酵母属（Rhodotorula）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、黑粉菌属（Ustilago）、隐球酵母属（Cryptococcus）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、假丝酵母属（Candida）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶藻属（Ulkenia）、小球藻属（Chlorella）、原壁菌属（Prototheca）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、赤色酵母（Sporobolomycesruberrimus）、银耳属菌种（Tremella sp.）、黑粉菌属菌种（Ustilago sp.）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Leucosporidium scottii、Pseudozymaantarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum）、Rhodotorulamuscorum、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidiumdiobovatum）、原壳小球藻（Chlorella protothecoides）或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Rhodotorula ingenosa、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）或其组合。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括Pseudozyma aphidis。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括Pseudozyma rugulosa。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括Rhodotorula ingenosa。
根据某些实施方案，所述分离的生物体包括准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11615以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11615的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11615以及从其衍生的衍生株、变异株和/或突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11616以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11616的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11616以及从其衍生的衍生株、变异株和/或突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11617以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11617的鉴定特征。
根据某些实施方案，分离的生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11617以及从其衍生的衍生株、变异株和/或突变菌株的鉴定特征。
根据某些实施方案，所述分离的生物体具有至少约4,958的脂肪酸效率总指数（OILE）。其中OILE被定义为OILE=A*B*C*D*E*F*G，A=以克/升为单位的细胞密度；B=基于干重百分数的脂肪酸含量；C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；并且G=基于消耗的每克氧产生的总脂肪酸克数的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，本发明包括从本文公开的分离的生物体制备的含脂肪酸的生物油。
根据某些实施方案，本发明包括从本文公开的生物油制成的生物燃料。
根据某些实施方案，本发明包括通过生产包含脂肪酸的生物体并从生物体取出脂肪酸以形成生物油，来生产生物油的方法。其中所述生物体满足或超过至少两项度量标准。所述度量标准包括：至少约115克/升的细胞密度；至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；和/或消耗的每克氧产生大于约0.4克脂肪酸的脂肪酸对氧的得率。
根据某些实施方案，所述方法的生物体满足或超过至少另外一项上述的度量标准。
根据某些实施方案，所述方法的生物体满足或超过至少另外两项上述的度量标准。
根据某些实施方案，所述方法的生物体满足或超过至少另外三项上述的度量标准。
根据某些实施方案，所述方法的生物体包括红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、Pseudozyma、银耳属（Tremella）、红酵母属（Rhodotorula）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、黑粉菌属（Ustilago）、隐球酵母属（Cryptococcus）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、假丝酵母属（Candida）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述方法的生物体包括裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶藻属（Ulkenia）、小球藻属（Chlorella）、原壁菌属（Prototheca）的生物体或其组合。
根据某些实施方案，所述生物体包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、赤色酵母（Sporobolomycesruberrimus）、银耳属菌种（Tremella sp.）、黑粉菌属菌种（Ustilago sp.）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Leucosporidium scottii、Pseudozymaantarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum）、Rhodotorulamuscorum、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidiumdiobovatum）、原壳小球藻（Chlorella protothecoides）或其组合。
根据某些实施方案，所述方法的脂肪酸包含基于质量低于约1%的具有4个或更多个双键的脂肪酸。
根据某些实施方案，所述方法的脂肪酸包含基于质量低于约35%的饱和脂肪酸。
根据某些实施方案，6小时峰值脂肪酸生产率满足或超过至少约70克/升/天。
根据某些实施方案，所述方法包括消费原料，其中所述原料包含至少一种有机酸。
根据一个实施方案，所述包含脂肪酸的生物油通过本文公开的任何方法来制备。
根据一个实施方案，本发明包括从本文公开的任何生物油制成的生物燃料。
根据一个实施方案，本发明包括适合用于压缩式发动机的生物燃料。所述生物燃料包含的脂肪酸甲酯分布情况为基于总脂肪酸的重量百分数计约50%至约70%的油酸、基于总脂肪酸的重量百分数约15%至约35%的亚油酸、和基于总脂肪酸的重量百分数低于约10%的棕榈酸。其中所述生物燃料从产油微生物生产。
根据一个实施方案，所述脂肪酸甲酯分布情况源自于由来自原生藻菌界、真菌界的生物体或其组合产生的脂类。
根据某些实施方案，本发明涉及用生物燃料运行的发动机，所述生物燃料从本说明书中公开的任何生物油制成。
附图说明
合并在本说明书中并构成本说明书一部分的附图说明了本发明的实施方案，并与描述一起用于解释本发明的特点、优点和原理。在附图中：
图1示意性显示了某些实施方案的装置；
图2示意性显示了某些实施方案的两级装置；
图3示意性显示了某些实施方案的带有提取的装置；
图4示意性显示了某些实施方案的发酵罐；
图5显示了某些实施方案的时间对生物质的图；并且
图6显示了某些实施方案的时间对脂肪的图。
详细描述
本发明涉及适合用于压缩式发动机的方法、生物油、生物燃料、装置和/或分离的生物体。根据某些实施方案，本发明可以包括生物油的改进的生产。本发明还可以包括微生物脂类的生产和使用在那些脂类中包含的微生物脂肪酸来生产生物柴油。
根据某些实施方案，本发明包括开发用于以非常低的成本生产微生物油的技术，所述微生物油适用于生产生物柴油和/或营养学应用。使用针对微生物油生产问题的整体论方法，可以使微生物油的生产成本更低。主要集中于问题的单独一个或两个方面的努力，可能不能非常早地看出微生物油技术开发中待解决的关键障碍。
伴随着在微生物油方面的专业知识、对燃料的了解等，本发明可以包括靶向生产方法和/或模型。靶向生产方法能够鉴定出在生产非常低成本的微生物油的过程中需要克服的关键障碍。可以将信息用在多变量方法和/或分析中，以指导关键技术组分包括菌株分离、菌株开发、发酵设备设计、发酵运行模式、发酵策略等的发展。
根据某些实施方案，整体化方法产生利用复杂的低成本碳底物生产微生物油的方法和/或过程。分离和/或开发生物体菌株，以在靶向生产条件下在靶向底物上生长时产生具有所需脂肪酸分布的大量油。所述靶向生产条件包括高温、低氯化物水平等。生物体菌株能够使用靶向的低成本发酵设备生长，并利用低成本的提取技术从生物体菌株取出油。
整体化方法能够同时实现多个参数：与以前所实现的相比，1）更高的细胞浓度水平，2）更高的脂肪酸含量，3）消耗的每单位糖更好的脂肪酸得率，4）更高的脂肪酸生产率和/或5）生产每单位脂肪酸更低的需氧量。这5个关键参数和/或变量能够产生非常低成本的微生物油，例如适合用于生产生物柴油的微生物油。理想地，在有和/或没有政府授权和/或补贴的情况下，经济上可行的生物柴油能够与石油基柴油在成本上竞争。在性能标准例如十六烷、低温流动性质、云点、烟炱生成、颗粒物、硫含量、氮氧化物的生成等方面，生物柴油也能与石油基柴油竞争和/或超过石油基柴油。
整体化方法能够生产具有独特脂肪酸分布情况、例如类似油菜籽分布情况的微生物脂类。可以通过利用具有靶向属性的新分离菌株、鉴定关键发酵参数、确定提高脂肪酸生产的条件或工艺、有效利用来自于低成本底物或来源的碳和其他营养物、等等，来满足5个参数。整体化方法为微生物油的非常低成本生产解决了以前未纠正的关键问题，例如生物柴油的经济生产中涉及的关键问题。
整体化方法的实例可以包括但不限于下述项：（1）鉴定以前不知道是良好的产油型微生物的酵母的属或菌株，并且所述属和菌株能够在靶向底物例如蔗糖和木糖上生产油；（2）认识并解决与产油酵母和作为碳源的蔗糖或木糖的利用相关的问题；（3）通过增加发酵温度、降低pH和降低氮水平来显著提高脂肪酸对蔗糖的得率的能力。
例如，在氮限制条件（有利于油的生产）下，酵母可以减少和/或停止利用蔗糖（葡萄糖+果糖）的果糖部分。令人吃惊和出人意料的是，向发酵培养基添加甘油允许酵母开始利用来自于碳源例如蔗糖的果糖。类似地，增加发酵温度、降低pH和降低氮水平能够有利地降低生产成本，同时增加油的生产。在其他实施方案中，在油的生产期间，至少10%的总氮、至少约20%的总氮、至少约40%的总氮和/或至少约50%的总氮可以作为碳源原料的一部分供应给发酵。
图1示意性显示了某些实施方案的装置110。在图中，使用类似的参考数字指示相同或功能上相似的元件。每个参考数字最左侧的数字对应于参考数字第一次出现在其中的图。装置110包括容器112以及与容器112相连的原料流114和与容器112相连的脂类（脂肪酸）流116。原料流114向容器112提供原料，其中所述原料可以是在下面的原料定义中包含的任何材料和/或物质。容器112中存在的脂类通过脂类流116离开容器112，其中所述脂类可以是在下面的脂类定义中包含的任何物质。容器112包括或含有配置在容器112中的生物体118，其中所述生物体118可以是在下面的生物体定义中包含的任何物质。容器112包括或含有培养基120，例如发酵肉汤。生物体118可以在培养基120中。
图2示意性显示了某些实施方案的两级装置210。两级装置210包括容器212以及与容器212相连的原料流214和与容器212相连的脂类（脂肪酸）流216。原料流214向容器212提供原料，其中所述原料可以是在下面的原料定义中包含的任何材料和/或物质。容器212中存在的脂类通过脂类流216离开容器212，其中所述脂类可以是在下面的脂类定义中包含的任何物质。容器212包括或含有配置在容器212中的生物体218，其中所述生物体218可以是在下面的生物体定义中包含的任何物质。容器212包括或含有培养基220，例如发酵肉汤。生物体218可以在培养基220中。两级装置210包括生长容器222以及生长原料流225和将生长容器222与容器212相连的生物体流224。生长原料流225向生长容器222提供生长原料，其中所述生长原料可以是在原料流214中存在的相同原料。生物体流224将来自生长容器222的生物体218提供给容器212。
图3示意性显示了某些实施方案的带有提取的装置310。装置310包括容器312以及与容器312相连的原料流314和与容器312相连的脂类（脂肪酸）流316。原料流314向容器312提供原料，其中所述原料可以是在下面的原料定义中包含的任何材料和/或物质。容器312中存在的脂类通过脂类流316离开容器312，其中所述脂类可以是在下面的脂类定义中包含的任何物质。容器312包括或含有配置在容器312中的生物体318，其中所述生物体218可以是在下面的生物体定义中包含的任何物质。容器312包括或含有培养基320，例如发酵肉汤。生物体318可以在培养基320中。装置310包括提取装置326。脂类流316从容器312进料到提取装置326。提取装置326将脂类流316中存在的脂类从脂类流316内含物的剩余部分中取出，使得脂类产物流328离开提取装置326。脱脂化的生物质流330也离开提取装置326。
图4示意性显示了某些实施方案的发酵罐432。发酵罐432包括喷头434，例如用于将空气和/或其他气体导入过程中。发酵罐432包括搅拌器436，例如用于搅拌发酵罐432的内含物。在某些实施方案中，容器112、容器212或容器312可以是与发酵罐432类似的发酵罐。
根据某些实施方案，本发明可以包括生产生物油的方法。所述方法可以包括生产或生长生物体。所述方法可以包括满足或超过至少两项度量标准。所述生物体可以包含和/或具有含脂肪酸的脂类和/或大量含脂肪酸的脂类。在可选方案中，所述生物体能够分泌和/或排出生物油。所述度量标准可以包括：
A）至少约115克/升的细胞密度；
B）至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；
C）至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；
D）消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；
E）至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；
F）至少约50%的基于脂肪酸含量百分数的提取效率；和/或
G）以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
度量标准的任何适合的组合都可以满足所需的标准，例如：A和B；A和C；A和D；A和E；A和F；A和G；B和C；B和D；B和E；B和F；B和G；C和D；C和E；C和F；C和G；D和E；D和F；D和G；E和F；E和G；F和G；A、B和C；A、B和D；A、B和E；A、B和F；A、B和G；B、C和D；B、C和E；B、C和F；B、C和G；C、D和E；C、D和F；C、D和G；D、E和F；D、E和G；E、F和G；A、B、C和D；A、B、C和E；A、B、C和F；A、B、C和G；B、C、D和E；B、C、D和F；B、C、D和G；C、D、E和F；C、D、E和G；D、E、F和G；A、B、C、D和E；A、B、C、D和F；A、B、C、D和G；B、C、D、E和F；B、C、D、E和G；C、D、E、F和G；A、B、C、D、E和F；A、B、C、D、E和G；B、C、D、E、F和G；A、B、C、D、E、F和G；等等。
在可选方案中，所述方法可以包括消耗原料以生产生物体。
生产是指制备、形成、创造、塑造、产生、使达到存在、制造、生长、合成等。根据某些实施方案，生产包括发酵、细胞培养等。生产可以包括新的或附加的生物体，以及现有生物体的成熟。
生长是指例如通过将材料同化到活生物体中等等而实现的尺寸增加。
