CN102861343A

CN102861343A - 分泌型Klotho在制备治疗慢性肾脏病的药物中的应用

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Publication number: CN102861343A
Application number: CN2012103942227A
Authority: CN
Inventors: 刘友华; 周丽丽
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明涉及一种抗衰老基因片段及其蛋白产物在治疗慢性肾脏病中的用途，具体是涉及分泌型Klotho基因及其蛋白在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。本发明的实验表明，分泌型Klotho具有显著抑制肾脏组织纤维化和慢性肾脏病进展的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备治疗慢性肾脏病的药物，尤其是用于制备能有效抑制和延缓慢性肾脏病进展的药物。

Description

分泌型Klotho在制备治疗慢性肾脏病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种抗衰老基因片段及其蛋白产物在治疗慢性肾脏病（CKD）中的用途，具体是涉及分泌型Klotho基因及其蛋白在制备治疗CKD药物中的用途。

背景技术

慢性肾脏病（CKD）最终进展至终末期肾功能衰竭（ESRD），患者终身依赖“肾脏替代治疗”来维持生命。在过去的几十年中，伴随着人类社会的人口老龄化，CKD患病率呈现逐年上升趋势（Nat Rev Nephrol, 2011, 7: 684-696）。有资料表明，CKD正成为一种“公众健康问题”，严重危害人类健康并消耗大量卫生资源。然而，目前临床上尚缺乏有效延缓CKD进展的药物。针对CKD的发病机制，寻找有效地抑制或延缓CKD进展的药物无疑是当前肾脏病学界的当务之急，成为亟待攻克的战略重点之一。

近期研究显示，衰老正成为CKD一个独立的危险因素（Nat Rev Nephrol, 2011, 7: 706-717），提示这两者可能存在密切的联系。因此，研究衰老与CKD发病相关的内在机制具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。近期研究和发明人预实验的结果均显示，Klotho作为一种新近发现的抗衰老蛋白（Ageing Res Rev, 2009, 8: 43-51），在正常的肾小管（包括近端小管、远端小管和集合管）上皮细胞中高度表达（Cell Struct Funct, 2004, 29: 91-99），而在CKD疾病状态下呈现明显丢失（J Am Soc Nephrol, 2011, 22: 124-136）。Klotho蛋白有两种亚型，跨膜型（130 kDa）和分泌型（65 kDa）。研究表明分泌型Klotho类似于一种内分泌激素，可通过血液循环到达远处组织发挥作用（Adv Exp Med Biol, 2012, 728: 126-157）。这些结果提示，分泌型Klotho作为一种特殊的抗衰老因子，它的丢失可能在肾脏疾病的发生发展中具有非常重要的作用。

人类Klotho基因（GenBank：BAA23382.1）编码含有1012个氨基酸的含有单一跨膜区的膜蛋白。分泌型Klotho基因仅编码Klotho氨基末端的信号肽和KL1结构域（包含Klotho蛋白的1-500氨基酸），但缺失KL2结构域、跨膜区和胞内结构域。分泌型Klotho主要通过两种方式产生，即mRNA转录后的替代剪切、或者全长Klotho蛋白在转译后胞外区域的剪切脱落。研究表明分泌型和全长序列Klotho在慢性肾脏病发生发展过程中都严重丢失。

单侧输尿管结扎（UUO）和阿霉素肾病（ADR）是经典的CKD动物模型，UUO模型的特点是可以快速完整地展示梗阻侧肾小管间质纤维化的不同病理阶段和特征，包括炎细胞浸润、小管细胞的增殖和凋亡、上皮-间充质细胞转化、肌成纤维细胞标志蛋白平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）的表达、纤连蛋白（Fibronectin）和I型胶原（Collagen I）的沉积。ADR肾病是目前常用的模拟人类肾小球疾病的模型，其特点是大量蛋白尿、肾小管内管型、肾小管塌陷、进行性局灶节段硬化（FSGS）和球性硬化、严重肾间质纤维化和炎症形成。

