CN102936755A - 一种单分子核酸芯片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种生物技术领域制备单分子核酸芯片的制作方法，该方法在获得大量各携带有一个自由活性基团的短链核酸分子的微纳米珠和空微纳米珠混合物后，将混合物沉降到基底表面，在使核酸分子上标记的活性基团与基片表面携带的活性基团发生连接反应时，利用微纳米珠空间位阻作用限制短链核酸分子在向基底固定时过于接近，保证相邻核酸分子间距不小于光学分辨极限，利用外力使未与基底连接的复合物及空微纳米珠脱离基底表面，如此反复沉降与脱离，直至基底铺满一层连接的复合物，最后，解离微纳米珠，获得单分子核酸芯片。本发明提供快速、简便制备确保95%的样点是一个分子的高通量单分子生物芯片。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片制作技术，具体地说，涉及的是一种单分子核酸芯片的制作方法。
背景技术
单分子核酸芯片，即每一个样点只有一条核酸分子，不仅可以实现单位面积的数据量最大化，而且各分子可通过分子生物学手段修饰后用作“诱饵”，捕获靶分子，既可用于杂交检测单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CVN）和基于阵列的比较基因组杂交（aCGH）等检测，也可用于DNA合成法测序、连接法测序等，将第二代测序技术转换为第三代测序技术，还可以用于其他多种单分子研究。但是，单分子核酸芯片的制作难度大，传统的制备方法为溶液铺设，有很大的随机性，即有许多核酸分子重叠而无法观察，还有一部分基片上没有样品，造成有限检测面积浪费。所以，到目前为止，还没有比较令人满意的技术。
经对现有文献检索发现，2007年S.Quake课题组在APPLIED PHYSICSLETTERS发表了题为“High density single molecule surface patterning withcolloidal epitaxy”将DNA分子均匀绑定到直径在纳米级的胶体颗粒，经胶体颗粒取向附生作用制备DNA纳米阵列芯片，但因绑定到每个颗粒上的DNA分子数很多，所得到的芯片上只有约1/3的样点为单分子，其他样点为多分子。因此，该方法并不能保证“单分子”DNA芯片上每个样点上是只有一条DNA即单分子。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便制备确保95%的样点是一个分子的高通量单分子生物芯片。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种单分子核酸芯片的制作方法，通过单分子样点的间距和纯度控制，建立高密度、多功能单分子核酸芯片的制造技术体系，用于SNP、CVN和aCGH检测以及单分子DNA测序等。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种制备单分子核酸芯片的制作方法，该方法包括如下步骤：
第一步，取大量各携带有一个自由活性基团的短链核酸分子的微纳米珠（以下称为目的复合物）和空微纳米珠混合物，将该混合物沉降到基底表面，该基底表面携带活性基团；
第二步，核酸分子上标记的活性基团与基底表面携带的活性基团发生连接反应，利用微纳米珠空间位阻作用限制短链核酸分子在向基底固定时过于接近，保证相邻核酸分子间距不小于光学分辨极限；
第三步，利用外力使未与基底连接的目的复合物及空微纳米珠脱离基底表面，如此反复沉降与脱离，直至基底铺满一层连接的目的复合物；
第四步，解离与基底连接的微纳米珠，获得单分子核酸芯片。
优选地，所述带有一个自由活性基团的短链核酸分子的微纳米珠（目的复合物），按照以下方法制备：
步骤一，将两处标记有不同活性基团的核酸溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面被覆能与核酸上两种活性基团之一发生连接反应的微纳米珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按核酸分子条数与微纳米珠个数按设定比例混合并搅拌，使核酸上的相应活性基团与微纳米珠上的活性基团充分反应，将核酸绑定到微纳米珠上，获得目的复合物。