生物的是指生命系统、生活过程、活生物体等。生物的可以指来自古生菌、细菌和/或真核生物的生物体。生物的也可以指从生物有机体衍生和/或改性的化合物和/或材料。根据某些实施方案，生物的不包括化石和/或古代的材料，例如其生命在至少约1,000年以前结束的那些材料。
油是指至少略微疏水和/或防水的烃类物质和/或材料。油可以包括矿物油、有机油、合成油、精油等。矿物油是指石油和/或至少部分源自于地球和/或地下的相关物质，例如化石燃料。有机油是指至少部分源自于植物、动物、其他生物体等的材料和/或物质。合成油是指至少部分源自于化学反应和/或过程的材料和/或物质，例如可用于润滑油中。油可以至少大体上可溶于非极性溶剂和其他烃类，但至少大体上不溶于水和/或水性溶液。油可以至少约50%可溶于非极性溶剂，至少约75%可溶于非极性溶剂，至少约90%可溶于非极性溶剂，完全可溶于非极性溶剂，约50%可溶于非极性溶剂至约100%可溶于非极性溶剂，等等，所有百分数均基于质量。
脂类是指油、脂肪、蜡、油脂、胆固醇、甘油酯、甾类、磷脂、脑苷脂、脂肪酸、脂肪酸相关化合物、衍生化合物、其他油性物质等。脂类可以在活细胞中制备，并可以具有相对高的碳含量和相对高的氢含量以及相对较低的氧含量。脂类典型地包含例如基于质量的相对高的能量含量。
生物油是指至少部分源自于活生物体例如动物、植物、真菌、酵母、藻类、微藻、细菌等的烃类材料和/或物质。根据某些实施方案，生物油可以适合于用作和/或转变成可再生材料和/或生物燃料。
可再生材料是指至少部分源自于能够被自然生态循环和/或资源更替的来源和/或过程的物质和/或物品。可再生材料可以包括化学品、化学中间体、溶剂、单体、低聚物、聚合物、生物燃料、生物燃料中间体、生物汽油、生物汽油掺配油、生物柴油、绿色柴油、可再生柴油、生物柴油掺配油、生物馏分等。在某些实施方案中，可再生材料可以源自于活生物体，例如植物、藻类、细菌、真菌等。
生物燃料是指至少部分源自于可再生来源的适合用作燃料和/或燃烧源的组分和/或流。生物燃料能够被可持续地生产，和/或例如与化石燃料相比时具有降低的和/或没有向大气的净碳排放。根据某些实施方案，可再生来源可以排除从例如地下开采或钻出的材料。在某些实施方案中，可再生资源可以包括单细胞生物体、多细胞生物体、植物、真菌、细菌、藻类、栽培作物、非栽培作物、木材等。生物燃料可以适合于用作运输燃料，例如用于陆地交通工具、海上交通工具、空中交通工具等。生物燃料可适合用于产生能量，例如产生蒸汽、与适合的热交换介质交换能量、产生合成气、产生氢气、发电等。
生物柴油是指源自于可再生来源的适合于直接使用和/或掺混到柴油储库和/或十六烷供应中的组分或流。适合的生物柴油分子可以包括脂肪酸酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、脂类、脂肪醇、烷烃、石脑油、馏程材料、石蜡族材料、芳香族材料、脂族材料（直链、支链和/或环状）等。生物柴油可以用在压缩点火发动机例如汽车柴油内燃机、卡车重载柴油发动机等中。在可选方案中，生物柴油也可用于气体涡轮机、加热器、锅炉等中。根据某些实施方案，生物柴油和/或生物柴油掺混物满足或符合工业上接受的燃料标准例如B20、B40、B60、B80、B99.9、B100等。
生物馏分是指适合于直接使用和/或掺混到航空燃料（喷气）、润滑剂基础油、煤油燃料、燃料油等中的组分或流。生物馏分可以源自于可再生来源，并且具有任何适合的沸点范围，例如约100℃至约700℃、约150℃至约350℃的沸点范围等。
消耗是指用掉、利用、吃、吞食、转化等。根据某些实施方案，消耗可以包括在细胞代谢（分解代谢和/或合成代谢）、细胞呼吸（好氧和/或厌氧）、细胞繁殖、细胞生长、发酵、细胞培养等期间的过程和/或作为其一部分的过程。
原料是指用于供应、进料、提供等到例如生物体、机器、过程、生产车间等的材料和/或物质。原料可以包括用于转化、合成等的原材料。根据某些实施方案，原料可以包括适合于被生物体消耗的任何材料、化合物、物质等，例如糖、己糖、戊糖、单糖、二糖、三糖、多元醇（糖醇）、有机酸、淀粉、糖类等。根据某些实施方案，原料可以包括蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘油、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、其他五碳糖、其他六碳糖、其他十二碳糖、含糖的植物提取物、其他粗制糖等。原料可以指存在于原料中的一种或多种上面列出的有机化合物。
根据某些实施方案，方法和/或过程可以包括添加用于帮助和/或协助生物体的其他材料和/或物质，例如营养物、维生素、矿物质、金属、水等。其他添加剂的应用也在本发明的范围内，例如消泡剂、絮凝剂、乳化剂、破乳剂、增粘剂、降粘剂、表面活性剂、盐类、其他流体改性材料等。
有机的是指含碳化合物，例如碳水化合物、糖、酮、醛、醇、木质素、纤维素、半纤维素、果胶、其他含碳物质等。
根据某些实施方案，原料可以被进料到使用一种或多种进料的发酵中。在某些实施方案中，原料可以存在于在接种之前装入容器的培养基中。在某些实施方案中，除了装入容器的培养基之外，还可以通过一种或多种进料流添加原料。
根据某些实施方案，原料可以包括木质纤维素衍生的材料，例如至少部分源自于生物质和/或木质纤维素来源的材料。生物质是指至少部分源自于活生物体和/或最近活着的生物体、例如植物和/或木质纤维素来源的植物和/或动物材料和/或物质。生物质可以包含用于帮助和/或协助生物体的其他材料和/或物质，例如营养物、维生素、矿物质、金属、水等。
木质纤维素是指含有至少一些纤维素、半纤维素、木质素等。木质纤维素可以指植物和/或植物来源的材料。木质纤维素材料可以包括任何适合的材料，例如甘蔗、甘蔗渣、能源甘蔗、能源甘蔗渣、水稻、稻秆、谷物、谷物秸秆、小麦、麦秆、玉米、玉米秸秆、高梁、高粱秸秆、甜高粱、甜高粱秸秆、棉花、棉渣、木薯、甜菜、甜菜浆、大豆、油菜籽、麻风树、柳枝稷、芒草、其他草、木材、软木、硬木、树皮、废木材、锯末、纸、废纸、农业废物、粪便、粪肥、污水、都市固体废物、任何其他适合的生物质材料等。木质纤维素材料可以用任何适合的过程和/或方法进行预处理和/或处理，例如酸水解、中性水解、碱水解、热水解、催化水解、酶水解、氨纤维膨胀、蒸汽爆破等。
细胞培养是指最终电子受体是氧的糖类代谢，例如好氧代谢。细胞培养过程可以使用任何适合的生物体，例如细菌、真菌（包括酵母）、藻类等。适合的细胞培养过程可以包括天然存在的生物体和/或遗传修饰的生物体。
发酵是指最终电子受体不是氧的细胞培养和糖类代谢两者，例如厌氧代谢。发酵可以包括富含能量的化合物例如糖类向二氧化碳和醇、有机酸、脂类等的酶受控厌氧分解。在可选方案中，发酵是指无机或有机化合物的受控生物转化。发酵过程可以使用任何适合的生物体，例如细菌、真菌（包括酵母）、藻类等。适合的发酵过程可以包括天然存在的生物体和/或遗传修饰的生物体。
生物过程可以包括源自于活系统和/或过程的任何适合的活系统和/或项目。生物过程可以包括发酵、细胞培养、好氧呼吸、厌氧呼吸、分解代谢反应、合成代谢反应、生物转化、糖化、液化、水解、解聚、聚合等。
生物体是指互相依存和从属的元素的至少相对复杂的结构，所述元素的关系和/或性质主要可以由它们在整体中的功能来确定。生物体可以包括被设计成用功能分开但相互依赖的器官执行生命活动的个体。生物体可以包括例如能够生长、繁殖等的活体。
生物体可以包括任何适合的简单的（单）细胞生物、复杂的（多）细胞生物等。生物体可以包括藻类、真菌（包括酵母）、细菌等。生物体可以包括微生物例如细菌或原生动物。生物体可以包括一种或多种天然存在的生物体、一种或多种遗传修饰的生物体、天然存在的生物体与遗传修饰的生物体的组合等。使用多种不同生物体的组合的实施方案在本发明的范围之内。可以使用任何适合的组合或生物体，例如一种或多种生物体、至少约两种生物体、至少约五种生物体、约两种生物体至约20种生物体等。
产油的是指带有油、含有油和/或产生油、脂类、脂肪、和/或其他油状物质。产油的可以包括产生以重量计至少约20%的油、以重量计至少约30%的油、以重量计至少约40%的油、以重量计至少约50%的油、以重量计至少约60%的油、以重量计至少约70%的油、以重量计至少约80%的油等的生物体。
根据某些实施方案，生物体可以包括原生藻菌界的成员，例如破囊壶菌（thraustochytrid）和/或金藻。生物体可以属于裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶藻属（Ulkenia）等。
根据某些实施方案，生物体可以包括植物界的成员。生物体可以属于小球藻属（Chlorella）、原壁菌属（Prototheca）等。
在可选方案中，生物体可以是真菌界的单细胞成员，例如酵母。生物体可以属于红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、Pseudozyma、银耳属（Tremella）、红酵母属（Rhodotorula）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、黑粉菌属（Ustilago）、隐球酵母属（Cryptococcus）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、假丝酵母属（Candida）等。
根据某些实施方案，生物体可以包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale,Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、赤色酵母（Sporobolomycesruberrimus）、银耳属菌种（Tremella sp.）、黑粉菌属菌种（Ustilago sp.）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）包括CBS 6016、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）包括CBS 8587、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Leucosporidium scottii、Pseudozymaantarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum）、Rhodotorulamuscorum、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidiumdiobovatum）、原壳小球藻（Chlorella protothecoides）包括UTEX 250、等等。
根据利用蔗糖的某些实施方案，生物体可以包括Leucosporidiumscottii、Pseudozyma Antarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidiumsphaerocarpum）、Rhodotorula muscorum等。根据利用木糖的某些实施方案，生物体可以包括Leucosporidium scottii、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、Pseudozyma Antarctica、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Rhodotorula muscorum等。
生物体能够在任何适合的条件例如厌氧、好氧、光合异养等条件下运转、起作用和/或生活。
遗传工程是指有意操纵和/或改变生物体的至少一部分遗传密码和/或遗传密码的表达。
遗传修饰的是指已进行遗传工程改造的生物体、培养物、单细胞、生物群等。遗传修饰的生物体可以包括那些通过基因组诱变、添加和/或移除一个或多个基因、蛋白质的部分、启动子区、非编码区、染色体等进行操纵的生物体。
天然存在的是指至少大体上没有受到外力例如人类、机器等的干预行动的生物体、培养物、单细胞、生物群等。天然存在的生物体可以包括那些在局部环境（植物群和/或动物群）等中发现的生物体。天然存在的生物体可以被收集、分离、培养、纯化等。
根据某些实施方案，生物体可以包含这样的能力，即产生的脂肪酸为生物体干重的大于约25%、大于约50%、大于约75%、约100%、约45%至约90%等，并且当在木糖、蔗糖和/或甘油上生长时，与在主要为单独的葡萄糖上生长时相比，产生等同和/或更大量的生物质。
根据某些实施方案，当在主要为糖（例如蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖等）与甘油的组合上生长时，与在主要为单独的糖上生长时相比，生物体能够产生多出大于约25%、大于约50%、大于约75%、约100%、约25%至约100%等的脂肪酸。糖与甘油的比例可以是任何适合的量，例如基于质量、基于摩尔、基于体积等约100:1、约50:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:50、约1:100、约1-20:50-100等。
在某些实施方案中，生产生物体包括生物体含有脂肪酸的情况，和/或产生在例如一个或多个泡和/或囊中或泡和/或囊上含有脂肪酸的生物体。在可选方案中，脂肪酸可以相对不包含在细胞内和/或细胞外，例如相对不受约束性膜的控制。生产生物体可以包括细胞繁殖（更多细胞）和细胞生长（例如通过增加脂肪酸含量来增加细胞的大小和/或内含物）。繁殖和生长可以至少基本上彼此同时、至少基本上彼此排他、至少部分同时和至少部分排他地进行。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少基本上同时满足或超过至少两项或更多项上面列出的度量标准（A-G）。对于生物燃料而言，经济上可行的生物油方法可以与其他能源例如原油竞争。因此，几个因素可用于产生经济的过程。令人吃惊和出人意料的是，满足和/或超过至少两项度量标准的生物油生产方法，能够提供用于生物燃料的经济上可行的生物油。满足和/或超过更多（其他）度量标准可以产生更强有力的过程，经济上成功的可能性更高。不同的度量标准可以在某种程度上彼此竞争，使得一个度量标准的优化导致另一个度量标准降低的结果。然而，本发明的过程能够至少基本上同时（包括用在同一个总过程中）满足或超过采取任何组合的2、3、4、5、6和/或7项度量标准。
度量标准是指度量的标准和/或关键性能指标，例如有效性、利用、转化、生产、成功等的度量。
满足是指达到、获得、符合、等于等。
超过是指超出、超越等。根据某些实施方案，超过包括高于阈值量和/或数量至少2%。
度量标准A，即以克/升（发酵培养基或肉汤）度量的（生物体）细胞密度，度量和/或指示了生物体的生产率、发酵培养基（肉汤）的利用率、和/或发酵容器容积的利用率。细胞密度的增加可以导致产物得率增加和设备利用率增加（较低的资本成本）。一般来说，细胞密度的增加是有益的，但是过高的细胞密度可以引起较高的泵送成本（粘度增加）和/或移除热量方面的困难（较低的传热系数）等。
密度是指每单位体积的材料和/或物质的质量。细胞密度是指每单位体积的细胞质量，例如每单位体积的活细胞重量。它通常被表示为克干细胞/升。可以在方法中任何适合的时间点测量细胞密度，例如在开始发酵后、在发酵期间、在发酵完成后、在整个批次中等。
细胞密度度量标准可以包括任何适合的值，例如至少约50克干重/升、至少约100克干重/升、至少约115克干重/升、至少约125克干重/升、至少约150克干重/升、至少约175克干重/升、至少约200克干重/升、至少约250克干重/升、至少约350克干重/升、低于约400克干重/升、50克干重/升至350克干重/升、115克干重/升至200克干重/升等。
度量标准B，即以基于干重的百分数度量的脂肪酸含量，度量和/或指示了在生物体内包含的基于重量的脂肪酸的量。一般来说，较高的脂肪酸含量是理想的，并且能够提供从细胞材料的剩余物和/或残留物中更容易地提取和/或取出脂肪酸，以及原料和/或设备的更高的利用率和/或生产率。
含量是指包含的指定材料的量。干重基础是指至少基本上不含水。可以在方法中任何适合的时间点测量脂肪酸含量，例如在开始发酵后、在发酵期间、在发酵完成后、在整个批次中等。
脂肪酸含量度量标准可以包括任何适合的值，例如至少约25%的基于干重的脂肪酸、至少约49%的基于干重的脂肪酸、至少约55%的基于干重的脂肪酸、至少约60%的基于干重的脂肪酸、至少约70%的基于干重的脂肪酸、至少约80%的基于干重的脂肪酸、至少约90%的基于干重的脂肪酸、低于约100%的基于干重的脂肪酸、约25%的基于干重的脂肪酸至约90%的基于干重的脂肪酸、约49%的基于干重的脂肪酸至约70%的基于干重的脂肪酸等。
度量标准C，即以每天（24小时）流逝的发酵时间每升肉汤和/或发酵罐体积的脂肪酸克数度量的脂肪酸生产率，度量和/或指示了生产脂肪酸的转化速率和/或速度。一般来说，更高的脂肪酸生产率导致更经济的过程，因为更快速地制备产物（即减少循环次数）是理想的。