在病理上，通常采用Masson染色，来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。而更具体的组织纤维化则常常应用肌成纤维细胞标志蛋白平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白和I型胶原的免疫染色和免疫印迹方法（western blotting）来定性、定量观察和评估。

发明内容

本发明的目的在于提供分泌型Klotho基因及其蛋白的新的用途。

本发明的一个方面涉及分泌型Klotho基因在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物包括：编码分泌型Klotho蛋白的基因，以及药学上可接受的辅料。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物包括：包含所述编码分泌型Klotho蛋白的基因的表达载体，以及药学上可接受的辅料。

本发明的另一个方面涉及分泌型Klotho蛋白在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物包括：分泌型Klotho蛋白，以及药学上可接受的辅料。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物包括：表达分泌型Klotho蛋白的表达载体，以及药学上可接受的辅料。

本发明对分泌型Klotho基因及其蛋白进行单侧输尿管梗阻（UUO）肾病模型和阿霉素（ADR）肾病模型实验。结果表明：与UUO或ADR模型组比较，尾静脉注射分泌型Klotho组肾脏间质胶原沉积显著减少，平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白及I型胶原均显著降低，Wnt/β-catenin下游靶基因表达明显下调，表明分泌型Klotho蛋白能有效抑制UUO和ADR肾脏组织纤维化，拮抗Wnt/β-catenin信号通路。本发明的实验也证明，分泌型Klotho蛋白在小鼠动物实验中无明显毒副作用。因此，分泌型Klotho基因及其蛋白具有显著抑制肾脏组织纤维化和CKD进展的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备治疗CKD的药物，尤其是用于制备能有效抑制和延缓CKD进展的药物。

附图说明

图1是Klotho蛋白与多种Wnt蛋白结合免疫共沉淀图。其中，图1A：Klotho与Wnt 1结合；图1B：Klotho与Wnt 4结合；图1C：Klotho与Wnt 7a结合；图1D：Klotho抑制Wnt所介导的基因转录。

图2是UUO模型各组小鼠肾脏Masson染色图。该图中，左：假手术组；中：UUO模型组；右：UUO+Klotho组。

图3是检测UUO模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；UUO：模型对照组；UUO+Klotho：用药组。

图4是检测UUO模型各组小鼠肾组织β-catenin及其下游靶基因蛋白水平的免疫印迹图。其中，图4A为免疫印迹检测的代表性结果；图4B为所有结果的统计图。Sham：假手术组；UUO：模型对照组；UUO+Klotho：用药组。

图5检测ADR模型各组小鼠肾脏PAS染色图。该图中，左：生理盐水组；中：ADR模型组；右：ADR+Klotho组。

图6检测ADR模型各组小鼠肾脏MASSON染色图。该图中，左：生理盐水组；中：ADR模型组；右：ADR+Klotho组。

图7是检测ADR各组小鼠肾脏纤连蛋白的免疫染色图。该图中，左：生理盐水组；中：ADR模型组；右：ADR+Klotho组。

图8是免疫印迹法检测各组小鼠肾脏β-catenin及其下游靶基因蛋白水平的代表图。其中，图8A为免疫印迹检测的代表性结果；图8B为所有结果的统计图。正常对照组：生理盐水组；ADR：模型对照组；ADR+Klotho：用药组。

图9是检测Klotho质粒注射前后小鼠肾脏和肝脏组织结构的病理染色图。

图10是检测Klotho质粒注射前后小鼠尿白蛋白的代表图。

图11是检测Klotho质粒注射前后小鼠血清肌酐的代表图。

具体实施方式

下面仅以实施例的方式结合附图对本发明做进一步的说明。

实施例一： Klotho蛋白与多种Wnt蛋白相结合并抑制Wnt/β-catenin信号通路活性

1. 实验材料：

细胞：小鼠肾小球足细胞（美国Peter Mundel教授馈赠，参见其论文Exp. Cell Res. 236: 248-258, 1997）。

分化培养液：含10%FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液。

增殖培养液：在上述培养液中再加入50u/ml重组小鼠IFN-γ。

增殖培养方法：细胞传代培养于33^oC含5%CO₂培养箱，隔天换液。

分化培养：诱导分化，足细胞被转移到分化培养液，37^oC含5%CO₂培养箱，使足细胞分化10-14天使用，隔天换液1次。

2. 实验处理：

实验前将培养于无抗生素的增殖培养液中足细胞，以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板，在分化培养液培养2天，分别共转染分泌型Klotho质粒（购于美国Addgene公司）和不同的Wnt表达质粒（购于美国Upstate Biotechnology公司），24小时后收取蛋白，进行免疫共沉淀实验。

