CN102808031B - 检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组用于检测分枝杆菌及鉴别致病分枝杆菌的五重mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，包括核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的五对引物，以及作为阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的PCR扩增产物。本发明还提供了一种利用上述核酸的试剂盒及检测方法，其特异性好，灵敏度高，操作简单，高通量，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种同步检测分枝杆菌感染及鉴别结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的五重mPCR-DHPLC方法。
背景技术
分枝杆菌属（Mycobacterium），除结核分枝杆菌复合群（包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）和麻风分枝杆菌外，统称为非结核分枝杆菌。据目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共200多种。
结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织（WHO）专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）是人及哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌（又称人型结核分枝杆菌，Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis），牛分枝杆菌（牛型结核分枝杆菌，Mycobacteriumbovis，M.bovis），卡介苗BCG（Mycobacterium bovis BCG，BCG），非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum，M.africanum）和田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti，M.microti）。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。
与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。临床上，各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性；因此，鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。由于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性，因此准确鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。
鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌，在结核分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病原，也可感染人。它是一种机会性细菌，在AIDS病人细菌感染合并症中占第一位；在抗酸菌中对化疗药物耐药性最强，并广泛存在于天然土壤和水中。
副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）是引起牛、羊、羊驼等动物副结核病的病原。副结核病自1895年首次被报道后，现已广泛流行于世界各国。2002年韩国某地区调查研究显示162个奶牛场中存在副结核病流行；在我国该病分布广泛，感染率在近年有上升趋势，部分地区甚至达44.8%，严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、隔离、淘汰病畜等方法。
2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳性肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86.4%，牛结核分枝杆菌占2.5%，非结核分枝杆菌占11.1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4.9%，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需1～2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法，大体上可分为3类：第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附实验（ELISA）和补体结合实验（CF）方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。
由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长（常需数周时间），传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是世界动物卫生组织（OIE）推荐的牛结核病诊断方法，也是目前在进出境动物检疫、牛结核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因，常造成非特异性反应。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了结核、副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。世界卫生组织于2006年10月发表报告指出，世界迫切需要投资研究更有效和费用更低的结核病诊断方法，尽早发现病情尽早治疗，以减少这种疾病对人类、特别是对发展中国家人口的危害。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列（分枝杆菌通用型检测引物），一组鉴别多种致病分枝杆菌群（种）的核苷酸序列。