生产率是指生产和/或制备的品质和/或状态，例如每单位体积的速率。可以在方法中任何适合的时间点测量脂肪酸生产率，例如在开始发酵后、在发酵期间、在发酵完成后、在整个批次中等。可以在固定的时间测量生产率，例如每天中午至中午。在可选方案中，可以在适合的滚动基础上、例如在滚动任何24小时时间段的基础上测量生产率。用于测量生产率的其他基础也在本发明的范围内。
脂肪酸生产率度量标准可以包括任何适合的值，例如至少约5克脂肪酸/升/天、至少约10克脂肪酸/升/天、至少约15克脂肪酸/升/天、至少约20克脂肪酸/升/天、至少约25克脂肪酸/升/天、至少约30克脂肪酸/升/天、至少约40克脂肪酸/升/天、至少约50克脂肪酸/升/天、至少约60克/升/天、至少约70克脂肪酸/升/天、至少约80克脂肪酸/升/天、至少约90克脂肪酸/升/天、低于约100克脂肪酸/升/天、约5克脂肪酸/升/天至约90克脂肪酸/升/天、约10克脂肪酸/升/天至约70克脂肪酸/升/天、约15克脂肪酸/升/天至约90克脂肪酸/升/天等。
度量标准D，即以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数度量的脂肪酸得率，度量和/或指示了原料转变成产物的选择性。更高的脂肪酸得率一般是优选的，因为它指示碳从糖转化成脂肪酸而不是副产物和/或细胞物质。
得率是指产生和/或返回的量和/或数量。可以在方法中任何适合的时间点测量脂肪酸得率，例如在开始发酵后、在发酵期间、在发酵完成后、在整个批次中等。
脂肪酸得率度量标准可以包括任何适合的值，例如消耗的每克原料产生至少约0.1克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.15克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.2克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.225克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.25克脂肪酸、消耗的每克原料产生至少约0.3克脂肪酸、消耗的每克原料产生约0.1克脂肪酸至消耗的每克原料产生约0.2克脂肪酸、消耗的每克原料产生约0.2克脂肪酸和消耗的每克原料产生约0.35克脂肪酸、消耗的每克原料产生约0.175克脂肪酸至消耗的每克原料产生约0.225克脂肪酸等。
度量标准E，即以每天每升的脂肪酸克数度量的24小时峰值脂肪酸生产率，度量和/或指示了在24小时时间段内生产的脂肪酸的量和/或速率。
峰值脂肪酸生产率可以包括任何适合的值，例如至少约15克脂肪酸/升/天、至少约20克脂肪酸/升/天、至少约30克脂肪酸/升/天、至少约40克脂肪酸/升/天、至少约50克脂肪酸/升/天、至少约75克脂肪酸/升/天、至少约100克脂肪酸/升/天、至少约125克脂肪酸/升/天、低于约150克脂肪酸/升/天、约15克脂肪酸/升/天至约125克脂肪酸/升/天、约30克脂肪酸/升/天至约125克脂肪酸/升/天、约40克脂肪酸/升/天至约100克脂肪酸/升/天等。
度量标准F，即基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率，测量和/或指示了可作为产物获得的脂肪酸相对于生物体产生的总脂肪酸的回收量。
提取效率可以包括任何适合的值，例如总脂肪酸含量的至少约25%、总脂肪酸含量的至少约35%、总脂肪酸含量的至少约45%、总脂肪酸含量的至少约55%、总脂肪酸含量的至少约65%、总脂肪酸含量的至少约75%、总脂肪酸含量的至少约85%、总脂肪酸含量的至少约95%、低于总脂肪酸含量的约100%、总脂肪酸含量的约25%至总脂肪酸含量的约95%、总脂肪酸含量的约25%至总脂肪酸含量的约95%、总脂肪酸含量的约35%至总脂肪酸含量的约75%等。
提取效率可以基于任何适合数值的提取体积，例如至少约1升、至少约10升、至少约100升、至少约1,000升、小于约10,000升、约1升至约10,000升、约1升至约1,000升、约1升至约100升、约1升至约10升等。根据某些实施方案，对于提取效率而言的体积可以基于发酵肉汤的体积。
度量标准G，即用消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率，度量和/或指示了用于产生脂肪酸的氧的量和/或速率。较高的需氧量可以增加资本费用和/或运行费用。
脂肪酸对氧的得率可以包括任何适合的值，例如消耗的每克氧产生超过约0.4克脂肪酸、消耗的每克氧产生超过约0.5克脂肪酸、消耗的每克氧产生超过约0.6克脂肪酸、消耗的每克氧产生超过约0.7克脂肪酸、消耗的每克氧产生超过约0.8克脂肪酸、消耗的每克氧产生超过约0.9、低于约1.0克脂肪酸、消耗的每克氧产生约0.4克脂肪酸至消耗的每克氧产生约0.9克脂肪酸、消耗的每克氧产生约0.6克脂肪酸至消耗的每克氧产生约0.8克脂肪酸等。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少两项或更多项度量标准。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少三项或更多项度量标准。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少四项或更多项度量标准。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少五项或更多项度量标准。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少六项或更多项度量标准。
根据某些实施方案，所述方法可以包括至少大体上同时或在生产期间满足或超过至少七项度量标准。
所述方法还可以包括任何适合的其他行动，例如通过细胞裂解、施加压力、溶剂提取、蒸馏、离心、其他机械处理、其他热处理、其他化学处理等提取和/或取出含有脂肪酸的脂类。在可选方案中，生产生物体可以从生物体分泌和/或排出含有脂肪酸的脂类，而无需其他处理。
脂肪酸可以具有任何适合的、例如通常适合于生物燃料生产的分布情况和/或特征。根据某些实施方案，脂肪酸可以包含基于质量的合适的量和/或百分数的具有四个或更多个双键的脂肪酸。在可选方案中，脂肪酸可以包含适合量和/或百分数的具有三个或更多个双键、具有两个或更多个双键、具有一个或多个双键等的脂肪酸。
双键的适合的量可以是低于总脂肪酸的约25重量%、低于总脂肪酸的约15重量%、低于总脂肪酸的约10重量%、低于总脂肪酸的约5重量%、低于总脂肪酸的约3重量%、低于总脂肪酸的约2重量%、低于总脂肪酸的约1重量%、低于总脂肪酸的约0.5重量%、低于总脂肪酸的约0.1重量%、总脂肪酸的至少约5重量%、总脂肪酸的约25重量%至总脂肪酸的约0.1重量%、总脂肪酸的约10重量%至总脂肪酸的约5重量%等。
脂肪酸是指饱和和/或不饱和单羧酸，例如采取脂肪和脂肪油中的甘油酯的形式。甘油酯可以包括酰基甘油酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯等。
双键是指由分子中的两个原子共有的两对电子。
此外和/或可选的，得到的脂肪酸可以包含以总脂肪酸的重量百分数计至少约30%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约40%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约50%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约60%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约70%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约80%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约90%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计约30%的单不饱和脂肪酸至以总脂肪酸的重量百分数计约90%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约100%的单不饱和脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计约50%的单不饱和脂肪酸至以总脂肪酸的重量百分数计约70%的单不饱和脂肪酸等。单不饱和是指具有一个双键的分子。
根据某些实施方案，脂类可以包含基于总脂肪酸的质量的任何适合的量和/或百分数的饱和脂肪酸。饱和脂肪酸的适合的量和/或百分数可以包括以总脂肪酸的重量百分数计低于约5%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约10%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约20%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约25%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约30%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约35%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约40%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约50%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计低于约60%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计至少约1%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计约10%的总脂肪酸至以总脂肪酸的重量百分数计约60%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计约25%的总脂肪酸至以总脂肪酸的重量百分数计约40%的总脂肪酸、以总脂肪酸的重量百分数计约1%的总脂肪酸至以总脂肪酸的重量百分数计约10%的总脂肪酸等。饱和是指在原子（碳原子）之间不具有双键和/或叁键的化合物。
可以使用任何适合的方法例如酯化、转酯、加氢、裂化等，将生物油进一步加工成生物燃料。在可选方案中，生物油可以适合于直接用作生物燃料。酯化是指制备和/或形成酯，例如通过将酸与醇进行反应来形成酯。转酯是指将一种酯变成一种或多种不同的酯，例如通过醇与甘油三酯的反应来形成脂肪酸酯和甘油。加氢和/或加氢处理是指向分子添加氢以例如使材料饱和和/或还原的反应。
此外和/或可选地，得到的脂肪酸在转酯后可以具有任何适合的脂肪酸甲酯分布情况。所述分布情况（表示成总脂肪酸的重量百分数）可以包括约30%油酸至约90%油酸、约50%油酸至约70%油酸、约60%油酸等，全部均基于质量。分布情况可以包括约10%亚油酸至约70%亚油酸、约30%亚油酸至约50%亚油酸、约15%亚油酸至约35%亚油酸、约40%亚油酸等。
转酯可以包括使用任何适合的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。
根据某些实施方案，脂肪酸甲酯分布情况（表示成总脂肪酸的重量百分数）可以包括：约1%棕榈酸至约10%棕榈酸；约0.5%硬脂酸至约2.5%硬脂酸；约50%油酸至约70%油酸；约15%亚油酸至约35%亚油酸；和/或约6%亚麻酸至约12%亚麻酸。
根据某些实施方案，脂肪酸甲酯分布情况（表示成总脂肪酸的重量百分数）可以包括：约0%肉豆蔻酸至约1.5%肉豆蔻酸；约1%棕榈酸至约10%棕榈酸；约0.5%硬脂酸至约2.5%硬脂酸；约0%花生酸至约1.5%花生酸；约0%二十二烷酸至约1.5%二十二烷酸；约0%二十四烷酸至约2%二十四烷酸；约0%棕榈油酸至约1%棕榈油酸；约50%油酸至约70%油酸；约0%二十碳烯酸至约3%二十碳烯酸；约0%芥子酸至约5%芥子酸；约15%亚油酸至约35%亚油酸；和/或约6%亚麻酸至约12%亚麻酸。
具有不同脂肪酸酯分布情况的其他实施方案在本发明的范围内。
得到的生物燃料能够满足和/或超过国际标准EN 14214:2008（汽车燃料，用于柴油发动机的脂肪酸甲酯（FAME）（Automotive fuels,Fatty acid methyl esters(FAME)for diesel engines））和/或ASTMD6751-09（用于中间馏分燃料的生物柴油燃料掺配油（B100）的标准规格（Standard Specification for Biodiesel Fuel Blend Stock(B100)forMiddle Distillate Fuels））。EN 14214:2008和ASTM D6751-09两者的全部内容在此以其全文通过参考整合作为本说明书的一部分。
根据某些实施方案，脂肪酸可以包括与油菜籽中存在的脂肪酸至少基本上相似的分布情况。“基本上”是指主要为所指定或指明的内容。“相似”是指具有共同的特征，例如没有显著不同。“基本上相似”可以包括例如通过相关性分析进行测量时，至少约50%类似于油菜籽、至少约60%类似于菜籽、至少约70%类似于油菜籽、至少约80%类似于油菜籽、至少约90%类似于油菜籽、至少约95%类似于油菜籽、至少99%类似于油菜籽、低于约90%类似于油菜籽、约50%类似于油菜籽至约99%类似于油菜籽等的分布情况，全部都基于总脂肪酸的重量百分数。
生产细胞物质和/或生产含有脂肪酸的脂类可以在任何适合的条件下发生，例如至少约18℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、低于约100℃、约18℃至约50℃、约20℃至约30℃等的温度。在高温下运行能够提高得率、提高生产率、减少外来生物体的生长等。消耗和/或生产可以发生在相同温度和/或不同温度下。在消耗和/或生产期间具有温度瞬变（相对于时间的温度变化）的实施方案也在本发明的范围之内。
根据某些实施方案，所述方法和/或过程可以包括例如通过增添热量、冷却等进行的温度控制。热量可以由蒸汽、饱和流、过热流、热水、二醇、热传递油、热传递流体、其他过程流等供应。冷却可以由冷水、制冷剂、盐水、二醇、热传递流体、冷却剂、其他过程流等供应。温度控制可以使用任何适合的技术和/或构造，例如间接热交换、直接热交换、对流、传导、辐射等。
根据某些实施方案，所述方法可以包括从生物体提取脂肪酸，其中所述提取的效率为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、低于约100%、约70%至约95%、约80%至约95%等，全部基于总脂肪酸含量的百分数。
所述提取可以包括使用乙醇、己烷、其他醇、其他适合的溶剂（化学溶剂、物理溶剂、非极性溶剂、极性溶剂和/或超临界溶剂）等进行溶剂提取。
根据某些实施方案，生物体的脂肪酸生产率满足和/或超过至少约30克/升/天，和/或脂肪酸得率满足和/或超过原料中的每克碳产生至少约0.175克脂肪酸。
根据某些实施方案，24小时峰值脂肪酸生产率满足和/或超过至少约50克/升/天。
根据某些实施方案，6小时峰值脂肪酸生产率满足和/或超过至少约70克/升/天。
根据某些实施方案，消耗和/或生产在氮限制条件下发生。氮限制是指缺乏例如在细胞繁殖中使用的氮。在可选方案中，至少一部分消耗和/或生产在添加氮、例如来自于氨的氮的情况下发生。
根据某些实施方案，生产生物体和/或生产含脂肪酸的脂类在不依赖于糖发酵的情况下发生，例如在分开的容器中。在可选方案中，生产生物体和/或生产含脂肪酸的脂类至少在某种程度上与糖发酵同时和/或同时地发生，例如在相同容器中。
消耗和/或生产可以在任何适合的pH下发生，例如低于约3的pH、低于约5的pH、低于约6的pH、约7.0或更低的pH、约7的pH、至少约8的pH、至少约9的pH、至少约10的pH、约5至约9的pH、约6至约8的pH、约7至约8的pH等。在不同pH水平下运行能够抑制外来生物体的生长。抑制外来生物体的生长可以允许方法的运行能够在例如每批开始时不需独立的灭菌过程的情况下发生。在运行期间改变pH的实施方案也在本发明的范围之内。
灭菌会消耗能量、时间和/或其他资源。因此，在某些实施方案中，不使用灭菌过程，例如像上面所讨论的，当pH水平抑制外来生物体的生长时。在可选方案中，方法还可以包括灭菌过程，例如蒸到至少阈值温度并持续适合的时间长度。
根据某些实施方案，本发明可以包括降低用于生产油的发酵过程的能量成本和/或资本成本的方法，其中生物体的生长发生在最适于生长的温度下，而含有脂肪酸的脂类生产阶段发生在比最适生长温度高至少约2℃、至少约3℃、至少约4℃、至少约5℃、至少约7℃、少于约20℃、约2℃至约7℃、约4℃至约5℃等的温度下。
根据某些实施方案，本发明可以包括通过本说明书中公开的任何方法、装置和/或生物体制备的生物油。
根据某些实施方案，本发明可以包括从本说明书中公开的任何生物油制成的生物燃料。
