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CN102888347A - 小球藻突变株及其应用 - Google Patents

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CN102888347A CN2011102184792A CN201110218479A CN102888347A CN 102888347 A CN102888347 A CN 102888347A CN 2011102184792 A CN2011102184792 A CN 2011102184792A CN 201110218479 A CN201110218479 A CN 201110218479A CN 102888347 A CN102888347 A CN 102888347A
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Abstract

本发明涉及一种经选育的用以生产单细胞油脂及生物柴油的小球藻突变株及其应用。所述小球藻突变株已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.4917。所述小球藻突变株为单细胞油脂高脂突变株，可应用于生物柴油生产工艺中。

Description

小球藻突变株及其应用
技术领域
本发明涉及一种经选育的用以生产单细胞油脂及生物柴油的小球藻突变株及其应用。
背景技术
生物柴油突出的环保性和可再生性引起了世界发达国家尤其是资源贫乏国家的高度重视。生物柴油主要以生物脂为原料，经酯化反应转化为脂肪酸甲酯而得。生物柴油产生的二氧化碳仅为传统柴油的16％到40％，所产生的尾气微粒排放量也降低了30％左右，同时不需要对现有柴油发动机作任何改装即可混合或单独使用，也不需要改变能源的分配方式以及能源资源的市场，可直接作为民用燃料和内燃机燃料。
生物柴油的生物脂原料主要来源于植物油脂、废油和动物脂肪。其中以产脂微藻作为原料制备生物柴油，具有其他产脂生物无法比拟的优势：(1)微藻很容易繁殖并且培养的时间短，一般高等植物需要生长好几个月甚至几年才能完成一代，微藻繁殖一代的时间仅为2-5天；(2)微藻不像高等植物那样受气候、季节变化的影响，可保持纯培养，一年四季都可连续大规模生产，可保证原料供应充足；(3)微藻的生长繁殖是在水域中，不依靠土壤，可以在占地有限的设备上进行而得到高产，不与粮争地；(4)藻类所需酯化反应的条件相对较低，使生产成本降低，炼制工艺相对较为简单。
虽然产脂微藻是目前最好的生物柴油工业生产来源，但它的含油量不高，导致大规模培养微藻生产油脂成本昂贵，最终使得利用微藻制备生物柴油难以获得经济效益，产业化进程减缓。提高微藻细胞的油脂含量是目前降低成本的关键，有望从根本上解决生物柴油产业成本过高的瓶颈问题。因此，一直需要努力不懈的研究，以开发出产脂量及生物量更高的优良藻株，为单细胞油脂及生物柴油的工业生产提供具有竞争力的原材料。
为了提高微藻细胞的产脂量，过去的研究主要集中在以下几个方面：(1)培养基优化；(2)培养过程控制；(3)代谢工程方法改造藻株；(4)诱变选育高脂突变株。前两种方法虽然可在一定程度上有效促进藻细胞的产脂量，但提高的百分比数有限(通常提高20％以下)，仍无法满足产业化规模开发的要求。代谢工程方法改造微藻是解决藻细胞脂含量低的根本方法，需要全面考虑藻株的整体代谢网络的结构和调控特点，有待进一步进行研究。诱变育种方法研发成本低，选育过程简单、耗时少，是提高微藻细胞产脂量的有效途径。
发明内容
本发明目的在于提供一种小球藻突变株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种小球藻突变株：小球藻突变株已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.4917，分类名称小球藻Chlorella kessleri。
小球藻突变株的应用：所述小球藻突变株为单细胞油脂高脂突变株，可应用于生物柴油生产工艺中。
所述小球藻突变株的筛选过程：
1)将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的小球藻(Chlorellakessleri)采用EMS化学诱变处理；将小球藻接种到Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期，在培养至对数生长期的每毫升藻体内加入10-100μl EMS溶液，在黑暗条件下以18-35℃处理15-180min，而后加入EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应；
所述Kuhl培养基为：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵，pH 6.5。