本发明的又一目的在于，提供一种同步检测分枝杆菌及鉴别多种重要致病分枝杆菌群（种）的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：检测分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对，其中一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；另一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示；鉴别副结核分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；鉴别鸟分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14所示。
一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸包括：核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的检测分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.9所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的副结核分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.12所示的PCR扩增产物；核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.15所示的PCR扩增产物。
一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
PCR缓冲液；
检测分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
检测分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.7所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.8所示；
鉴别副结核分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；
鉴别副结核分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.11所示；
鉴别鸟分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；
鉴别鸟分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；
dNTP；
MgCl2；
Pfu快速高保真聚合酶；
双蒸水；
阴性对照：灭菌生理盐水；
阳性对照：携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示；所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体。
一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法：
（1）采集样品并提取核酸：本发明可检测细菌培养液、动物活体采集的样品如血液、奶液、痰液和粪便等，以及通过剖检采集的组织样品，如淋巴结等；采集到的样品通过蛋白酶K消化、高温裂解之后用氯仿抽提提取核酸。
（2）在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号，放入PCR仪中扩增；
其中，优选的PCR反应体系如下：
优选的PCR反应条件如下：
第一步：95℃2分钟；第二步：95℃5秒，62℃5秒，68℃5秒，40个循环；第三步，72℃1分钟；
（3）在DHPLC仪器上，DHPLC的反应条件为：在非变性分析模式下，柱温为50°C，采用双链DNA多片段（double stranded multiple fragment）分析模式，清洗模式采用active，样品进样量设为10μL，分析检测过程仪器梯度参数由Navigator software分析软件设定，按照以下条件进行DHPLC分析：
| 时间 | 缓冲液A（%） | 缓冲液B（%） | 缓冲液D（%） |
| 0 | 46.3 | 53.7 | - |
| 0.5 | 41.3 | 58.7 | - |
| 5 | 32.3 | 67.7 | - |
| 5.1 | 0 | 0 | 100 |
| 5.6 | 0 | 0 | 100 |
| 5.7 | 46.3 | 53.7 | - |
| 6.6 | 46.3 | 53.7 | - |
其中，缓冲液A的成分为0.1mol/L TEAA，缓冲液B为0.1mol/L TEAA加入25%（V/V）乙腈，缓冲液D为75%（V/V）乙腈；
阴性对照为灭菌生理盐水；
阳性对照为携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示；所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体；
（4）分析、判定结果：本发明结果判定标准为：样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰位置一致，且阴性对照无相应的洗脱峰，则样品为阳性。
本发明的有益效果在于，
本发明提供了一种同步快速检测分枝杆菌感染及鉴别多种致病分枝杆菌群（种）感染的五重mPCR-DHPLC检测方法，其具有以下特点：
（1）特异性好，分枝杆菌的16s rRNA基因具有种属特异性，具有很高的准确性，假阳性率低；结核分枝杆菌复合群特异性序列IS6110和IS1081、鸟分枝杆菌特异性序列IS1245和副结核分枝杆菌的F57基因具有种特异性，可以快速鉴别致病分枝杆菌。
（2）灵敏度高，采用灵敏的紫外或荧光检测系统进行检测；