根据某些实施方案，本发明可以包括适合用于压缩式发动机的生物燃料。生物燃料可以包括一定的脂肪酸甲酯分布情况。所述脂肪酸甲酯分布情况可以包括基于总脂肪酸的重量百分数约50%至约70%的油酸和/或基于总脂肪酸的重量百分数约15%至约35%的亚麻酸。
根据某些实施方案，脂肪酸甲酯分布情况源自于由来自原生藻菌界、真菌界等的生物体生产的脂肪酸。
根据某些实施方案，本发明可以包括用于生产生物油的装置。装置可以包括原料流、与原料流相连的容器、配置在容器内的生物体和/或与容器相连的脂类流。生物体可以满足和/或超过至少两项度量标准，其中所述度量标准包括：A）至少约115克/升的细胞密度；B）至少约49%的基于干重的脂肪酸含量；C）至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；D）消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；E）至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；F）至少约65%的基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率；和/或G）以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的至少约0.4的脂肪酸对氧的得率。
装置是指单个数量，其被视为用于执行一项或多项特定功能和/或结果等的器具的整体、一部分和/或复合体。
流是指物质和/或材料的流动和/或供应，例如稳定的连续体。流的流动可以是连续、离散、间歇、分批、半分批、半连续的、等等。
容器是指物质例如液体、气体、发酵肉汤等的贮器和/或储存器。容器可以包括任何适合的尺寸和/或形状，例如至少约1升、至少约1,000升、至少约100,000升、至少约1,000,000升、至少约1,000,000,000升、小于约1,000,000升、约1升至约1,000,000,000升等。容器可以包括罐、反应器、柱、槽、桶、盆等。容器可以包括任何适合的辅助设备，例如泵、搅拌器、通气设备、热交换器、盘管、夹套、加压系统（正压和/或真空）、控制系统等。
配置是指放置在位、放在位置中、准备就绪等。在容器的至少一部分内，生物体可以自由掺合到发酵肉汤中（悬浮），和/或固定在适合的培养基和/或表面上。生物体可以大体上比肉汤密度大（下沉）、大体上比肉汤轻（漂浮）、大体上相对于肉汤具有中间浮力等。
适合是指使适应于特定用途、目的等。
根据某些实施方案，配置在容器内的生物体可以包括来自于原生藻菌界、真菌界等的生物体。
根据某些实施方案，容器以分批方式、离散方式、半分批方式、半连续方式、连续方式等运行。串联和/或并联容器的组合也在本发明的范围之内。
根据某些实施方案，本发明可以包括用于生产生物油的分离的生物体，其中达到了一种或多种下列脂肪酸效率总指数，其中OILE、OILE1、OILE2、OILE3和OILE4可以被定义为：
OILE=A*B*C*D*E*F*G
OILE1=C*D*F
OILE2=A*B*C*D*F
OILE3=D*E*F
OILE4=A*B*C*D*F*G
其中：
A=以克/升为单位的细胞密度；
B=基于干重百分数的脂肪酸含量；
C=以克/升/天为单位的脂肪酸生产率；
D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数为单位的脂肪酸得率；
E=以克/升/天为单位的24小时峰值脂肪酸生产率；
F=基于脂肪酸含量百分数的提取效率；和/或
G=以消耗的每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率。
度量标准B和F以百分数度量。当计算OILE、OILE1、OILE2、OILE3和/或OILE4的值时，B和F的百分数作为小数（小于1.0）输入。
根据某些实施方案，本发明可以包括用于生产生物油的生物体的分离方法，所述方法包括鉴定其中达到了一个或多个上面讨论的脂肪酸效率总指数（OILE、OILE1、OILE2、OILE3和OILE4）的生物体，然后分离所述生物体。
根据某些实施方案，分离的生物体可以包括具有任何适合值的脂肪酸效率总指数（OILE），例如至少约811、至少约4,958、至少约20,292、至少约33,342、至少约53,000、约811至约53,000、约4,958至约53,000、约4,958至约20,292、约4,958至约33,342、约20,292至约53,000、约20,292至约33,342、约33,342至约53,000等。
根据某些实施方案，分离的生物体可以包括具有任何适合值的脂肪酸效率总指数1（OILE1），例如至少约1.5、至少约2.9、至少约5.1、至少约6.3、至少约7.6、约1.5至约7.6、约2.9至约7.6、约2.9至约6.3、约2.9至约5.1、约5.1至约7.6、约5.1至约6.3、约6.3至约7.6等。
根据某些实施方案，分离的生物体可以包括具有任何适合值的脂肪酸效率总指数2（OILE2），例如至少约73、至少约235、至少约593、至少约803、至少约1,000、约73至约1,000、约235至约1,000、约235至约803、约235至约593、约593至约1,000、约593至约803、约803至约1,000等。
根据某些实施方案，分离的生物体可以包括具有任何适合值的脂肪酸效率总指数3（OILE3），例如至少约2.2、至少约4.4、至少约7.6、至少约9.4、至少约11.4、约2.2至约11.4、约4.4至约11.4、约4.4至约9.4、约4.4至约7.6、约7.6至约11.4、约7.6至约9.4、约9.4至约11.4等。
根据某些实施方案，分离的生物体可以包括具有任何适合值的脂肪酸效率总指数4（OILE4），例如至少约32、至少约142、至少约457、至少约682、至少约990、约32至约990、约142至约990、约142至约682、约142至约457、约457至约990、约457至约682、约682至约990等。
根据某些实施方案，为OILE、OILE1、OILE2、OILE3或OILE4分离的生物体可以包括天然存在的生物体、遗传修饰的生物体等。
根据某些实施方案，本说明书中公开的任何方法、装置和/或生物体可以使用消耗碳原料的生物体，其中所述碳原料包含至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、约1%至约25%等的消耗的总氮，全部都基于质量。
具体实施方式
实施例1
测试了约1,500株微生物菌株的非光合脂肪酸生产能力。菌株是指具有推定的共同祖先，例如具有明确的生理差异但不一定具有形态差异的组和/或集合。所测试的生物体的菌株包括微藻、酵母和类似酵母的生物体。所测试的生物体包括天然存在的分离的生物体以及一些遗传修饰的生物体。测试检查了脂肪酸生产能力以及基于脂肪酸分布情况的潜在生物燃料特征。生物体根据满足上面讨论的关键性能度量标准进行筛选。第一判据是良好生长和高脂肪积累的潜能。第二判据是与油菜籽油相似的脂肪酸分布情况。
基于油菜籽油的脂肪酸分布情况（表示成总脂肪酸的重量百分数）的典型范围包括约1%至约10%的16:0、约0.5%至约2.5%的18:0、约50%至约70%的18:1、约15至约35%的18:2、约6%至约12%的18:3以及低于约1%的多不饱和脂肪酸，全部都基于质量。脂肪酸命名中的第一个数字表示分子中的碳原子数目，第二个数字表示分子中双键数目。
满足第一和第二判据的菌株当在筛选条件下在摇瓶中生长时，产生至少约8克/升的生物质干重，并且脂肪酸含量为干重的至少约35%。使用这些判据将约1,500株菌株缩小到154株菌株（“鉴定到的菌株”），用于其他测试。鉴定到的菌株具有5.6克/升至27.3克/升的生物质干重。鉴定到的菌株的脂肪酸含量为干重的15%至74%。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（表示成总脂肪酸的重量百分数）为0%至37%的14:0、11%至54%的16:0、0%至23%的16:1、1%至24%的18:0、0%至66%的18:1、0%至45%的18:2、0%至9%的18:3和0%至44%的多不饱和脂肪酸含量。
实施例2
在上述实施例1中鉴定的154株菌株被制备用于摇瓶试验。测试菌株在几种可能的培养基上生长的能力。所测试的培养基包括葡萄糖、蔗糖、甘油、果糖和/或木糖。培养基来源使用纯的糖源。为了进行这个实验，对标准培养基进行修改以消除有机碳例如酵母提取物和谷氨酸单钠。消除有机碳允许每种待测试菌株在指定底物上生长。
摇瓶准备有用于标准摇瓶培养基的不含酵母提取物的培养基。每种菌株的接种物在包含葡萄糖的标准摇瓶培养基中生长。0.5毫升的接种物用于接种49.5毫升实验培养基。对于每种菌株而言，使用六种不同类型的培养基。一种培养基类型对应于每种所测试的糖（葡萄糖、蔗糖、甘油、果糖、木糖），另一种不含有添加的有机碳的培养基作为对照，提供作为从接种物带入营养物的结果而发生的任何生长。每种菌株在摇瓶中在每种类型的培养基中在22.5℃和200转/分钟下生长7天。将每个摇瓶的内含物通过离心收获，洗涤，冷冻干燥并测定生物质的重量。对于产生的生物质干重超过1克/升的样品，通过脂肪酸甲酯（FAME）分析测定总脂肪含量。生物质重量低于1克/升的样品未产生足够的供分析用的材料。
实施例3
来自实施例2的在蔗糖上生长的7株酵母菌株被用于初步提取试验。在含有3颗不锈钢珠的Swedish管中，向1克冷冻干燥的生物质加入10毫升己烷。将管高速振摇3小时。使用25微米滤纸对混合物进行过滤。将生物粉（biomeal）洗涤3次，每次使用另外的10毫升己烷，并每次都进行过滤，以形成合并的滤液。将合并的滤液蒸发，并对回收的油称重。使用酯化的生物质和生物粉样品计算提取得率。
还使用水性提取程序对同样的7株菌株进行评估。将1克冷冻干燥的生物质用6克水复溶，以制备具有约14%生物质的溶液。使用标准提取方法处理该溶液。对于不同菌株来说，使用己烷作为溶剂的提取得率在48%至94%范围内。裂殖壶菌属（Schizochytrium）具有86%的提取得率。一些菌株可能具有比预期更强的细胞壁，并可以受益于有效破裂细胞的其他途径。从标准提取程序没有获得明显的油层。对于某些菌株而言，可能具有几颗小油滴，但是得率仍然是比较低的。用于酵母菌株的提取程序的修改可以提高得率。
蔗糖
对在蔗糖培养基上生产的26株菌株进行分析，它们具有1.3克/升至3.1克/升的生物质干重。鉴定到的菌株的脂肪酸含量为干重的36%至73%。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（作为总脂肪酸的重量百分数）为0%至17%的14:0、13%至33%的16:0、0%至13%的16:1、1%至24%的18:0、3%至59%的18:1、0%至29%的18:2、0%至9%的18:3和0%至31%的多不饱和脂肪酸含量。
红酵母属（Rhodotorula）和红冬孢酵母属（Rhodosporidium）的成员始终是来自于自然分离株和可公开获得的菌株中的性能较好者。此外，掷孢酵母属（Sporobolomyces）和锁掷酵母属（Sporidiobolus）成员的性能也优于其他属。发现这4个属是产油的并适合于生产生物燃料。还发现另外两个属Pseudozyma和隐球酵母属（Cryptococcus）的性能良好。具体来说，Pseudozyma的生物质干重为2克/升，脂肪酸含量为干重的57%。Pseudozyma产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为0%的14:0、13%的16:0、3%的16:1、4%的18:0、59%的18:1、14%的18:2、0%的18:3、和0%的多不饱和脂肪酸含量。
木糖
对在木糖培养基上生产的12株菌株进行分析，它们具有0.4克/升至2.9克/升的生物质干重。鉴定到的菌株具有38%至69%的脂肪酸含量。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为0%至1%的14:0、12%至32%的16:0、0%至11%的16:1、2%至52%的18:0、14%至50%的18:1、10%至32%的18:2、0%至7%的18:3和0%至2%的多不饱和脂肪酸含量。
在木糖培养基中进行分析的一些菌株产生了有限数量的具有高脂肪酸积累的菌株。总的来说，这些菌株不具有与其他糖类可比的脂肪酸积累。只有3株菌株具有高于50%的脂肪酸含量。酵母往往比作为木糖分离株的其他菌株具有更好的性能，并且大多数也在蔗糖上的性能较好的菌株之中。具体来说，Pseudozyma具有2克/升的生物质干重，并且脂肪酸含量为干重的55%。Pseudozyma产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为1%的14:0、16%的16:0、4%的16:1、5%的18:0、50%的18:1、16%的18:2、0%的18:3和0%的多不饱和脂肪酸含量。
葡萄糖
对在葡萄糖培养基上生产的26株菌株进行分析，它们具有2.0克/升至3.3克/升的生物质干重。鉴定到的菌株的脂肪酸含量为干重的50%至80%。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为0%至26%的14:0、18%至42%的16:0、0%至25%的16:1、0%至26%的18:0、5%至54%的18:1、0%至26%的18:2、0%至6%的18:3和0%至23%的多不饱和脂肪酸含量。
微藻分离株例如裂殖壶菌属（Schizochytrium）在葡萄糖培养基中比其他菌株性能更好。这些菌株中的大多数具有至少60%的脂肪酸含量水平，并且有几株具有高于70%的脂肪酸含量。许多菌株即使在含有谷氨酸单钠和酵母提取物的初始筛选培养基中生长良好，但它们在改良培养基中在葡萄糖上生长不好。具体来说，裂殖壶菌属（Schizochytrium）具有2.8克/升的生物质干重，并且脂肪酸含量为干重的67%。裂殖壶菌属（Schizochytrium）产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为19%的14:0、31%的16:0、21%的16:1、1%的18:0、6%的18:1、0%的18:2、0%的18:3和21%的多不饱和脂肪酸含量。
果糖
对在果糖培养基上生产的20株菌株进行分析，它们具有2.0克/升至3.4克/升的生物质干重。鉴定到的菌株的脂肪含量为干重的37%至81%。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为0%至27%的14:0、17%至45%的16:0、0%至17%的16:1、0%至24%的18:0、5%至46%的18:1、0%至30%的18:2、0%至7%的18:3和0%至23%的多不饱和脂肪酸含量。
微藻分离株例如裂殖壶菌属（Schizochytrium）在果糖培养基中比其他菌株性能更好。这些菌株中的大多数具有以干重百分数计至少60%的脂肪酸，并且其中有几株超过70%。在葡萄糖和果糖上的性能最好者之间存在相当大的重叠。具体来说，裂殖壶菌属（Schizochytrium）具有2.7克/升的生物质干重，并且脂肪酸含量为干重的65%。裂殖壶菌属（Schizochytrium）产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为20%的14:0、32%的16:0、17%的16:1、1%的18:0、6%的18:1、0%的18:2、0%的18:3和23%的多不饱和脂肪酸含量。
甘油
对在甘油培养基上生产的20株菌株进行分析，它们具有2克/升至3.5克/升的生物质干重。鉴定到的菌株的脂肪酸含量为干重的38%至74%。鉴定到的菌株产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为1%至22%的14:0、17%至43%的16:0、0%至23%的16:1、0%至26%的18:0、6%至44%的18:1、0%至16%的18:2、0%至5%的18:3和0%至28%的多不饱和脂肪酸含量。
微藻分离株例如裂殖壶菌属（Schizochytrium）在果糖培养基中比其他菌株性能更好。许多菌株具有至少60%的脂肪酸含量，并且对于葡萄糖和果糖两者来说，藻类菌株之间也存在相当大的重叠。具体来说，裂殖壶菌属（Schizochytrium）具有3.4克/升的生物质干重，并且脂肪酸含量为干重的68%。裂殖壶菌属（Schizochytrium）产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为19%的14:0、28%的16:0、22%的16:1、1%的18:0、7%的18:1、0%的18:2、0%的18:3和21%的多不饱和脂肪酸含量。此外，Pseudozyma具有2克/升的生物质干重，并且脂肪含量为62%或1.2克/升。Pseudozyma产生的脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）为1%的14:0、21%的16:0、5%的16:1、7%的18:0、44%的18:1、15%的18:2、0%的18:3和0%的多不饱和脂肪酸含量。