所述的微纳米珠，是单分子核酸运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。
所述的核酸分子，可以是脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和肽核酸（PNA）。
所述的短链核酸，是与微纳米珠直径相比，其伸直长度小一个量级或更小。
所述的基底，可以是玻璃片、硅片和云母片等。
所述的沉降，是借助重力、磁力、离心力和电场力等达到复合物沉积到基底表面。
所述的位阻效应，是当目的复合物铺设到基底表面时，因核酸长度很短，只有微纳米珠接触基底周围一小部分球面上的核酸可接触到基底表面而连接，可以确保相邻核酸分子间距不小于光学分辨极限。
所述的核酸标记的活性基团以及微纳米珠和基底被覆的活性基团，是能够发生免疫反应、直接或间接形成共价键的活性基团对，达到核酸与微纳米珠和基底连接的目的；凡是能够实现该目的的活性基团对均可，如：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-琥珀酰亚胺、氨基-环氧树脂、氨基-羧基、氨基-醛基、巯基-环氧树脂、巯基-马来酰亚胺、巯基-巯基、酮基-羟胺、酮基-酰肼、酰肼-醛基、酰肼-羧基等，其中核酸用两个相互不能发生反应的活性基团标记，微纳米珠用可与核酸上一个活性基团发生连接反应的活性基团被覆，基底用可以与核酸上另一个活性基团发生连接反应的活性基团标记。
所述的核酸两处标记活性基团，可以在间隔一定数目碱基和核酸两端。当核酸为DNA时，根据其序列设计和活性基团标记的位置，固定到基底的DNA分子，可以是线性单链DNA、末端平端或粘性末端的茎环结构DNA，也可以是一端或两端为平端或粘性末端的双链DNA；这些特殊序列与结构，可以用于捕获靶分子DNA或RNA。
所述的外力，可以是摇动、转动，也可以是流体冲洗。
所述的解离与基底连接的微纳米珠，是采用酶学、物理学，也可以是化学的方法，使微纳米珠脱离基底表面，实现目的核酸分子的固定。如利用DNA的选择性内切酶位点用相应DNA内切酶切割DNA，达到连接基底DNA片段与连接微纳米珠DNA片段的脱离，也可以用加热的方法使双链DNA解链，使分别连接在DNA两条单链的微纳米珠与基底脱离，也可以用能够引起核酸分子变性的化学试剂使双链DNA解链，如碱溶液、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，实现微纳米珠与基底的分离。用溶液清洗基底上的微纳米珠，经回收和纯化后，可以重复使用。
所述的微纳米珠上携带的核酸分子条数是指根据纳米珠直径、Poisson公式及芯片上的预期单分子纯度计算获得的最大值。若纳米珠直径为700nm，为保证芯片样点间距为不小于500nm，核酸分子长度最长为42nt，当芯片上的预期单分子纯度为98%时，纳米珠上携带的核酸分子条数≦6。若微米珠直径为2000nm，核酸分子长度为42nt，当芯片上的预期单分子纯度为80%时，纳米珠上携带的核酸分子条数≦28。
所述的核酸分子条数与微纳米珠个数按设定比例混合，是根据Poisson分布规律P=λ^k/(k!e^λ)，其中k为核酸分子条数，λ为混合前核酸分子条数与微纳米珠个数的比例，P为一个微纳米珠上同时连接k条DNA的概率。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
与国内外同类芯片相比，本发明采用的单分子操作技术，工艺简单，构建的目的复合物可重复使用，适于大规模的单分子芯片制备，单分子样点的比例可达到95%以上，而国外的技术只有37%，样点密度可达600-700nm，接近光学极限，如采用4色荧光，反复沉降/电转移方法制备的一张载玻片可承载高达35亿个样点，可用于SNP、CNV和aCGH检测以及单分子核酸测序等。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明单分子核酸芯片制作示意图；
图中：1.微纳米珠；2.活性基团；3.单分子核酸；4.固定的相邻核酸最近距离；5.横线以下为核酸分子可接触到基底的球面。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。