（3）操作简单，自动化程度高，替代了传统的产物电泳检测等人工操作步骤；
（4）全程仅通过一次PCR反应，不仅可以检测分枝杆菌，同时可以鉴别致病分枝杆菌，相对单重PCR既节约了试剂成本，又降低了工作量。
（5）高通量，一次可以全自动检测192份样品。
本发明提供的快速检测分枝杆菌及致病分枝杆菌的高通量鉴别方法，适用于医疗和公共卫生、动物分枝杆菌疫病疫情防控、食品安全以及诊断和流行病学调查领域对分枝杆菌感染的快速检测、监控和防治，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。
下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为采用本发明试剂盒及方法对人痰液样品的检测图。
图2为采用本发明试剂盒及方法特异性实验检测图，其中，
图2A为对结核分枝杆菌H37Rv ATCC27294、牛分枝杆菌ATCC27291和牛分枝杆菌BCG的检测结果；
图2B为对副结核分枝杆菌CVCC C68605、副结核分枝杆菌CVCC C68623、副结核分枝杆菌CVCC C68627和副结核分枝杆菌CVCC C68635的检测结果；
图2C为对鸟分枝杆菌CMCC（B）95001和鸟分枝杆菌ATCC25291的检测结果；
图2D为对胞内分枝杆菌CMCC（B）95002、不产色分枝杆菌CMCC（B）95007、马尔摩分枝杆菌CMCC（B）95010、产鼻分枝杆菌CMCC（B）95012、堪萨斯分枝杆菌CMCC（B）95013、海分枝杆菌CMCC（B）95014、猿猴分枝杆菌CMCC（B）95015、亚洲分枝杆菌CMCC（B）95016、瘰疬分枝杆菌CMCC（B）95017、戈登分枝杆菌CMCC（B）95018、苏加分枝杆菌CMCC（B）95019、龟分枝杆菌脓肿亚种CMCC（B）95021、偶发分枝杆菌CMCC（B）95022、耻垢分枝杆菌CMCC（B）95023、草分枝杆菌CMCC（B）95024、胃分枝杆菌CMCC（B）95006、微黄分枝杆菌CMCC（B）95030和牦牛分枝杆菌CGMCC4.1181的检测结果；
图2E为对IS6110、IS1081、16rRNA、IS1245和F57五重PCR阳性对照的检测结果。
图3为采用本发明试剂盒及方法对阳性质粒模板的敏感性实验检测图，其中，
图3A为引物16s rRNA的灵敏度检测结果；图3B为引物IS1245的灵敏度检测结果；图3C为引物IS1081的灵敏度检测结果；图3D为引物F57的灵敏度检测结果。
具体实施方式
本发明方法采用五重mPCR-DHPLC快速检测分枝杆菌及鉴别致病分枝杆菌，其具体原理为，根据16S rRNA在分枝杆菌属的序列保守性，设计特异性的分枝杆菌属引物进行PCR扩增，同时设计针对结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的特异性引物，采用多重PCR（multiplex-PCR，mPCR）技术进行PCR扩增，然后再结合DHPLC（变性高效液相色谱技术）进行分析，所建立的方法可用于快速检测分枝杆菌感染及鉴别致病菌群（种）。DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品。DHPLC在非变性条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此，当将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。产物分子量的1%大小的片段能够被分离。因而，mPCR-DHPLC方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。
实施例1：分枝杆菌及致病分枝杆菌mPCR-DHPLC检测方法引物的制备
根据分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列，选择其中的一条序列（GeneBankNo.CP000611），根据引物的退火温度在60℃左右，设计出序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的引物对，PCR产物长度为230bp：
上游引物（引物1）SEQ ID No.1：CGTGCGGGCGATAC；
下游引物（引物2）SEQ ID No.2：GGCACGGATCCCAA。
根据结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110和IS1081，选择其中的一条序列（CP003248.1），根据引物的退火温度在60℃左右，分别设计出IS6110和IS1081序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对，PCR产物长度分别为178bp和379bp：
上游引物（引物4）SEQ ID No.4：TGTATAGGCCGTTGATCG；
下游引物（引物5）SEQ ID No.5：CCAACAAGAAGGCGTACTC；
上游引物（引物7）SEQ ID No.7：CGATGAGCGGTCCAATC；
上游引物（引物8）SEQ ID No.8：GACGCGGCCTGCCT。
根据副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因，选择其中的一条序列（GeneBank No.GQ140314.1），根据引物的退火温度在60℃左右，设计出序列如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示的引物对，PCR产物长度为306bp：
上游引物（引物10）SEQ ID No.10：ATGTTGTTGTCACCGAGC；
下游引物（引物11）SEQ ID No.11：GGCATTCCAAGTCCTGA。
根据鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245，选择其中的一条序列（GeneBank No.L33879.1），根据引物的退火温度在60℃左右，设计出序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示的引物对，PCR产物长度为256bp：