在选择用于在不同培养基上进行评估的菌株中观察到广泛的脂肪酸分布情况。脂肪酸分布情况（表示为总脂肪酸的重量百分数）在高于50%至低于1%的多不饱和脂肪酸和高于60%至低于5%的单不饱和脂肪酸范围内。总体来说，微藻具有最宽的脂肪酸范围，而酵母都具有相对非常低的多不饱和脂肪酸以及相对高的单不饱和脂肪酸。总体来说，酵母菌株的脂肪酸分布情况与目标油菜籽的分布情况具有至少一些相似性。
对于公共培养物保藏中心的菌株来说，从公共培养物保藏中心订购了几株代表性菌株用于评估。这些菌株中的7株在含有葡萄糖和果糖的培养基上生长适度良好。斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）在两种独立的场合下不能生长。这些菌株中的两株（粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）和Pseudozyma aphidis）在蔗糖上具有良好的生长和脂肪酸积累。公共菌株在木糖上都没有良好的生长或脂肪酸含量。
实施例4
来自于实施例3的在蔗糖上具有良好脂肪酸生产的先导菌株被用于随后的摇瓶实验，以更好地了解脂肪酸积累动力学和它们在较低盐度（氯化物）条件下生产脂肪酸的能力（因为最初从海洋环境分离）。每种菌株在摇瓶中在4种不同氯化钠（NaCl）水平（25克/升、12.5克/升、0.625克/升和0克/升）的摇瓶培养基中生长。所有摇瓶在22.5℃和200转/分钟的振摇速度下孵育。每天收获来自每种菌株的每种盐度条件的一个摇瓶，并测定生物质干重和脂肪酸含量。
图5和6显示了对于不同氯化钠水平来说，Pseudozyma相对于时间而言的生物质和脂肪百分数。
总体来说，这些菌株中的所有6种在较低氯化物水平（0克/升或0.625克/升的NaCl）下的生长都与它们在25克/升的正常NaCl水平下的生长一样好或更好。同时，所有菌株在低氯化物条件下都积累显著量的脂肪酸。该数据表明，对于酵母菌株来说，降低盐度水平对脂肪酸积累没有负面影响，并且事实上能够提高生产率。
实施例5
在这个实施例中，将破囊壶菌科裂殖壶菌属菌种（thraustochytridSchizochytrium sp.）（ATCC 20888）在100升New Brunswick Scientific（Edison,New Jersey,U.S.A.）BioFlo 6000发酵罐中，使用碳（葡萄糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用6升培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用14升VirTis（SP Scientific Gardiner,NewYork,U.S.A.）发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的10升培养基。A组包含98克MSG*1H2O、202克Na2SO4、5克KCl、22.5克MgSO4*7H2O、23.1克(NH4)2SO4、14.7克KH2PO4、0.9克CaCl2*2H2O、17.7毫克MnCl2*4H2O、18.1毫克ZnSO4*7H2O、0.2毫克CoCl2*6H2O、0.2毫克Na2MoO4*2H2O、11.8毫克CuSO4*5H2O、11.8毫克NiSO4*6H2O和2毫升Dow（Midland,Michigan,U.S.A.）1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约9.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组包含20毫升储备液，1升储备液含2.94克FeSO4*7H2O和1克柠檬酸。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升中并过滤除菌的37.6毫克盐酸硫胺素、1.9毫克维生素B12和1.9毫克泛酸半钙盐。D组包含1,000毫升含有400克葡萄糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29.5℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了18毫升标准ATCC 20888摇瓶培养物，并在29.5℃、pH 5.5、350转/分钟的搅拌和8升/分钟的空气下培养27小时的时间长度，此时将6升接种物肉汤转移至100升发酵罐中。所述100升发酵罐包含80升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括7个分批的培养基组。A组包含1,089.6克Na2SO4、57.6克K2SO4、44.8克KCl、181.6克MgSO4*7H2O和90.4克KH2PO4。A组在100升发酵罐中以约35升的体积在122℃下蒸汽灭菌60分钟。B组在约500毫升体积中包含90.4克(NH4)2SO4和10.4克MSG*1H2O。C组在约200毫升体积中包含15.2克CaCl2*2H2O。D组在约2升蒸馏水中包含1,200克粉末葡萄糖。E组在约1升体积中包含248毫克MnCl2*4H2O、248毫克ZnSO4*7H2O、3.2毫克CoCl2*6H2O、3.2毫克Na2MoO4*2H2O、165.6毫克CuSO4*5H2O和165.6毫克NiSO4*6H2O。F组在约280毫升体积中包含824毫克FeSO4*7H2O和280.3毫克柠檬酸。G组在约67.4毫升体积的蒸馏水中包含过滤除菌的780毫克盐酸硫胺素、12.8毫克维生素B12和266.4毫克泛酸半钙盐。将B、C、D、E、F和G组合并，并在发酵罐达到29.5℃的运行温度后加入到发酵罐中。接种前的发酵罐体积为约38升。
发酵罐接种了6升来自于上述发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用5.4升4N氢氧化铵溶液控制在pH 5.5。在整个发酵过程中，使用180转/分钟至480转/分钟的搅拌和60升/分钟至100升/分钟的空气流将溶解的氧控制在5%和20%之间。在整个发酵过程中，进料38.4升850克/升的95%葡萄糖溶液，以维持低于50克/升的浓度。在65小时后，发酵罐包含9,797克生物质，其中包含6,056克脂肪酸。得到的培养物的总脂肪酸生产率为30.3克/升/天，得到的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.214。
实施例6
在这个实施例中，将破囊壶菌科裂殖壶菌属菌种（thraustochytridSchizochytrium sp.）（ATCC 20888）在100升New Brunswick ScientificBioFlo 6000发酵罐中，使用碳（葡萄糖/果糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用6升半连续的接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用14升VirTis发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的10升培养基。A组包含98克MSG*1H2O、202克Na2SO4、5克KCl、22.5克MgSO4*7H2O、23.1克(NH4)2SO4、14.7克KH2PO4、0.9克CaCl2*2H2O、17.7毫克MnCl2*4H2O、18.1毫克ZnSO4*7H2O、0.2毫克CoCl2*6H2O、0.2毫克Na2MoO4*2H2O、11.8毫克CuSO4*5H2O、11.8毫克NiSO4*6H2O和2毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约9.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组包含20毫升储备液，每升储备液含2.94克FeSO4*7H2O和1克柠檬酸。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升蒸馏水中并过滤除菌的37.6毫克盐酸硫胺素、1.9毫克维生素B12和1.9毫克泛酸半钙盐。D组包含1,000毫升含有400克葡萄糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29.5℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了18毫升标准ATCC 20888摇瓶培养物，并在29.5℃、pH 5.5、350转/分钟的搅拌和8升/分钟的空气下培养23小时的时间长度，此时从发酵罐收获5升。向剩余的5升发酵肉汤，将5升新鲜制备的培养基加回到接种物发酵罐中。在继续培养5.3小时后，将6升接种物肉汤转移至100升发酵罐中。所述100升发酵罐包含80升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括7个分批的培养基组。A组包含1,089.6克Na2SO4、57.6克K2SO4、44.8克KCl、181.6克MgSO4*7H2O和90.4克KH2PO4。A组在100升发酵罐中以约35升的体积在122℃下蒸汽灭菌60分钟。B组在约500毫升体积中包含90.4克(NH4)2SO4和10.4克MSG*1H2O。C组在约200毫升体积中包含15.2克CaCl2*2H2O。D组在约2升蒸馏水中包含600克粉末葡萄糖和600克粉末果糖。E组在约1升体积中包含248毫克MnCl2*4H2O、248毫克ZnSO4*7H2O、3.2毫克CoCl2*6H2O、3.2毫克Na2MoO4*2H2O、165.6毫克CuSO4*5H2O和165.6毫克NiSO4*6H2O。F组在体积为约280毫升的蒸馏水中包含824毫克FeSO4*7H2O和280.3毫克柠檬酸。G组在体积为约67.4毫升的蒸馏水中包含过滤除菌的780毫克盐酸硫胺素、12.8毫克维生素B12和266.4毫克泛酸半钙盐。将B、C、D、E、F和G组合并，并在发酵罐达到29.5℃的运行温度后加入到发酵罐中。接种前的发酵罐体积为约38升。
发酵罐接种了6升来自于上述发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用5.4升4N氢氧化铵控制在pH 5.5。在整个发酵过程中，使用180转/分钟至480转/分钟的搅拌和60升/分钟至125升/分钟的空气流将溶解的氧控制在2%和35%之间。在整个发酵过程中，进料37.9升850克/升的50/50果糖/葡萄糖溶液，以维持低于100克/升的浓度。在95小时后，发酵罐包含8,575克生物质，其中包含5,463克脂肪酸。这种使用葡萄糖/果糖的分批进料方法，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.14，总脂肪酸生产率为17.3克/升/天。
实施例7
在这个实施例中，将破囊壶菌科裂殖壶菌属菌种（thraustochytridSchizochytrium sp.）（ATCC 20888）在10升New Brunswick ScientificBioFlo 3000发酵罐中，使用碳（葡萄糖/果糖）不灭菌分批进料方法进行培养。发酵用1.8升培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James（Irvine,California,U.S.A.）BioNet发酵罐。接种物培养基包含分6个独立的组制备的2升培养基。A组包含40.86克Na2SO4、2.16克K2SO4、1.68克KCl、6.81克MgSO4*7H2O和3.39克KH2PO4。B组包括0.57克CaCl2*2H2O。C组包括11.3克(NH4)2SO4和1.3克MSG*1H2O。D组包括103毫克FeSO4*7H2O、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。D组包括溶解在蒸馏水中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12和33.3毫克泛酸半钙盐。E组包括约100毫升含有60克50/50葡萄糖/果糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29.5℃后，向发酵罐加入B、C、D和E组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵是pH受控的，利用0.678升4N氢氧化铵溶液控制在pH 5.5。接种物发酵罐接种了150毫升标准ATCC 20888摇瓶培养物，并在29.5℃、pH 5.5（w/NH4OH）、636转/分钟至1,200转/分钟的搅拌和0.8升/分钟的空气下培养55.25小时的时间长度，此时将1.8升接种物肉汤转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升未灭菌的发酵盐溶液。在开放空气条件和任何成分不灭菌的情况下向发酵罐添加发酵培养基。发酵培养基在约6升蒸馏水中包含下列培养基组分：95.34克Na2SO4、5.04克K2SO4、3.92克KCl、15.89克MgSO4*7H2O、1.33克CaCl2*2H2O和90克粉末50/50果糖/葡萄糖。
在发酵罐达到29.5℃的稳定运行温度后，发酵罐接种了1.8升来自于上述发酵的肉汤。发酵没有进行pH控制。在整个发酵过程中，使用300转/分钟至580转/分钟的搅拌和6升/分钟至8升/分钟的空气流对溶解的氧进行控制，以维持20%的目标。在整个发酵期间，进料1.845升加热的未灭菌的850克/升的50/50葡萄糖/果糖溶液，以维持总糖浓度低于120克/升。在62小时后，发酵罐包含847.8克生物质，其包括519.7克脂肪酸。该发酵的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.19，并且总脂肪酸生产率为20.3克/升/天。这种使用葡萄糖/果糖的具有无菌生长级和非无菌生产级的两级发酵，与使用葡萄糖/果糖的混合进料的标准分批进料条件（实施例6）相比时，具有显著提高的脂肪酸生产和脂肪酸得率。
实施例8
在这个实施例中，将酵母Pseudozyma sp.（ATCC 11615）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（葡萄糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养，其中Pseudozyma sp.被独立的分类机构证实为与Pseudozyma aphidis和Pseudozyma rugulosa两者在DNA匹配方面（对核糖体基因的D1/D2和ITS区进行DNA测序）具有超过99%的相似性（其中基于形态学进行进一步区分可能是不可能的）。发酵用0.4升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2升培养基。A组包含18克MSG*1H2O、1.25克NaCl、0.58克CaCl2*2H2O、1克KCl、10克MgSO4*7H2O、0.74克(NH4)2SO4、6克酵母提取物（T154）、1.04克KH2PO4和0.2毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约1.8升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为9毫升的蒸馏水中包含20.6毫克FeSO4*7H2O、36.88毫克柠檬酸、6.2毫克MnCl2*4H2O、6.2毫克ZnSO4*7H2O、0.08毫克CoCl2*6H2O、0.08毫克Na2MoO4*2H2O、4.14毫克CuSO4*5H2O和4.14毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在2毫升蒸馏水中并过滤除菌的19.5毫克盐酸硫胺素、0.32毫克维生素B12和6.66毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有100克葡萄糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至22.5℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.9，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了5毫升标准摇瓶培养物，并在22.5℃、pH 7、430转/分钟至850转/分钟的搅拌和0.5升至1.0升/分钟的空气下培养26小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.4升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含50克MSG*1H2O、6.25克NaCl、20克Na2SO4、2.9克CaCl2*2H2O、10克KCl、50克MgSO4*7H2O、4.4克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、17.7克KH2PO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约5.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为45毫升的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、184.4毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升蒸馏水中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和36.5微克生物素。D组包含500毫升含有300克葡萄糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至22.5℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种前的发酵罐体积为约5.5升。发酵罐接种了0.4升来自于上述发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.883升4N氢氧化铵溶液控制在pH 6.5。在整个发酵过程中，使用290转/分钟至1,000转/分钟的搅拌和9.5升/分钟的空气流控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料3.75升850克/升的葡萄糖溶液，以将浓度维持在低于60克/升。在95小时后，发酵罐包含1,172.7克生物质，其包含581.5克脂肪酸。在22.5℃、pH 6.5和1X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.138，总脂肪酸生产率为14.7克/升/天。