如图1所示，以下实施例中目的复合物，核酸分子条数与微纳米珠个数按一定比例混合，是根据Poisson分布规律P=λ^k/(k!e^λ)，其中k为核酸分子条数，λ为混合前核酸分子条数与微纳米珠个数的比例，P为一个微纳米珠上同时连接k条DNA的概率。为了保证DNA芯片上的样点是高比例单分子，可以运用概率论设定在核酸分子可接触到基底的球面（图1）内同时连接≥2条DNA的概率不大于预设值X，即可实现单分子样点的比例为（1-X）×100/%，同时结合实验中微纳米珠的直径和核酸分子长度，求出一个球上最多可以连接核酸分子的条数k。设定一个微纳米珠上同时连接≥k条核酸分子的概率不大于0.01（P值），即可求出混合前核酸分子条数:微纳米珠个数的比例λ值。
实施例1
步骤一，将长度52核苷酸（nt）的第42位碱基用巯基修饰、5’端用氨基修饰的可自我配对而形成含DNA内切酶识别位点的茎环结构的单链DNA分子溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面被覆羧基的直径700nm的硅纳米珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按DNA分子条数与硅纳米珠个数2:1的比例混合到反应容器并搅拌，使DNA上的氨基与纳米硅珠上的羧基充分反应，绑定到一个硅珠上的DNA条数≦6，获得目的复合物。
步骤四，将目的复合物借助电场力沉降到LC-SMCC被覆的硅片表面，使DNA分子上标记的巯基与硅片表面被覆的马来酰亚胺发生连接反应。
步骤五，通过转动反应容器，使未与硅片连接的复合物及空纳米硅珠脱离玻片表面，重复步骤四，如此反复沉降与脱离，直至硅片铺满一层连接的复合物。
步骤六，利用内切酶切割茎环结构DNA的选择性内切酶位点，缓冲液清洗去除纳米硅珠，获得单分子核酸芯片。
实施效果：本实施例铺设的单分子芯片，可使单分子样点比例达到98%，最近样点间距为不小于500nm。
实施例2
步骤一，将长度42碱基对（bp）的双链DNA中一条链的5’端用巯基修饰、另一条链的5’端用生物素修饰的短链双链DNA分子溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面氨基化的直径700nm纳米硅珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按DNA分子条数与硅珠个数比为7:1的比例混合到反应容器中并搅拌，使DNA上的巯基与纳米硅珠上的氨基充分反应，使一个硅珠上的DNA条数≦14条，获得目的复合物。
步骤四，借助重力将目的复合物沉降到被覆抗生物素蛋白的玻片表面，使DNA分子上标记的生物素与玻片表面携带的抗生物素蛋白发生连接反应。
步骤五，通过转动反应容器，使未与玻片连接的复合物及空纳米硅珠脱离玻片表面，重复步骤四，如此反复沉降与脱离，直至玻片铺满一层连接的复合物。
步骤六，用6-8M尿素变性双链DNA，缓冲液清洗去除纳米硅珠，获得单分子核酸芯片。
实施效果：本实施例铺设的单分子DNA芯片，单分子样点比例可达80%，最近样点间距不小于500nm。
实施例3
步骤一，将长度172bp的异源双链DNA:RNA中的DNA链的5’端用地高辛修饰、RNA链的5’端用生物素修饰，溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面被覆抗地高辛抗体的直径1000nm纳米磁珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按异源双链核酸分子条数与磁珠个数比为1:2的比例混合到反应容器中并搅拌，使DNA上的地高辛与磁珠上的抗地高辛抗体充分反应，是每个磁珠上的核酸分子≦3，获得目的复合物。
步骤四，将目的复合物磁力沉降到被覆抗生物素蛋白的玻片表面，使RNA分子上标记的生物素与玻片表面被覆的抗链生物素蛋白发生连接反应。
步骤五，通过摇动反应容器，使未与玻片连接的复合物及空纳米磁珠脱离玻片表面，重复步骤四，如此反复沉降与脱离，直至玻片铺满一层连接的复合物。
步骤六，用0.15M NaOH变性异源双链核酸，使磁珠与玻片脱离，缓冲液清洗去除磁珠，获得单分子RNA芯片。
实施效果：本实施例铺设的单分子芯片，可使单分子样点比例达到98%，最近样点间距为不小于500nm。