上游引物（引物13）SEQ ID No.13：AGACCCGCTCCAATCA；
下游引物（引物14）SEQ ID No.14：CGGCTGACCTCGCTT。
引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。
实施例2：分枝杆菌五重mPCR-DHPLC方法PCR检测反应体系的建立和优化
一、方法
1.引物浓度的优化
实验中将引物浓度从0.1μmol/L开始，以0.1μmol/L的幅度递增，直至0.6μmol/L，采用矩阵法进行对比实验，对比实验的其它条件完全一致。
2.Mg2+浓度的优化
Mg2+会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用Mg2+浓度梯度，对Mg2+浓度进行了优化，Mg2+浓度从1.5mmol/L开始，以0.5mmol/L的幅度递增，直至6mmol/L。
3.PCR反应条件的优化
为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以60℃为基础，以0.5℃递加，直到65℃，在此基础上进行退火温度优化。
采用的反应体系如下：
在Biometra PCR仪上进行扩增，按如下反应条件设置：第一步95℃，2分钟；第二步95℃，5秒，60-65℃，5秒，68℃，5秒，40个循环；第四步72℃1分钟。Biometra PCR仪具备梯度PCR功能，可以同时进行温度梯度实验。
二、结果
1.引物浓度的优化
多次重复实验后选定检测分枝杆菌的16s引物浓度为0.24μmol/L，鉴别致病分枝杆菌的四种引物浓度为0.2μmol/L，作为分枝杆菌检测及致病分枝杆菌mPCR-DHPLC检测方法的引物浓度。
2.Mg2+浓度的优化
结果表明Mg2+浓度越低，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之Mg2+浓度越高，扩增效率有所提高，但特异性受到影响。本发明最终选定的实际Mg2+浓度为1.5mmol/L。
3.PCR反应条件的优化
结果表明退火温度越高，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之退火温度越低，扩增效率有所提高，但特异性有所降低。本发明最终选择62℃作为实际的退火温度，保证特异性和扩增效率的组合能够达到最优。
实施例3：本发明方法检测临床样品
一、样品采集
痰：牛咯痰极少，宜在清晨采集用橡胶管自口腔伸入至气管内，外端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块；人痰样采集按医院常规操作。
二、样本的处理
痰的处理方法：
（1）在样本中加入2～3倍于样本体积的4g/L的NaOH溶液，摇匀，室温液化20min，使其充分液化；无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4g/L的NaOH溶液直至液化完全。
（2）取样本1.5mL，10,000rpm离心10min，弃上清。
（3）加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。
（4）重复一次步骤（3）。
（5）加入50μL DNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5秒，56℃温浴30min，后98℃温浴10min。
（6）4,000rpm离心5秒，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。
（7）取上清，直接用于PCR或贮存于-20℃备用。
三、扩增检测
1.扩增试剂准备
取出按照实施例2配制的PCR反应液，在室温下融化后，6000rpm离心5秒，配制PCR反应混合液，每25μL混合液中包含PCR反应液24.6μL和KOD-Plus0.4μL，将以上PCR反应混合液按照使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装25μL。
2.加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸，盖上管盖，将PCR管放入PCR仪内，记录样本放置顺序。
3.PCR扩增检测
反应条件设定：第一步：95℃，2分钟；第三步：每个循环依次为95℃，5秒，62℃，5秒，68℃，5秒，共40个循环；第四步：72℃，1分钟。
4.DHPLC检测
将PCR产物放入DHPLC仪器的托盘内，按以下条件进行检测：
| 时间 | 缓冲液A（%） | 缓冲液B（%） | 缓冲液D（%） |
| 0 | 55 | 45 | - |
| 0.5 | 50.2 | 49.8 | - |
| 2.5 | 43.9 | 56.1 | - |
| 4.5 | 40.5 | 59.5 | - |
| 6.5 | 38.4 | 61.6 | - |
| 8.5 | 37 | 63 | - |
| 8.6 | 0 | 100 | - |
| 9.1 | 0 | 100 | - |
| 9.2 | 55 | 45 | - |
| 10.1 | 55 | 45 | - |
其中，缓冲液A的成分为0.1mol/L TEAA，缓冲液B为0.1mol/L TEAA加入25%（V/V）乙腈，缓冲液D为75%（V/V）乙腈。
阴性对照为：灭菌生理盐水；
阳性对照为：携带有核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的核酸的质粒DNA，所述各序列依次为分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245；所述质粒可以是本领域内任意的可用质粒载体。
四、分析条件设定和结果判定
（1）质控标准：阴性对照无特异性的洗脱峰，阳性对照的有五个特异性的洗脱峰，洗脱时间依次为IS6110、16s RNA、IS1245、F57和IS1081。否则，此次实验视为无效。
（2）结果分析及判定：无特异性洗脱峰的样本为阴性样本，存在与阳性对照的洗脱峰位置一致的样品为阳性。如与16r RNA洗脱峰一致，则判定为分枝杆菌阳性，进一步分析如与IS6110和IS1081洗脱峰位置一致则判定为结核分枝杆菌复合群阳性，如与IS1245洗脱峰位置一致则判定为鸟分枝杆菌阳性，如与F57洗脱峰位置一致则判定为副结核分枝杆菌阳性。