实施例9
在这个实施例中，将酵母Pseudozyma sp.（ATCC 11615）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（蔗糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用0.5升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2升培养基。A组包含18克MSG*1H2O、1.25克NaCl、0.58克CaCl2*2H2O、1克KCl、10克MgSO4*7H2O、0.74克(NH4)2SO4、6克酵母提取物（T154）、1.04克KH2PO4和0.2毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在发酵罐中以约1.8升的体积在121℃下高压灭菌。B组在9毫升的体积中包含20.6毫克FeSO4*7H2O、36.88毫克柠檬酸、6.2毫克MnCl2*4H2O、6.2毫克ZnSO4*7H2O、0.08毫克CoCl2*6H2O、0.08毫克Na2MoO4*2H2O、4.14毫克CuSO4*5H2O和4.14毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在2毫升蒸馏水中并过滤除菌的19.5毫克盐酸硫胺素、0.32毫克维生素B12和6.66毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有100克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了5毫升标准摇瓶培养物，并在29℃、pH 6.5、634转/分钟的搅拌和1.0升/分钟的空气下培养22.5小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.5升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含50克MSG*1H2O、6.25克NaCl、20克Na2SO4、2.9克CaCl2*2H2O、10克KCl、50克MgSO4*7H2O、4.4克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、17.7克KH2PO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约5.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组在45毫升体积中包含103毫克FeSO4*7H2O、184.4毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和36.5微克生物素。D组包含500毫升含有300克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。在接种之前发酵罐体积为约4.8升。
发酵罐接种了0.5升来自于上述发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.48升6N氢氧化铵溶液控制在pH 6.5。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至833转/分钟的搅拌和8升/分钟至13升/分钟的空气流控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料3.3升850克/升的蔗糖溶液，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于90克/升。在70小时后，发酵罐包含984.9克生物质，其包含402.8克脂肪酸。在29.5℃、pH 5.5和1X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.145，总脂肪酸生产率为13.8克/升/天。
实施例10
在这个实施例中，将酵母Pseudozyma sp.（ATCC 11615）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（蔗糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用0.5升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2升培养基。A组包含18克MSG*1H2O、1.25克NaCl、0.58克CaCl2*2H2O、1克KCl、10克MgSO4*7H2O、0.74克(NH4)2SO4、6克酵母提取物（T154）、1.04克KH2PO4和0.2毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约1.8升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为9毫升的蒸馏水中包含20.6毫克FeSO4*7H2O、36.88毫克柠檬酸、6.2毫克MnCl2*4H2O、6.2毫克ZnSO4*7H2O、0.08毫克CoCl2*6H2O、0.08毫克Na2MoO4*2H2O、4.14毫克CuSO4*5H2O和4.14毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在2毫升蒸馏水中并过滤除菌的19.5毫克盐酸硫胺素、0.32毫克维生素B12和6.66毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有100克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了5毫升标准摇瓶培养物，并在29℃、pH 6.5、634转/分钟的搅拌和1.0升/分钟的空气下培养22.5小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.5升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含50克MSG*1H2O、6.25克NaCl、20克Na2SO4、2.9克CaCl2*2H2O、10克KCl、50克MgSO4*7H2O、4.4克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、17.7克KH2PO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在接种物发酵罐中以约5.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组在45毫升体积的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、184.4毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和36.5微克生物素。D组包含500毫升含有300克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。在接种之前发酵罐体积为约4.8升。
发酵罐接种了0.5升来自于上述发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.28升6N氢氧化铵溶液控制在pH 6.5。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至833转/分钟的搅拌和8升/分钟至13升/分钟的空气流控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料3.7升850克/升的蔗糖溶液，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于90克/升。在70小时后，发酵罐包含1,126.9克生物质，其包含535.8克脂肪酸。最终细胞密度为113克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的47.5%，平均脂肪酸生产率为18.3克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.175。在6小时时间内测量的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为69.6克/升/天。在24小时时间内测量的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为50.4克/升/天。在29.5℃、pH 5.5和0.5X氮下的脂肪酸得率（消耗的每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.175克/克。脂肪酸对氧的得率（消耗的每克氧生产的脂肪酸克数）为0.42克/克。实施例8、9和10证实了，通过使用蔗糖代替葡萄糖作为碳源、提高发酵温度、降低发酵pH和降低氮输入量，可以提高脂肪酸得率。下面的表1显示了时间对在发酵期间所测量的变量。
表1
实施例11
在这个实施例中，将破囊壶菌科裂殖壶菌属菌种（thraustochytridSchizochytrium sp.）（ATCC 20888）在14升New Brunswick ScientificBioFlo 3000发酵罐中，使用第一（50/50葡萄糖/果糖）和第二（甘油）碳进料和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用0.5升半连续的接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用14升VirTis发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的10升培养基。A组包含98克MSG*1H2O、202克Na2SO4、5克KCl、22.5克MgSO4*7H2O、23.1克(NH4)2SO4、14.7克KH2PO4、0.9克CaCl2*2H2O、17.7毫克MnCl2*4H2O、18.1毫克ZnSO4*7H2O、0.2毫克CoCl2*6H2O、0.2毫克Na2MoO4*2H2O、11.8毫克CuSO4*5H2O、11.8毫克NiSO4*6H2O和2毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约9.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组包含20毫升储备液，1升储备液包含2.94克FeSO4*7H2O和1克柠檬酸。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在10毫升蒸馏水中并过滤除菌的37.6毫克盐酸硫胺素、1.9毫克维生素B12和1.9毫克泛酸半钙盐。B组包含1,000毫升含有400克葡萄糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至29.5℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了18毫升标准ATCC 20888摇瓶培养物，并在29.5℃、pH 5.6、390转/分钟的搅拌和8升/分钟的空气下培养24小时的时间长度，此时从发酵罐收获4升。向剩余的6升发酵肉汤，将4升新鲜制备的培养基加回到接种物发酵罐中。
在继续培养1.25小时后，将0.5升接种物肉汤转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括7个分批的培养基组。A组包含136.2克Na2SO4、7.2克K2SO4、5.6克KCl、22.7克MgSO4*7H2O和11.3克KH2PO4。A组在14升发酵罐中以约5升的体积在121℃下高压灭菌约80分钟。B组在约200毫升体积中包含11.3克(NH4)2SO4和1.3克MSG*1H2O。C组在约50毫升体积中包含1.9克CaCl2*2H2O。D组在约0.25升蒸馏水中包含150克粉末葡萄糖/果糖。E组在约0.2升体积中包含31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。F组在约35毫升体积中包含103毫克FeSO4*7H2O和35毫克柠檬酸。G组在体积为约8.4毫升的蒸馏水中包含过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12和33.3毫克泛酸半钙盐。将组B、C、D、E、F和G合并，并在发酵罐达到29.5℃的运行温度后加入到发酵罐中。接种前的发酵罐体积为约5升。
发酵罐接种了0.5升来自于上述半连续发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.678升4N氢氧化铵溶液控制在pH 5.5。在整个发酵过程中，使用250转/分钟至1,200转/分钟的搅拌和7.5升/分钟至12升/分钟的空气流，将溶解的氧控制在大于0.1%。在整个发酵过程中，进料2.8升850克/升的50/50葡萄糖/果糖溶液，以将浓度维持在低于100克/升。同时，进料1.35升625克/升的甘油溶液，以将浓度维持在2和20克/升之间。在91小时后，发酵罐包含1,433.6克生物质，其包含642.4克脂肪酸。在该发酵中，脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.186，总脂肪酸生产率为24.3克/升/天。当与实施例6的结果（17.3克/升/天的总脂肪酸生产率）相比时，本实施例证实了在碳和氮分批进料的条件下，通过向葡萄糖/果糖进料基质中加入甘油可以恢复和提高脂肪酸生产率。
除非在本说明书中另有指明，否则上面的发酵实施例通常可以遵照或按照美国专利6,607,900中的程序来进行，除非在本说明书中另有指明。
实施例12
如下面的表2所示，对来自于实施例5至11的脂肪酸进行了脂肪酸分布情况分析。数据被表示成总脂肪酸的重量百分数。表中的空白格表示低于检测和/或表征的水平。
表2
实施例13