3. 实验结果：

实验结果如图1A至图1D所示，Klotho蛋白可与多种Wnt蛋白（包括Wnt 1、Wnt 4、Wnt 7a）结合，共转染Klotho质粒能够抑制Wnt所介导的基因转录活性。

通过本实施例的实验结果发现：分泌型Klotho蛋白可与肾小球足细胞和肾小管上皮细胞中的多种Wnt蛋白相互结合，抑制其下游的β-catenin的激活，从而抑制Wnt/β-catenin 信号通路的活性。因此，分泌型Klotho蛋白作为一种新颖的、内源性的Wnt拮抗剂，阻断体内关键的促纤维化信号通路，从而抑制CKD进展过程中肾组织损伤和肾脏纤维化、延缓或/和逆转CKD的病程。

实施例二： Klotho蛋白对UUO小鼠肾脏纤维化的抑制

1. 实验动物：CD-1小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠21只，随机分为3组，每组7只。包括假手术组、模型对照组及用药组。

2. 实验分组

1）假手术组：室温，3%戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左背侧肋缘下1-2cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后随即逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

2）模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3）用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3. 实验过程

Klotho表达质粒（来源同实施例一）用生理盐水稀释。各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。用药组予以UUO开始前一天以含有1mg/kg体重的Klotho 质粒的2ml生理盐水尾静脉注射。饲养7天后杀死各组小鼠，均取左侧肾脏，分别予以10%中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白及I型胶原免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法（Western Blot）检测β-catenin及其靶基因表达水平。

4. 实验结果

（1）Masson染色检测肾脏组织纤维化程度

I、Klotho蛋白减少UUO小鼠肾间质胶原沉积

实验结果如图2所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。

II、Klotho蛋白减少UUO小鼠肾间质纤维化

实验结果如图3所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾间质纤连蛋白、I型胶原、 III型胶原、平滑肌肌动蛋白α水平明显降低。

III、Klotho蛋白抑制UUO小鼠的异常活化的β-catenin信号通路

实验结果如图4A和图4B所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白Snail 和PAI-1明显降低。

实施例三： Klotho蛋白对ADR小鼠肾脏纤维化的抑制

1. 实验动物：BABL/c小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠21只，随机分为3组，每组7只。包括生理盐水组、模型对照组及用药组。

2. 实验各组

1）生理盐水组：室温，尾静脉注射生理盐水2ml。

2）模型对照组：阿霉素溶解于生理盐水，10mg/kg体重尾静脉一次注射。

3）用药组：于阿霉素注射后1周注射含有1mg/kg体重的Klotho 质粒（来源同实施例一）的2ml生理盐水尾静脉注射，隔一周后再次注射，共注射2次。

3. 实验过程

各组分笼饲养。每周留取尿液标本并称量体重。饲养3周后杀死各组小鼠，均取左侧肾脏，分别予以10%中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白及I型胶原免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法（Western Blot）检测β-catenin及其靶基因表达水平。

4. 实验结果

（1）Masson染色检测肾脏组织纤维化程度

I、 Klotho蛋白减轻ADR小鼠肾组织形态改变

实验结果如图5所示，用药组小鼠肾组织形态趋于正常，未见大量肾小球硬化，肾小管管型及肾小管塌陷等病理改变。

II、Klotho蛋白减少ADR小鼠肾间质胶原沉积

实验结果如图6所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。

III、Klotho蛋白减少ADR小鼠肾间质纤维化

实验结果如图7所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾组织纤连蛋白水平明显降低。

、Klotho蛋白抑制ADR小鼠的异常活化的β-catenin信号通路

实验结果如图8A和图8B所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白Snail明显降低。

实施例四： Klotho蛋白对小鼠无明显毒副作用

1. 实验动物：CD-1小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠6只，随机分为2组，每组3只。包括生理盐水注射组、Klotho质粒注射组。