实施例4
步骤一，将5’端用生物素修饰、长度172nt DNA、3’末端由20碱基PNA与之杂交的复合分子溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面被覆抗生物素蛋白的直径1000nm聚苯乙烯纳米珠（PS珠）悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按复合分子条数与PS珠个数比为2:1的比例混合到反应容器中并搅拌，使复合分子上的生物素与PS珠上的抗生物素蛋白充分反应，每个PS珠上复合分子的条数≦6，获得目的复合物。
步骤四，将目的复合物离心力沉降到被覆琥珀酰亚胺的云母片表面，使PNA分子上的伯氨基团与云母片表面被覆的琥珀酰亚胺发生连接反应。
步骤五，通过缓冲液冲洗表面，使未与云母片连接的复合物及空PS珠脱离云母片表面，重复步骤四，如此反复沉降与脱离，直至云母片铺满一层连接的复合物。
步骤六，94℃下变性温度使复合分子解链，使PS珠与云母片脱离，缓冲液清洗去除PS珠，获得单分子PNA芯片。
实施效果：本实施例铺设的单分子DNA芯片，单分子样点比例可达80%，最近样点间距不小于500nm。
实施例5
步骤一，将长度42bp的双链DNA中一条链的5’端用巯基修饰、另一条链的5’端用氨基修饰的短链双链DNA分子溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
步骤二，将表面巯基化的直径2000nm微米硅珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
步骤三，将溶液I和溶液II按DNA分子条数与硅珠个数比为18:1的比例混合到反应容器中并搅拌，使DNA上的巯基与微米硅珠上的巯基充分反应，使一个硅珠上的DNA条数≦28条，获得目的复合物。
步骤四，借助重力将目的复合物沉降到被覆异硫氰酸酯的玻片表面，使DNA分子上标记的氨基与玻片表面携带的异硫氰酸酯发生连接反应。
步骤五，通过摇动反应容器，使未与玻片连接的复合物及空微米硅珠脱离玻片表面，重复步骤四，如此反复沉降与脱离，直至玻片铺满一层连接的复合物。
步骤六，用甲酰胺变性双链DNA，缓冲液清洗去除微米硅珠，获得单分子核酸芯片。
实施效果：本实施例铺设的单分子DNA芯片，单分子样点比例可达80%，最近样点间距不小于500nm。
应当指出的是，以上实施例只是本发明的部分实施例，变换上述实施例中的部分技术等，比如发明内容中所述的微纳米珠材质、核酸分子类型、基底、沉降方式、核酸标记的活性基团以及微纳米珠和基底被覆的活性基团种类等等，本发明都是可以实现，且能达到上述的效果。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (11)
1.一种制备单分子核酸芯片的制作方法，其特征在于，该方法在获得大量各携带有一个自由活性基团的短链核酸分子的微纳米珠即目的复合物和空微纳米珠混合物后，将混合物沉降到基底表面，在使核酸分子上标记的活性基团与基片表面携带的活性基团发生连接反应时，利用微纳米珠空间位阻作用限制短链核酸分子在向基底固定时过于接近，保证相邻核酸分子间距不小于光学分辨极限，利用外力使未与基底连接的目的复合物及空微纳米珠脱离基底表面，如此反复沉降与脱离，直至基底铺满一层连接的目的复合物，最后，解离与基底连接的微纳米珠，获得单分子核酸芯片。
2.根据权利要求1所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特殊是，所述目的复合物，按照以下方法制备：
第一步，将两处标记有不同活性基团的核酸溶解于连接缓冲液，获得溶液I；
第二步，将表面被覆能与核酸上两种活性基团之一发生连接反应的微纳米珠悬浮于连接缓冲液，获得溶液II；
第三步，将溶液I和溶液II按核酸分子条数与微纳米珠个数按设定比例混合并搅拌，使核酸上的相应活性基团与微纳米珠上的活性基团充分反应，将核酸绑定到微纳米珠上，获得目的复合物。