2)将步骤1)诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养；即将诱变处理后藻体洗涤后观测其细胞浓度，根据细胞数将藻体稀释103-106倍，分别涂布到高脂定向筛选平板上，置于18-35℃的程控恒温培养箱中无光静置培养，筛选单细胞体积增大的藻体于Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡扩种继代培养至对数生长期。
3)将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进行诱导培养6-20天，待用；将扩种继代培养至对数生长期的藻体中加入50％葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至总体积500ml)至终浓度为30-60g/L，诱导培养6-20天，使藻细胞内脂的大量合成，而后用去离子水3000g低温离心洗涤，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。
4)取步骤3)藻体利用气相色谱(GC)测定突变株与野生株的脂含量，突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值大于110％，即突变株为单细胞油脂高脂突变株；将诱导培养后藻体中加入甲苯、1％硫酸—甲醇(体积比硫酸∶甲醇＝1∶99)和十九烷酸(C19:0)内标液混合均匀后，置于50-60℃振荡水浴过夜；取出，冷却后，加入5％NaCl水溶液和正己烷，混合均匀后，离心收集上层液体，向收集的上层液中加入2％KHCO3水溶液混合均匀，漩涡仪上混匀离心收集上层液体，用氮气吹干溶剂后，用正己烷定容，利用气相色谱(GC)测定突变株中脂含量。所述气相色谱条件为：采用分流模式，以氮气为载气；进样口温度为250℃；FID检测器温度为260℃；柱温箱的温度为以2.5℃/min的升温速率从140℃升至240℃。
经上述技术方案选育获得的高脂突变株小球藻(Chlorella kessleri)A1，已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.4917，分类名称小球藻Chlorellakessleri。
所述的小球藻(Chlorella kessleri)A1 CGMCC No.4917具有典型的绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属的特征性结构。在无菌BG-11、BBM、Basal、CZ-M1、Kuhl、KM1等培养液中、适宜条件下培养时，其营养细胞大小约5-10μm，球形，绿色，生长快速。
所述的小球藻(Chlorella kessleri)A1 CGMCC No.4917生理生化特征如下：
1.在BG-11、BBM、Basal、CZ-M1、Kuhl、KM1等自养培养基和异养培养基中均能生长，也可以混养培养。混养时生长最好。混养时最适的碳源是葡萄糖，最好的氮源是硝酸盐。较低的溶解氧有利于自养生长，而饱和的溶解氧有利于异养生长。适量的镁能改善其生长。
2.营养生长时以孢子繁殖的方式进行细胞增殖，比生长速率为0.025-0.065h-1，代时为27.72-10.66h；生长最适pH范围：4-10；生长最适宜温度：18-35℃；生长最适光照强度为20-150μmol m-2 s-1；摇床振荡培养时的最适转速100-200rpm。
3.在氮限制、磷或硫缺乏、盐胁迫等不利环境条件下，补给足够的碳源，Chlorella kessleri A1 CGMCC No.4917细胞迅速变大，脂合成速度加快，脂产量显著提高，产脂率可达2.93mg g-1 h-1，高达Chlorella kessleri野生株产脂率的2.14倍。碳水化合物含量也相应增加，但总蛋白含量下降。
4.细胞中主要色素为叶绿素a、b，新黄质，紫黄质，环氧玉米黄质，玉米黄质，叶黄素以及β-胡萝卜素。在高脂诱导、合成过程中，细胞的色素组成不变，各色素的比例随诱导及培养条件的不同而有所变化，但色素总量呈下降趋势。
5.在高脂诱导、合成过程中，细胞的呼吸速率上升，光合速率下降。
6.细胞中脂的主要成分：C16、C18系饱和和不饱和脂肪酸，为肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或几种。
本发明以小球藻的野生株系为材料，采用化学诱变，脂合成抑制剂筛选的诱变育种方法，结果得到了一个产脂率高达出发株2.14倍、生理生化特性稳定、具有稳定遗传性能的小球藻优良突变株。
本发明所具有的优点：本发明与现有的高脂微藻突变株选育方法区别在于，从诱变处理后的藻株中，直接选育耐受脂合成抑制剂的微藻突变株，因而避免了低脂突变株和脂含量变化不显著的突变株的干扰，实现了高脂突变株的定向筛选，避免了盲目性，因此大大提高了选育效率，减少了无用工作量，节约了研发成本和研发时间。
具体实施方式
以下结合实施例为本发明作进一步描述。
第一步、在无菌操作台上，挑取固体培养基上生长状态良好的原始野生株小球藻(Chlorella kessleri)藻落，接种到含10ml无菌Kuhl培养基的50ml三角瓶中，在温度为25℃，转速为150rpm，光照强度为100μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡培养。Kuhl培养基配方：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/L EDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵，加水至总体积1000ml，pH 6.5。