3. 实验分组

1）生理盐水注射组：2ml生理盐水尾静脉注射。

2）Klotho质粒注射组：含1mg/kg体重的Klotho 质粒的2ml生理盐水尾静脉注射。

3. 实验过程

Klotho表达质粒（来源同实施例一）用生理盐水稀释。对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。Klotho质粒注射组予以含有1mg/kg体重的Klotho 质粒的2ml生理盐水尾静脉注射。24小时后杀死各组小鼠。各组小鼠分别于实验前和实验后留取尿液，血液标本。均取左侧肾脏和肝脏组织，分别予以10%中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，予以PAS染色观察组织结构。尿液和血液样本用于测量尿白蛋白和血清肌酐。

4. 实验结果

（1）PAS染色检测肾脏组织和肝脏组织结构

实验结果如图9所示，Klotho蛋白对小鼠肾脏组织和肝脏组织结构无影响。

I、Klotho蛋白不影响肾脏组织结构

实验结果如图9-I所示，与生理盐水组比较，Klotho组肾脏组织结构清晰，未发现炎性细胞、组织结构破坏等毒性表现，与生理盐水组无差异。

II、Klotho蛋白不影响肝脏组织结构

实验结果如图9-II所示，与生理盐水组比较，Klotho组肝脏组织结构清晰，未发现炎性细胞、组织结构破坏等毒性表现，与生理盐水组无差异。

（2）实验结果如图10，尿白蛋白检测显示Klotho质粒注射前后无差异。

（3）实验结果如图11，血清肌酐检测显示Klotho质粒注射前后无差异。

综合上述实施例所述，Klotho蛋白可以明显减少UUO和ADR小鼠肾间质胶原蛋白沉积，显著降低UUO模型和ADR模型小鼠肾组织纤连蛋白、I型胶原、III型胶原、平滑肌肌动蛋白α表达水平，并可以明显抑制CKD模型中的异常活化的β-catenin信号通路。而且，实验也证明，分泌型Klotho蛋白在小鼠动物实验中无明显毒副作用。因此，Klotho基因及其表达的Klotho蛋白可用于制备治疗CKD的药物，尤其是用于制备能有效抑制和延缓CKD进展的药物。

需要说明的是，上述实施例均采用Klotho 质粒即包含所述编码分泌型Klotho蛋白的基因的表达载体来进行实验，其产生活性作用的物质是由编码分泌型Klotho蛋白的基因所表达的分泌型Klotho蛋白。

本发明的实验表明，Klotho 质粒可在体内表达出有活性的分泌型Klotho蛋白，由此可以补充外源性的分泌型Klotho蛋白产物，从而应用于治疗慢性肾脏病。分泌型Klotho基因及其蛋白均可用于制备治疗慢性肾脏病（CKD）的药物。该药物可包括：编码分泌型Klotho蛋白的基因，以及药学上可接受的辅料。该药物也可包括：包含所述编码分泌型Klotho蛋白的基因的表达载体，以及药学上可接受的辅料。该药物也可包括：分泌型Klotho蛋白，以及药学上可接受的辅料。该药物也可包括：表达分泌型Klotho蛋白的表达载体，以及药学上可接受的辅料。

Claims

1.分泌型Klotho基因在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物包括：编码分泌型Klotho蛋白的基因，以及药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物包括：包含所述编码分泌型Klotho蛋白的基因的表达载体，以及药学上可接受的辅料。

4.分泌型Klotho蛋白在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物包括：分泌型Klotho蛋白，以及药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物包括：表达分泌型Klotho蛋白的表达载体，以及药学上可接受的辅料。