CN102827814A

CN102827814A - 抗氧化剂的制造方法

Info

Publication number: CN102827814A
Application number: CN2011101706403A
Authority: CN
Inventors: 孔凡旗
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明涉及抗氧化剂的制造方法。本发明提供一种抗氧化剂的制造方法，其中，在含有豆渣的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，从其上清液中得到抗氧化剂。本发明还提供由上述制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化剂。根据本发明的制造方法，能够利用特定微生物，以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原料，从而低成本且高效地获得抗氧化剂。

Description

抗氧化剂的制造方法

技术领域

本发明涉及抗氧化剂的制造方法以及由该制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化剂。

背景技术

SOD是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)的英文缩写，是人体内合成的一种抗氧化酶。SOD通过将人体内由于各种原因而产生的有害的超氧自由基分解为过氧化氢(活性氧的一种)，再由过氧化氢酶和过氧化物酶的作用将过氧化氢进一步分解为完全无害的水和氧，从而具有降低体内活性氧浓度的效果，以及对于由活性氧引起的皮肤变粗糙和斑点、皱纹等具有预防、改善作用。因而，一直以来，作为防止老化的方法，SOD制品被广泛地应用于食品、化妆品、医药品等领域。然而，现有的SOD制品大都来源于动物，不但代价昂贵而且不稳定，使得其适用范围受到限制。

因此，近年来，取而代之，人们对与SOD具有相同作用且安全的抗氧化物质进行了大量研究。例如，已提出了白桦提取组合物(参照专利文献1)以及以七叶树籽的提取物为有效成分的SOD活性化剂(参照专利文献2)等。然而，由于这些SOD活性化剂全都是从植物原料提取得到，该提取操作耗费时间长，且由于天然资源的利用可能性有限等原因，其制造成本高。

另外，除了来自植物的抗氧化物质以外，乳酸菌等的发酵物也被发现具有抗氧化效果。例如，专利文献3中提出了对于大范围的过氧化物具有分解特性的来自乳酸菌的培养物。然而，该培养物仅仅是从豆曲等分离源分离乳酸菌、并培养，从所得到的培养物回收菌体，而得到的含有该菌体的菌体悬浊液，对于过氧化氢等过氧化物具有分解特性。对于过氧化物的分解有可能是由还原性物质引起的分解，因而并不一定是由SOD引起的分解。

此外，专利文献4、5中提出了来自纳豆菌发酵番石榴叶的抗氧化物质。然而，从其实施例可以看出，只使用番石榴提取物(试样1)和只使用米糠、大豆发酵物(试样2)时的SOD活性都低，其活性氧清除效果不充分。而且，由于番石榴叶的获得受季节限制，因而该方法同样在实际使用上存在困难。

如上所述，现有技术中，在具有活性氧清除效果的物质中，还没有发现既具有高SOD活性又能够实用化的物质。

专利文献1：日本特开2008-88109号公报

专利文献2：日本特开2007-291069号公报

专利文献3：日本特开2009-191276号公报

专利文献4：日本特开2004-24004号公报

专利文献5：日本特开2004-43505号公报

发明内容

本发明正是为了解决上述现有技术中存在的问题而做出的。本发明的目的在于提供一种抗氧化剂的制造方法以及由该制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化剂，所述制造方法通过在含有豆渣的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，特别是培养地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，从而低成本且高效地得到具有高SOD活性的抗氧化剂。

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了悉心研究，结果发现：在含有豆渣的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，特别是培养地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，能够低成本且高效地获得具有高SOD活性的抗氧化剂，从而完成了本发明。

本发明涉及提供一种抗氧化剂的制造方法，其中，在含有豆渣的培养基中培养地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，从其上清液中得到抗氧化剂。

本发明还涉及提供根据上述抗氧化剂的制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化剂。

本发明还涉及豆渣的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的发酵提取物作为抗氧化剂的用途。

本发明还涉及提供豆渣的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的发酵提取物在制造抗氧化剂中的用途。

本发明还涉及提供配合有上述抗氧化剂的食品、化妆品、医药品。

发明效果

根据本发明所涉及的抗氧化剂的制造方法，能够利用特定微生物，以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原料，低成本且高效地得到抗氧化剂，该抗氧化剂具有活性氧清除效果，安全性优异，容易操作，因而能够用于食品、化妆品、医药品等领域。

具体实施方式

本发明中所使用的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)是普遍存在土壤和水中，能够产生碱性磷酸酶、β-内酰胺酶等各种各样酶的细菌。还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。这些微生物如下所述发挥作用，通过在含有豆渣的培养基中培养，从而从其上清液中可以得到具有高SOD活性的抗氧化剂。

本发明所涉及的芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物都可以从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、江南大学工业微生物资源和信息中心(CICIM)等商业渠道购买得到。