五、对临床样品的检测实例
按上述样品处理和mPCR-DHPLC检测方法，采用本发明方法对门诊人群的痰液样品进行检测实验，结果检出多例阳性样品，具体如图1所示。图1显示有引物IS6110、IS1081和16rRNA扩增产物大小相同的条带表示所测样本为阳性样本。
实施例4：本发明方法的特异性和敏感性实验
一、方法
1.特异性实验
提取培养的结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、牛分枝杆菌标准菌株、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、龟、蟾、草、堪萨斯、胞内、耻垢、胃、瘰疬、偶发分枝杆菌等共27种分枝杆菌菌种和24种各种环境微生物菌株样品进行检测实验。本实验用分枝杆菌菌种见下列附表。
表1特异性实验分枝杆菌菌株列表
24种环境微生物菌株样品为：英诺克李斯特菌(ATCC35897)，单增李斯特菌(ATCC7644)，鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50115)，鼠伤寒沙门氏菌（(ATCC7644)，阪崎肠杆菌(ATCC29544)，普通变形杆菌(C MCC49003)，威尔氏李斯特菌(ATCC35897)，格式李斯特菌(ATCC25401)，表皮葡萄球菌(CMCC26096)，产气肠杆菌(CMCC49003)，宋内氏志贺氏菌(CMCC51334)，乙型溶血链球菌(CMCC32210)，绿脓杆菌(CMCC AS1.0212)，大肠埃希氏菌(ATCC25922)，产肠毒素大肠埃希氏菌(ATCC35401)，肠致病性大肠埃希氏菌Enteropathogenic E.coli(ATCC43887)，肠侵袭性大肠埃希氏菌(ATCC43893)，溶藻弧菌(ATCC17749)，奇异变形杆菌(CMCC AS1.1527)，金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，金黄色葡萄球菌（CMCC26003），副溶血性弧菌(ATCC17802)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC96100)，空肠弯曲菌(ATCC33560)，珊瑚链霉菌（ATCC23901）和砖红链霉菌（ATCC19776）。
各菌种均为源自美国模式培养物集存库ATCC或中国医学微生物菌种保藏中心CMCC的标准菌株。
DHPLC检测条件如下：
| 时间 | 缓冲液A（%） | 缓冲液B（%） |
| 0 | 55 | 45 |
| 0.5 | 50.2 | 49.8 |
| 2.5 | 43.9 | 56.1 |
| 4.5 | 40.5 | 59.5 |
| 6.5 | 38.4 | 61.6 |
| 8.5 | 37 | 63 |
| 8.6 | 0 | 100 |
| 9.1 | 0 | 100 |
| 9.2 | 55 | 45 |
| 10.1 | 55 | 45 |
2.敏感性实验
分别采用16s rRNA、IS1081、IS6110、F57和IS1245的上下游引物以其对应的分枝杆菌DNA为模板，分别进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Blunt平端载体（购于北京全式金生物技术有限公司）连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒（购于大连宝生物工程有限公司）纯化重组质粒DNA，重组质粒稀释后作为阳性对照。测OD260吸光度值，根据公式：质粒拷贝数/μL={总含量（μg/μL）}/{质粒分子量}×6.02×1017换算成对应基因拷贝数。将质粒DNA采用无RNase，无DNase水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品5μL，采用本发明方法按照实施例3描述的扩增检测步骤进行检测实验，以测试mPCR-DHPLC的检测灵敏度（基因拷贝数），DHPLC检测条件如下：
| 时间 | 缓冲液A（%） | 缓冲液B（%） | 缓冲液D（%） |
| 0 | 46.3 | 53.7 | - |
| 0.5 | 41.3 | 58.7 | - |
| 5 | 32.3 | 67.7 | - |
| 5.1 | 0 | 0 | 100 |
| 5.6 | 0 | 0 | 100 |
| 5.7 | 46.3 | 53.7 | - |
| 6.6 | 46.3 | 53.7 | - |
二、结果
1.特异性实验：本发明方法对27种分枝杆菌标准菌株与临床分离株，检测结果与理论推导相符，具体如图2A至图2D所示。其中，图2A为本发明试剂盒及方法对结核分枝杆菌H37Rv ATCC27294、牛分枝杆菌ATCC27291和牛分枝杆菌BCG的检测结果；图2B为对副结核分枝杆菌CVCC C68605、副结核分枝杆菌CVCC C68623、副结核分枝杆菌CVCC C68627和副结核分枝杆菌CVCC C68635的检测结果；图2C为对鸟分枝杆菌CMCC（B）95001和鸟分枝杆菌ATCC25291的检测结果；图2D为检测为发明方法对胞内分枝杆菌CMCC（B）95002、不产色分枝杆菌CMCC（B）95007、马尔摩分枝杆菌CMCC（B）95010、产鼻分枝杆菌CMCC（B）95012、堪萨斯分枝杆菌CMCC（B）95013、海分枝杆菌CMCC（B）95014、猿猴分枝杆菌CMCC（B）95015、亚洲分枝杆菌CMCC（B）95016、瘰疬分枝杆菌CMCC（B）95017、戈登分枝杆菌CMCC（B）95018、苏加分枝杆菌CMCC（B）95019、龟分枝杆菌脓肿亚种CMCC（B）95021、偶发分枝杆菌CMCC（B）95022、耻垢分枝杆菌CMCC（B）95023、草分枝杆菌CMCC（B）95024、胃分枝杆菌CMCC（B）95006、微黄分枝杆菌CMCC（B）95030和牦牛分枝杆菌CGMCC4.1181。
图2E为本发明方法对IS6110、IS1081、16rRNA、IS1245和F57五重PCR阳性对照的检测结果。