第二步、取第一步中生长至指数期的藻液，进行EMS化学诱变处理。在黑暗无菌条件下，取3ml藻液到有盖的无菌玻璃试管中，加入300μl EMS溶液(1M)，充分混匀。25℃处理30min，以处理0min作为空白对照。加入EMS溶液等体积无菌现配的硫代硫酸钠溶液(10％，w/v)终止诱变反应。
第三步、将第二步中诱变处理完毕的藻细胞分别用新鲜无菌Kuhl培养基离心(3000rpm，10min)清洗两次，收集沉淀将其悬浮在3ml新鲜无菌Kuhl培养基中，4℃避光存放。
第四步、观测第三步中悬浮液的细胞浓度，而后将第三步中悬浮液稀释至空白对照组细胞密度，空白对照组细胞密度约为1×103cells/ml，取100μl稀释的藻液涂布高脂定向筛选平板，将涂布了藻液的500个平板置于25℃的程控恒温培养箱中无光静置培养。
所述配制的高脂定向筛选平板为，配制含有15g/L琼脂的高起始C/N比(30g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾)的Kuhl培养基，于120℃下高压蒸汽灭菌20分钟后冷却至50℃，加入过滤灭菌后的脂合成抑制剂浅蓝菌素(Cerulenin)至终浓度为200μM，轻轻摇动混匀，倒制成高脂定向筛选平板。
第五步、将能够在第四步中生长的菌株与对照(原始小球藻)相比单克隆藻明显增大的单克隆藻落挑出，悬浮到装有3ml新鲜无菌Kuhl液体培养基的玻璃试管中，在温度为25℃，转速为150rpm，光照强度为100μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡培养，进行扩种继代培养；
第六步、将第五步中生长至指数期的藻液中加入已灭菌的50％葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至总体积500ml)至终浓度为50g/L，诱导藻细胞内脂的大量合成。
第七步、在第六步中诱导培养6天时，取50ml藻液，用去离子水3000rpm低温离心洗涤2次，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。
第八步、称取第七步中所述干藻粉20mg，加入1ml甲苯、2ml 1％硫酸—甲醇(体积比为硫酸∶甲醇＝1∶99)、0.8ml十九烷酸(C19:0)内标液，漩涡仪上混匀后，置于50℃振荡水浴过夜。取出，冷却后，加入5ml 5％NaCl水溶液、3ml正己烷，漩涡仪上混匀，离心收集上层液体，重复多次直至提取完全，向收集的上层液中加入6ml 2％KHCO3水溶液，漩涡仪上混匀，离心收集上层液体，用氮吹仪吹干溶剂后，用正己烷定容至1ml，去除杂质后转移入色谱进样瓶中，4℃保存。将样品中的有效脂肪酸提取并甲酯化以便利用气相色谱(GC)测定。
利用气相色谱(GC)法测定第八步所述提取液。色谱条件为：DB-23毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氮气为载气；采用分流模式，进样体积为1μl；进样口温度为250℃；FID检测器温度为260℃；柱温箱的温度为以2.5℃/min的升温速率从140℃升至240℃。通过比较脂肪酸甲酯与可信标准的停留时间来识别脂肪酸甲酯，并且通过比较脂肪酸甲酯与内标的峰面积对脂肪酸甲酯进行量化(参见表1)。
本实施例以小球藻(Chlorella kessleri)为原始株，经化学诱变剂EMS处理，高脂定向筛选平板初筛，获得80个高脂突变株新品系，经气相色谱法复筛，分析结果显示，这80个新品系确实全部为高脂突变株，其中突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值为110-150％的占9％，为150-200％的占43％，200％以上的占48％。
其中的一个新品系小球藻(Chlorella kessleri)A1，其目的产物脂的产脂率高达野生株的2.14倍，而生长状况与出发株一致，是一个理想的优良突变株，可应用于单细胞油脂及生物柴油的工业生产有一定的优势。该高脂突变株新品系于2011年5月27日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCC No.4917，该藻株命名为：小球藻(Chlorella kessleri)A1 CGMCC No.4917。小球藻(Chlorellakessleri)A1 CGMCC No.4917藻株的脂肪酸组成、各脂肪酸占总脂肪酸的比例、以及产脂率如下表1：
表1突变株A1诱导脂合成六天时脂肪酸组成及含量与野生株的比较。
  脂肪酸组成(％总脂肪酸)   野生株   突变株
  C14:0   1.42   1.33
  C16:0   20.87   24.68
  C16:1   3.20   1.23
  C16:2   4.41   0.54