本发明的抗氧化剂的制造方法通过在含有豆渣的培养基中，培养上述微生物，并从其上清液中得到抗氧化剂。该方法的具体步骤如下所示。

<培养基>

在本发明中，液体培养基的主要成分是豆渣，其他成分还有糖类和水等，也可以适当添加蛋白胨、酵母粉。由于豆渣是容易获得的物质，因而，本发明的培养基具有成本低的优点。

其中，豆渣是指，将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后，再经粉碎、过滤除去水而得到的物质；也可以使用食品产业中压榨豆浆等的豆制品制造后剩下的豆渣。

作为糖类，可以单独使用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等中的任意一种，或者混合使用。从提高发酵生产性和利用性的观点出发，其中优选葡萄糖。

在本发明中，为了提高SOD活性，本发明的培养基优选由豆渣、葡萄糖和水构成，进一步优选培养基中的豆渣的含量为5～15w/v％、更优选为8～12w/v％，特别优选为10w/v％。豆渣的含量在该范围时才能得到高SOD活性。并且，从该观点出发，葡萄糖的含量优选为0.2～2w/v％，更优选为0.8～1.2w/v％。

下面，将上述这种用于制造抗氧化剂的培养基称为“抗氧化剂制造培养基”。

<发酵培养条件>

在发酵培养过程中，可以使用上述微生物中的1种或2种以上。在使用2种以上微生物的情况下，可以将微生物顺次或同时添加到抗氧化剂制造培养基中使其发酵。

作为用于制造抗氧化剂的发酵培养条件，从最优化芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的成长所必需的温度、时间，以及提高SOD活性的观点出发，优选在20～40℃、更优选在27～35℃的培养温度下，培养1～7天，优选培养48～96小时，更优选培养68～76小时。

<抗氧化剂的回收、精制>

根据本发明的制造方法得到的抗氧化剂是通过离心分离等从培养液除去菌体，回收离心后的培养上清液得到的豆渣发酵提取物。在本发明中，可以将豆渣发酵提取物直接作为抗氧化剂使用，也可以通过适当的公知的分离、精制方法，例如，通过超过滤、硫酸铵分级沉淀等进一步精制后使用。对于分离、精制方法没有特别限定。

本发明中的抗氧化剂(以下有时也称为“活性氧清除剂”)的抗氧化效果，即活性氧清除效果，由测定SOD活性值来确认。SOD活性值越大，SOD活性越高，提高消除活性氧的能力，从而能够抑制由皮肤氧化引起的老化等。本发明中的“高SOD活性”是指，根据下述实施例的方法测定计算的SOD活性值为75％以上。在此我们规定，本发明的抗氧化剂(活性氧清除剂)的SOD活性为75％以上且小于100％时，是中等的高SOD活性，而SOD活性为100～120％时，是更高的高SOD活性。

如下述实施例所示，通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物得到的豆渣发酵提取物具有高SOD活性。通过使用该发酵提取物，可以得到抗氧化、抗老化等优异的活性氧清除效果。

因此，通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物得到的豆渣发酵提取物，可以作为治疗目的或非治疗目的的抗氧化剂(活性氧清除剂)使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用，或为维持健康状态的使用等。并且，所述抗氧化剂(活性氧清除剂)的治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。

另外，通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物得到的豆渣发酵提取物，还可以用于制造抗氧化剂(活性氧清除剂)。

本发明的抗氧化剂(活性氧清除剂)具有极高的活性氧清除效果，同时安全性极高，可以用于预防或改善由生物体内活性氧量的增大所引起的高血压、动脉硬化、糖尿病及癌症等疾病、以及成为美容方面障碍的诸多症状。本发明的抗氧化剂(活性氧清除剂)可以直接使用上述豆渣发酵提取物，也可以在不影响效果的范围内，将其制成制剂配合于通常的食品、化妆品或医药品中，赋予活性氧清除效果，提高商品价值。

另外，作为食品形态，例如，可以采用蛋糕、巧克力、口香糖、糖、饮料等通常的食品形态。作为化妆品形态，例如，可以制成化妆水、乳液、凝胶剂、精华剂、面膜、冲洗剂、沐浴剂、粉底、口红、软膏等适用于皮肤的皮肤外用剂。另外，作为医药品形态，例如，可以制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、液剂、乳剂、注射液等。这些食品、化妆品和医药品中可以根据目的使用对应的其他任意成分。

本发明的抗氧化剂(活性氧清除剂)的配合量，可以根据其使用形态进行适当变化，相对于食品、化妆品、医药品等的总量，换算为固形物，优选配合0.01～10w/v％，更优选配合0.01～1w/v％。当配合量小于0.01w/v％时难以得到充分的活性氧清除效果；而当配合量大于10w/v％时，其效果反而不会提高且不经济。此外，作为添加方法，可以预先添加，也可以在制造工程中添加，可以考虑操作性进行适当选择。

实施例

下面，基于实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

(抗氧化剂(活性氧清除剂)的制造)