3.根据权利要求1所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的微纳米珠上携带的核酸分子条数是指根据纳米珠直径、Poisson公式及芯片上的预期单分子纯度计算获得的最大值；若纳米珠直径为700nm，为保证芯片样点间距为不小于500nm，核酸分子长度最长为42nt，当芯片上的预期单分子纯度为98%时，纳米珠上携带的核酸分子条数≦6；若微米珠直径为2000nm，核酸分子长度为42nt，当芯片上的预期单分子纯度为80%时，纳米珠上携带的核酸分子条数≦28。
4.根据权利要求2所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的核酸分子条数与微纳米珠个数按设定比例混合，是根据Poisson分布规律P=λ^k/(k!e^λ)，其中k为核酸分子条数，λ为混合前核酸分子条数与微纳米珠个数的比例，P为一个微纳米珠上同时连接k条DNA的概率。
5.根据权利要求4所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，为了保证DNA芯片上的样点是高比例单分子，运用概率论设定在核酸分子可接触到基底的球面内同时连接≥2条DNA的概率不大于预设值X，即实现单分子样点的比例为（1-X）100%，同时结合微纳米珠的直径和核酸分子长度，求出一个球上最多可以连接核酸分子的条数k，设定一个微纳米珠上同时连接≥k条核酸分子的概率不大于0.01，即求出混合前核算分子条数:微纳米珠个数的比例λ值。
6.根据权利要求1-5任一项所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的核酸分子，是脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA和肽核酸PNA，与微纳米珠直径相比，其伸直长度小一个量级或更小；在两处标记活性基团时，间隔一定数目碱基上标记，或标记在核酸两端；当核酸为DNA时，根据其序列设计和活性基团标记的位置，固定到基底的DNA分子，或是线性单链DNA、末端平端或粘性末端的茎环结构DNA，或是一端或两端为平端或粘性末端的双链DNA；这些特殊序列与结构，用于捕获靶分子DNA或RNA。
7.根据权利要求1-5任一项所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的核酸标记的活性基团以及微纳米珠和基底被覆的活性基团，是能够发生免疫反应、直接或间接形成共价键的活性基团对，达到核酸与微纳米珠和基底连接的目的；凡是能够实现该目的的活性基团对均可，其中核酸用两个相互不能发生反应的活性基团标记，微纳米珠用可与核酸上一个活性基团发生连接反应的活性基团被覆，基底用可以与核酸上另一个活性基团发生连接反应的活性基团标记。
8.根据权利要求7所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的活性基团对包括：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-琥珀酰亚胺、氨基-环氧树脂、氨基-羧基、氨基-醛基、巯基-环氧树脂、巯基-马来酰亚胺、巯基-巯基、酮基-羟胺、酮基-酰肼、酰肼-醛基、酰肼-羧基。
9.根据权利要求1-5任一项所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的解离微纳米珠采用酶学、物理学或化学的方法，使微纳米珠脱离基底表面，实现目的核酸分子的固定，包括利用DNA的选择性内切酶位点用相应DNA内切酶切割DNA，达到连接基底DNA片段与连接微纳米珠DNA片段的脱离；用加热的方法使双链DNA解链，使分别连接在DNA两条单链的微纳米珠与基底脱离；用能够引起核酸分子变性的化学试剂使双链DNA解链，实现微纳米珠与基底的分离。
10.根据权利要求1-5任一项所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的微纳米珠，是单分子核酸运载工具，其材质是硅、磁性材料或多聚物，其直径在纳米至微米量级；所述的基底是玻璃片、硅片或云母片。
11.根据权利要求1-5任一项所述的单分子核酸芯片的制作方法，其特征是，所述的将混合物沉降到基地表面，是借助重力、磁力、离心力和电场力达到复合物沉积到基底表面；所述的外力是摇动、转动或流体冲洗。
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