在这个实施例中，将酵母圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）（CBS6016）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（蔗糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用0.5升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2.3升培养基。A组包含20.7克MSG*1H2O、1.44克NaCl、0.667克CaCl2*2H2O、2.3克KCl、11.5克MgSO4*7H2O、0.85克(NH4)2SO4、13.8克酵母提取物（T154）、1.196克KH2PO4和0.23毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约2.1升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为4.5毫升的蒸馏水中包含23.7毫克FeSO4*7H2O、42.412毫克柠檬酸、7.13毫克MnCl2*4H2O、7.13毫克ZnSO4*7H2O、0.092毫克CoCl2*6H2O、0.092毫克Na2MoO4*2H2O、4.761毫克CuSO4*5H2O和4.761毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约2毫升蒸馏水中并过滤除菌的22.425毫克盐酸硫胺素、0.368毫克维生素B12和7.67毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有115克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至30℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.9，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了10毫升标准摇瓶培养物，并在30℃、pH 6.9、636转/分钟的搅拌和1.2升/分钟的空气下培养16.75小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.5升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含6.25克NaCl、20克Na2SO4、2.9克CaCl2*2H2O、10克KCl、50克MgSO4*7H2O、4.2克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、17.65克KH2PO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约6.25升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为约45毫升的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、370毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和35.8微克生物素。D组包含约500毫升含有300克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。在接种之前发酵罐体积为约5.6升。
发酵罐接种了0.5升来自于上述接种物发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.26升6N氢氧化铵溶液控制在pH 5.5。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至1200转/分钟的搅拌、4升/分钟至8升/分钟的空气流和0.0升/分钟至4.0升/分钟的氧气来控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料3.85升850克/升的蔗糖溶液，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于65克/升。在89小时后，发酵罐包含1127克生物质，其包括610.8克脂肪酸。最终细胞密度为112.7克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的54.18%，平均脂肪酸生产率为16.56克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1956。在8小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为31.68克/升/天。在24小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为30.1克/升/天。在27℃、pH 5.5和0.5X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1956。
通过将500克至600克冷冻干燥的生物质与6倍质量体积比的己烷混合，来进行脂类提取。使用高剪切混合器将固体润湿。通过使用Z型相互作用室（G10Z），在10,000psi的压力下将混合物两次通过设置为细胞破碎模式的Microfluidics（Newton,Massachusetts,U.S.A.）匀浆器（110Y）。将匀浆后的材料以4,000转/分钟离心5分钟，以将固体与己烷/粗油层分离。所述固体代表己烷提取后的生物质，也被称为生物粉（biomeal）。取出较轻的己烷粗油层，并在旋转蒸发器（BuchiLabortechnik AG,Flawil,Switzerland）中使用约50℃至约60℃的水浴温度将己烷蒸发。将油用氮气吹扫并冷冻储存。对起始的冷冻干燥生物质和己烷提取后的生物粉的样品进行FAME分析。提取得率基于起始生物质中的总脂肪酸减去生物粉中的总脂肪酸再除以起始生物质中的总脂肪酸。提取得率为91%。
脂肪酸效率总指数如下：OILE=2170，OILE1=3.0，OILE2=180，OILE3=5.4和OILE4=72.1，所述指数基于假定G值为0.4（用每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率）。
实施例14
在这个实施例中，将酵母圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）（CBS8587）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（蔗糖）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用0.5升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2.3升培养基。A组包含20.7克MSG*1H2O、1.44克NaCl、0.667克CaCl2*2H2O、2.3克KCl、11.5克MgSO4*7H2O、0.85克(NH4)2SO4、13.8克酵母提取物（T154）、1.196克KH2PO4和0.23毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约2.15升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为52毫升的蒸馏水中包含23.7毫克FeSO4*7H2O、42.412毫克柠檬酸、7.13毫克MnCl2*4H2O、7.13毫克ZnSO4*7H2O、0.092毫克CoCl2*6H2O、0.092毫克Na2MoO4*2H2O、4.761毫克CuSO4*5H2O和4.761毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约2毫升蒸馏水中并过滤除菌的22.425毫克盐酸硫胺素、0.368毫克维生素B12和7.67毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有115克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.91，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了26毫升标准摇瓶培养物，并在27℃、pH 6.9、643转/分钟的搅拌和1.2升/分钟的空气下培养16.75小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.5升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含6.25克NaCl、20克Na2SO4、2.9克CaCl2*2H2O、10克KCl、50克MgSO4*7H2O、4.2克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、17.65克KH2PO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约6.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为约45毫升的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、370毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和35.8微克生物素。D组包含约500毫升含有300克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至7，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。在接种之前发酵罐体积为约6.3升。
发酵罐接种了0.5升来自于上述接种物发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.26升6N氢氧化铵溶液控制在pH 6.9。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至1200转/分钟的搅拌、4升/分钟至9升/分钟的空气流和0.0升/分钟至4.0升/分钟的氧气来控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料4.13升850克/升的蔗糖溶液，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于75克/升。在92小时后，发酵罐包含1334克生物质，其包括701克脂肪酸。最终细胞密度为133.4克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的54%，平均脂肪酸生产率为18.75克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1988。在8小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为39克/升/天。在24小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为26克/升/天。在27℃、pH 6.9和0.5X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1988。
如实施例13中所示进行脂类提取。提取得率为78%。
脂肪酸效率总指数如下：OILE=2040，OILE1=2.7，OILE2=196，OILE3=3.8和OILE4=78.5，所述指数基于假定G值为0.4（用每克氧产生的脂肪酸克数表示的脂肪酸对氧的得率）。
实施例15
在这个实施例中，将酵母菌株准红锁掷酵母（Sporidioboluspararoseus）（ATCC 11616）在14升New Brunswick Scientific BioFlo3000发酵罐中，使用碳（蔗糖糖浆）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养，所述菌株被证实与几株准红锁掷酵母（Sporidioboluspararoseus）具有100%的DNA匹配度。发酵用0.75升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2.3升培养基。A组包含20.7克MSG*1H2O、1.44克NaCl、0.667克CaCl2*2H2O、2.3克KCl、11.5克MgSO4*7H2O、0.85克(NH4)2SO4、13.8克酵母提取物（T154）、1.196克KH2PO4和0.23毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约2.1升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为4.5毫升的蒸馏水中包含23.7毫克FeSO4*7H2O、42.412毫克柠檬酸、7.13毫克MnCl2*4H2O、7.13毫克ZnSO4*7H2O、0.092毫克CoCl2*6H2O、0.092毫克Na2MoO4*2H2O、4.761毫克CuSO4*5H2O和4.761毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约2毫升蒸馏水中并过滤除菌的22.425毫克盐酸硫胺素、0.368毫克维生素B12和7.67毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有115克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至30℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至6.9，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了29.5毫升标准摇瓶培养物，并在30℃、pH6.9、847转/分钟的搅拌和1.2升/分钟的空气下培养14.5小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.75升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含6.25克NaCl、4.2克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、12.66克Na2HPO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约6.25升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为约45毫升的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、370毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和35.8微克生物素。D组包含约700毫升从美国路易斯安那的Raceland Raw Sugar Corporation获得的糖浆。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至7，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。接种前的发酵罐体积为约6.15升。
发酵罐接种了0.75升来自于上述接种物发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.26升6N氢氧化铵溶液控制在pH 7。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至1200转/分钟的搅拌、3升/分钟至8升/分钟的空气流和0升/分钟至5升/分钟的氧气来控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料5.65升（Raceland）糖浆，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于80克/升。在92小时后，发酵罐包含1251克生物质，其包括670.7克脂肪酸。最终细胞密度为125.1克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的53.63%，平均脂肪酸生产率为17.56克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1625。在8小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为56.8克/升/天。在24小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为30.5克/升/天。在27℃、pH 7和0.5X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1625。
实施例16