实施例1～实施例5

作为从豆渣制造抗氧化剂(活性氧清除剂)的微生物，使用以下表1所示的芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物。

表1

^*上述微生物都从江南大学获得，并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM。

将在YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基中30℃下培养后得到的上述菌株接种到含有抗氧化剂制造培养基100ml的三角烧瓶(容量300ml)中，在30℃下培养72小时。该培养基含有10w/v％豆渣和1w/v％葡萄糖。其中，豆渣的制备通过将大豆放入水中浸泡12小时，使大豆充分吸收水分，然后将吸收了水分的大豆研磨破碎，过滤并除去液体成分后，将剩余残渣沥干来得到。

然后，对得到的培养液以3000rpm离心分离10分钟除去菌体，回收培养上清液，将其分别作为试样1～5(分别对应于实施例1～5)。

另外，只由培养基(没有接种微生物)，在与试样1～5同样条件下培养、处理，回收上清液作为对照品，用于测定SOD活性。

(SOD活性的测定)

使用超氧化物歧化酶检测试剂盒(SOD ASSAY KIT-WST，同仁化学研究所制)，在96孔板中测定如上所述得到的试样1～5和对照品的SOD活性值。使用试剂盒中附带的试剂。

将上述试样1～5和对照品作为待测样品，移取20μl在96孔板的“样品”孔和“空白对照2”孔中，在“空白对照1”孔和“空白对照3”孔中添加20μl无菌水。然后，在各孔中分别添加200μl WST工作液，充分混匀。在“空白对照2”孔和“空白对照3”孔中分别添加20μl稀释缓冲液。再在“样品”孔和“空白对照1”孔中分别加入20μl酶工作液，充分混匀。以37℃加热20分钟，进行孵育，然后，将孔板放入酶联免疫斑点自动图像分析仪Bioreader中，测定450nm处的吸光度。

接着，按如下公式计算SOD活性值，示于表2和表3。其中，将SOD活性值为64.11％以上且小于75％记为△，表示具有一般SOD活性；将75％以上且小于100％记为○，表示具有中等的高SOD活性；将100～120％记为◎，表示具有更高的高SOD活性。另外，SOD活性值越高，表示抗氧化活性越高。

SOD活性(％)＝[(A_B1-A_B3)-(A_S-A_B2)]/(A_B1-A_B3)×100

A_S：由“样品”孔测定的加入待测样品反应时的吸光度

A_B1：由“空白对照1”孔测定的没有添加待测样品反应时的吸光度

A_B2：由“空白对照2”孔测定的待测样品本身的吸光度

A_B3：由“空白对照3”孔测定的孔板本身及稀释缓冲液的吸光度

表2

对照品	1	2	3	4	5	平均
							SOD活性(％)	63.18	51	68	75	63.39	64.11

表3

*注：◎表示具有更高的高SOD活性，○表示具有中等的高SOD活性。

从上述结果可以确认，在实施例1～5中得到的试样都具有高SOD活性。

因此，确认了本发明的豆渣发酵提取物具有高SOD活性，活性氧清除效果优异，可以作为抗氧化剂(活性氧清除剂)使用

产业上的利用可能性

综上所述，本发明的使用芽孢杆菌属(Bacillus)微生物由豆渣发酵得到的抗氧化剂的活性氧清除效果优异，可以用于化妆品、食品、医药等领域。

Claims

1.一种抗氧化剂的制造方法，其中，

在含有豆渣的培养基中培养地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，从其上清液中得到抗氧化剂。

2.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

所述培养基中所述豆渣的含量为5～15w/v％。

3.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

所述培养基中所述豆渣的含量为8～12w/v％。

4.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

所述培养基中所述豆渣的含量为10w/v％。

5.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

所述培养温度为27～35℃。

6.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

所述培养时间为1～7天。

7.如权利要求1所述的抗氧化剂的制造方法，其中，

将通过所述培养获得的培养液进行离心，从而得到所述上清液作为抗氧化剂。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的抗氧化剂的制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化剂。

9.如权利要求8所述的抗氧化剂，其中，

所述抗氧化剂的SOD活性为75～120％。

10.如权利要求8所述的抗氧化剂，其中，

所述抗氧化剂的SOD活性为75％以上且小于100％。

11.如权利要求8所述的抗氧化剂，其中，

所述抗氧化剂的SOD活性为100～120％。

12.豆渣发酵提取物作为抗氧化剂的用途，其中，

所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)得到的。

13.豆渣发酵提取物在制造抗氧化剂中的用途，其中，

14.一种食品，其特征在于，

配合有如权利要求8～11中任意一项所述的抗氧化剂。

15.一种化妆品，其特征在于，

配合有如权利要求8～11中任意一项所述的抗氧化剂。

16.一种医药品，其特征在于，

配合有如权利要求8～11中任意一项所述的抗氧化剂。