  C16:3   1.79   0.98
  C18:0   2.64   9.34
  C18:1   11.40   20.40
  C18:2   31.86   20.31
  C18:3   22.40   21.18
  产脂率(mg g-1 h-1)   1.37   2.93
另外，将高脂突变株小球藻(Chlorella kessleri)A1 CGMCC No.4917藻株在扩种继代培养不同代数时其产脂率和比生长速率与原始野生株的比较如下表2。
比生长速率的测定方法：在藻细胞的指数生长期初期和后期，各取5ml藻液称细胞干重，以公式μ＝(LnNt-LnN0)/(t-t0)计算生长速率，μ为比生长速率，Nt为t时间的细胞干重值，N0为起始细胞干重值。
表2突变株A1继代培养时产脂率和比生长速率与野生株的比较。
Figure BSA00000548382300061

Claims (8)

1.一种小球藻突变株，其特征在于：小球藻突变株已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.4917。
2.一种权利要求1所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：所述小球藻突变株为单细胞油脂高脂突变株，可应用于生物柴油生产工艺中。
3.按权利要求2所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：所述小球藻突变株的筛选过程：
1)将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的小球藻(Chlorellakessleri)采用EMS化学诱变处理；
2)将步骤1)诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养；
3)将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进行诱导培养6-20天，待用；
4)取步骤3)藻体利用气相色谱(GC)测定其脂含量以及测定野生株的脂含量，突变株的脂含量与野生株的脂含量的比值大于110％，即突变株为单细胞油脂高脂突变株；其高脂突变株已于2011年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.4917。
4.按权利要求3所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：所述步骤1)将小球藻接种到Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期，在培养至对数生长期的每毫升藻体内加入10-100μl EMS溶液，在黑暗条件下以18-35℃处理15-180min，而后加入EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应；
所述Kuhl培养基为：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L  水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵，pH 6.5。
5.按权利要求3所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：将诱变处理后藻体洗涤后涂布到高脂定向筛选平板上，置于18-35℃的恒温培养箱中无光静置培养，筛选单细胞体积增大的藻体于Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m-2 s-1连续光照的摇床中振荡扩种继代培养至对数生长期。
6.按权利要求3所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：将扩种继代培养至对数生长期的藻体中加入50％葡萄糖母液至终浓度为30-60g/L，诱导培养6-20天，使藻细胞内脂的大量合成，而后用去离子水3000g低温离心洗涤，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理24h，得到干藻粉。
7.按权利要求3或6所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：将诱导培养后藻体中加入甲苯、1％硫酸—甲醇和十九烷酸(C19:0)内标液混合均匀后，置于50-60℃振荡水浴过夜；取出，冷却后，加入5％NaCl水溶液和正己烷，混合均匀后，离心收集上层液体，向收集的上层液中加入2％KHCO3水溶液混合均匀，漩涡仪上混匀离心收集上层液体，用氮气吹干溶剂后，用正己烷定容，利用气相色谱(GC)测定突变株中脂含量。
8.按权利要求3所述的小球藻突变株的应用，其特征在于：所述气相色谱条件为：采用分流模式，以氮气为载气；进样口温度为250℃；FID检测器温度为260℃；柱温箱的温度为以2.5℃/min的升温速率从140℃升至240℃。
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