在这个实施例中，将酵母Rhodotorula ingenosa（ATCC 11617）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（蔗糖糖浆）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养，所述菌株被证实与Rhodotorula ingenosa具有99%的DNA匹配度。发酵用0.75升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用3升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分4个独立的组制备的2.2升培养基。A组包含20.7克MSG*1H2O、1.44克NaCl、0.667克CaCl2*2H2O、2.3克KCl、11.5克MgSO4*7H2O、0.85克(NH4)2SO4、13.8克酵母提取物（T154）、1.196克KH2PO4和0.23毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约2.15升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为52毫升的蒸馏水中包含23.7毫克FeSO4*7H2O、42.412毫克柠檬酸、7.13毫克MnCl2*4H2O、7.13毫克ZnSO4*7H2O、0.092毫克CoCl2*6H2O、0.092毫克Na2MoO4*2H2O、4.761毫克CuSO4*5H2O和4.761毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约2毫升蒸馏水中并过滤除菌的22.425毫克盐酸硫胺素、0.368毫克维生素B12和7.67毫克泛酸半钙盐。D组包含200毫升含有115克蔗糖粉末的蒸馏水。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5.09，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了23毫升标准摇瓶培养物，并在27℃、pH 5.09、644转/分钟的搅拌和1.2升/分钟的空气下培养17.17小时的时间长度，此时从发酵罐收获0.75升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括4个分批的培养基组。A组包含6.25克NaCl、4.2克(NH4)2SO4、10克酵母提取物（T154）、12.66克Na2HPO4和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约6.25升的体积在121℃下高压灭菌。B组在体积为约45毫升的蒸馏水中包含103毫克FeSO4*7H2O、370毫克柠檬酸、31毫克MnCl2*4H2O、31毫克ZnSO4*7H2O、0.4毫克CoCl2*6H2O、0.4毫克Na2MoO4*2H2O、20.7毫克CuSO4*5H2O和20.7毫克NiSO4*6H2O。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含溶解在约10毫升中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12、33.3毫克泛酸半钙盐和35.8微克生物素。D组包含约700毫升从路易斯安那的Raceland Sugar获得的糖浆。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C和D组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至5，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。接种前的发酵罐体积为约4.85升。
发酵罐接种了0.75升来自于上述接种物发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.27升6N氢氧化铵溶液控制在pH 5。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至1100转/分钟的搅拌、0.9升/分钟至7.9升/分钟的空气流和0升/分钟至7升/分钟的氧气来控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料4.9升（Raceland）糖浆，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于75克/升。在89小时后，发酵罐包含1104克生物质，其包括553克脂肪酸。最终细胞密度为110.4克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的50.1%，平均脂肪酸生产率为14.96克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1634。在8小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为31.9克/升/天。在24小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为29.9克/升/天。在27℃、pH 5和0.5X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.1634。
实施例17
在这个实施例中，将绿藻原壳小球藻（Chlorella protothecoides）UTEX 250（MK28415）在14升New Brunswick Scientific BioFlo 3000发酵罐中，使用碳（酸水解的蔗糖糖浆）和氮（氢氧化铵）分批进料方法进行培养。发酵用1升接种物培养物接种。对于接种物的繁殖来说，利用14升Broadley James BioNet发酵罐。接种物培养基包含分5个独立的组制备的10升培养基。A组包含20克MSG*1H2O、2.9克CaCl2*2H2O、10克酵母提取物（T154）和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。将A组在接种物发酵罐中以约9.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组包含约200毫升体积中的20克KH2PO4。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含全部溶解在蒸馏水中的103毫克FeSO4*7H2O、184.4毫克柠檬酸、18.1毫克MnCl2*4H2O、2.2毫克ZnSO4*7H2O、0.49毫克CoCl2*6H2O、3.9毫克Na2MoO4*2H2O、28.6毫克H3BO3和0.79毫克CuSO4*5H2O。C组储备液在121℃下高压灭菌。D组包含溶解在约20毫升蒸馏水中并过滤除菌的97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12和33.3毫克泛酸半钙盐。E组包含1000毫升含有500克玉米浆的蒸馏水。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C、D和E组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至7，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。
接种物发酵罐接种了400毫升标准摇瓶培养物，并在27℃、pH 7、384转/分钟的搅拌和5升/分钟的空气下培养43.5小时的时间长度，此时从发酵罐收获1升并转移至14升发酵罐中。14升发酵罐包含10升发酵培养基。发酵培养基以与接种物发酵罐相似的方式制备。发酵培养基包括5个分批的培养基组。A组包含25克MSG*1H2O、2.9克CaCl2*2H2O、10克酵母提取物（T154）和1.0毫升Dow 1520US（消泡剂）。A组在发酵罐中以约5.5升的体积在121℃下高压灭菌。B组包含约250毫升体积中的25克KH2PO4。B组储备液在121℃下高压灭菌。C组包含全部溶解在蒸馏水中的257.5毫克FeSO4*7H2O、461毫克柠檬酸、45.25毫克MnCl2*4H2O、5.55毫克ZnSO4*7H2O、1.225毫克CoCl2*6H2O、9.75毫克Na2MoO4*2H2O、71.5毫克H3BO3和1.975毫克CuSO4*5H2O。C组储备液在121℃下高压灭菌。D组包含溶解在约20毫升蒸馏水中并过滤除菌的35.8微克生物素、97.5毫克盐酸硫胺素、1.6毫克维生素B12和33.3毫克泛酸半钙盐。E组包含约1000毫升从路易斯安那的Raceland Sugar获得的水解糖浆。糖浆是通过添加硫酸至pH为约4并在121℃下灭菌至少1小时来进行水解的。在将发酵罐冷却至27℃后，向发酵罐加入B、C、D和E组。使用氢氧化钠和硫酸将发酵罐的pH调整至7，并且在接种前溶解的氧跨度为100%。接种前的发酵罐体积为约5.9升。
发酵罐接种了1升来自于上述接种物发酵的肉汤。发酵是pH受控的，利用0.27升6N氢氧化铵溶液控制在pH 7，直至氢氧化铵进料耗尽（在接种后约55小时），此时，对于剩余的发酵而言，使用4N氢氧化钠。在整个发酵过程中，使用357转/分钟至850转/分钟的搅拌和8升/分钟的空气流来控制溶解的氧，以维持20%的目标设定点。在整个发酵过程中，进料5.2升（Raceland）糖浆，以将总糖（葡萄糖+果糖+蔗糖）浓度维持在低于55克/升。在93小时后，发酵罐包含1082克生物质，其包括462.4克脂肪酸。最终细胞密度为108.2克/升干重。脂肪酸含量为细胞干重的42.73%，平均脂肪酸生产率为11.93克/升/天，得到的培养物的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.17617。在8小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为33.6克/升/天。在24小时时间长度内测量到的培养物的最高峰值脂肪酸生产率为24.4克/升/天。在27℃、pH 7和0.5X氮下的脂肪酸得率（每克碳原料生产的脂肪酸克数）为0.17617。
当在本文中使用时，术语“具有”、“包含”、“带有”、“含有”和“包括”是开放和包含性的表述。可选地，术语“由……组成”是封闭和排他性的表述。在解释权利要求书或说明书中的任何术语时，如果存在任何歧义，起草者的意图是倾向开放和包含性的表述。
当在本文中使用时，术语“等、等等”为列举的条目和/或成员的任何和所有个体和组合提供支持，并为条目和/或成员的个体和组合的等同物提供支持。
对于方法或过程中步骤的次序、数目、顺序、省略和/或重复限制来说，除非明确提供，否则起草者不打算暗示步骤的次序、数目、顺序、省略和/或重复限制属于本发明的范围。
对于范围来说，范围应该被解释为包括在上限值与下限值之间的所有点，从而为包含在上限值和下限值之间的所有可能的范围、包括没有上限和/或下限的范围提供支持。
用于操作、百分率和程序的基础可以是任何适合的基础，例如质量基础、体积基础、摩尔基础等。如果没有指名基础，应该使用质量基础或其他适合的基础。
本领域技术人员显而易见的是，可以在所公开的结构和方法中做出各种修改和改变，而不背离本发明的范围或精神。具体来说，任何实施方案的描述可以与其他实施方案的描述自由组合，以产生两种或更多种要素和/或限制的组合和/或改变。对于本领域的技术人员来说，通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案将是显而易见的。说明书和实施例意欲仅被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由权利要求书指明。
Claims (16)
1.用于生产生物油的分离的生物体，所述生物体包含至少约5.1的脂肪酸效率总指数1（OILE1），其中：
OILE1=C*D*F；并且
C=以克/升/天计的脂肪酸生产率；
D=以消耗的每克原料产生的脂肪酸克数计的脂肪酸得率；并且
F=基于总脂肪酸含量的百分数的提取效率。
2.权利要求1的分离的生物体，其中分离的生物体具有至少约115克/升的细胞密度。
3.权利要求1-2任一项的分离的生物体，其中分离的生物体具有基于干重至少约49%的脂肪酸含量。
4.权利要求1-3任一项的分离的生物体，其中分离的生物体具有至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率。
5.权利要求1-4任一项的分离的生物体，其中分离的生物体具有消耗的每克氧产生约0.4克脂肪酸以上的脂肪酸对氧的得率。
6.权利要求1-5任一项的分离的生物体，其中分离的生物体包括Pseudozyma aphidis、Pseudozyma rugulosa、Pseudozyma sp.、Rhodosporidium fluviale、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、Rhodotorula hordea、Rhodotorula ingenosa、赤色酵母（Sporobolomyces ruberrimus）、银耳属菌种（Tremella sp.）、黑粉菌属菌种（Ustilago sp.）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）、准红锁掷酵母（Sporidiobolus pararoseus）、Leucosporidiumscottii、Pseudozyma antarctica、球红冬孢酵母（Rhodosporidiumsphaerocarpum）、Rhodotorula muscorum、罗伦隐球酵母（Cryptococcuslaurentii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、双倒卵形红冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、原壳小球藻（Chlorella protothecoides）或其组合。
7.权利要求1-5任一项的分离的生物体，其中生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11615以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
8.权利要求1-5任一项的分离的生物体，其中生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11616以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
9.权利要求1-5任一项的分离的生物体，其中生物体具有ATCC专利保藏号PTA-11617以及从其衍生的突变菌株的鉴定特征。
10.生物油或生物燃料，其包含脂肪酸或由脂肪酸制成，所述脂肪酸从权利要求1-9任一项的分离的生物体制备。
11.生产生物油的方法，所述方法包括：
生产包含脂肪酸的生物体；以及
从生物体取出脂肪酸以形成生物油；
其中所述生物体满足或超过至少两项度量标准，每项度量标准包括：
至少约115克/升的细胞密度；
基于干重至少约49%的脂肪酸含量；
至少约15克/升/天的脂肪酸生产率；
消耗的每克原料产生至少约0.175克脂肪酸的脂肪酸得率；
至少约30克/升/天的24小时峰值脂肪酸生产率；或
消耗的每克氧产生约0.4克以上脂肪酸的脂肪酸对氧的得率。
12.权利要求11的方法，其中生物体满足或超过另外至少三项所述度量标准。
13.权利要求11-12任一项的方法，其中生物体包括红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、Pseudozyma、银耳属（Tremella）、红酵母属（Rhodotorula）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、黑粉菌属（Ustilago）、隐球酵母属（Cryptococcus）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、假丝酵母属（Candida）的生物体或其组合。
14.权利要求11-12任一项的方法，其中生物体包括裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶藻属（Ulkenia）、小球藻属（Chlorella）、原壁菌属（Prototheca）的生物体或其组合。
15.权利要求11-14任一项的方法，其还包括原料，其中所述原料包含至少一种有机酸。
16.通过权利要求11-14任一项的方法制备的包含脂肪酸或由脂肪酸制成的生物油或生物燃料。
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