对24种环境微生物菌株样品采用本发明方法按照实施例3描述的扩增检测步骤进行检测实验，结果显示均呈典型阴性反应。表明本发明方法检测特异性强。
2.敏感性实验：检测结果显示，本发明方法的检测灵敏度可达106—108质粒稀释度，相当于400—40000个基因拷贝，部分检测结果如图3A至图3D所示。其中，图3A为引物16s rRNA的灵敏度检测结果；图3B为鉴别鸟分支杆菌的引物IS1245的灵敏度检测结果；图3C为鉴别结核分支杆菌复合群插入序列的引物IS1081的灵敏度检测结果；图3D为鉴别副结核分支杆菌F57基因的引物F57的灵敏度检测结果。
Claims (4)
1.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：
检测分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对，其中一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；另一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
鉴别副结核分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；
鉴别鸟分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示。
2.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸的组成为：
核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的检测分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物；
核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.9所示的PCR扩增产物；
核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的副结核分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.12所示的PCR扩增产物；
核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.15所示的PCR扩增产物。
3.一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
PCR缓冲液；
检测分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
检测分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.7所示；
鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.8所示；
鉴别副结核分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；
鉴别副结核分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.11所示；
鉴别鸟分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；
鉴别鸟分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；
dNTP；
MgCl2；
Pfu快速高保真聚合酶；
双蒸水；
阴性对照：灭菌生理盐水；
阳性对照：携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示。
4.一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC非诊断性方法：
（1）采集样品并提取核酸；
（2）对提取的核酸进行PCR扩增，其中：
PCR的反应体系为：
序列如SEQ ID No.1所示的引物：10μmol/L，0.6μL；
序列如SEQ ID No.2所示的引物：10μmol/L，0.6μL；
序列如SEQ ID No.4所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.5所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.7所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.8所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.10所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.11所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.13所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
序列如SEQ ID No.14所示的引物：10μmol/L，0.5μL；
PCR缓冲液：10×，3μL；
MgSO4：25mmol/L，1.8μL；
dNTP：2mmol/L，3μL；
KOD-Plus：1U/μL，0.6μL；
模板：5μL；
双蒸水：11.4μL；
总计：30μL；
PCR的反应条件为：
第一步：95℃2分钟；第二步：95℃5秒，62℃5秒，68℃5秒，40个循环；第三步，72℃1分钟；
（3）对扩增产物进行DHPLC检测；阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为分别携带有如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的序列的质粒DNA；
（4）分析、判定结果：样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰位置一致，且阴性对照无相应的洗脱峰，则样品为阳性。
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