CN102782136A - 表达hiv抗原和gm-csf的载体和用于产生免疫应答的相关方法 - Google Patents

Abstract

本披露提供了编码一种或多种HIV抗原和GM-CSF的载体。还提供了诱导受试者体内免疫应答的方法、治疗具有HIV的受试者的方法、以及制造用于诱导免疫应答的药剂的方法，这些方法需要使用这些载体和疫苗插入片段。

Description

表达HIV抗原和GM-CSF的载体和用于产生免疫应答的相关方法

技术领域

本披露涉及用于在受试者体内诱导针对人免疫缺陷病毒（HIV）的免疫应答的载体和疫苗插入片段（vaccine insert）以及使用所提供的载体和疫苗插入片段的一种或多种在受试者体内诱导针对HIV的免疫应答的方法。

本披露的背景

疫苗已经对世界健康产生深远和长久的影响。天花已经根除，脊髓灰质炎接近消除，并且多种疾病如白喉、麻疹、腮腺炎、百日咳、和破伤风被控制。

HIV1感染的流行已经使得针对这种新出现的病原体（agent）的疫苗研制高度优先用于世界健康。针对现存和新发病原体研制安全和有效的疫苗是医学研究的一个主要关注点。大量工作已经投向制造一种将针对人免疫缺陷病毒-1（HIV）提供保护的疫苗。人们认为一种有效的疫苗要求能诱导细胞应答和体液应答（Douek等人,2006）。

概述

在此描述了一种载体，该载体包含：原核复制起点；和包含疫苗插入片段的真核转录盒，该疫苗插入片段编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF。因而，这种载体包含编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIVRev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF（例如，人GM-CSF)的序列以及用于在真核（例如，人）细胞中表达HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF的可操作地连接的序列。在不同的实施方案中：HIV Gag包含与下文所述的HIV Gag氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；HIV Pol包含与下文所述的HIV Pol氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；HIV T包含与下文所述的HIV Tat氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；HIV Rev包含与下文所述的HIV Rev氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；HIV Vpu包含与下文所述的HIV Vpu氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；HIV Env包含与下文所述的HIV Env氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成；GM-CSF包含与下文所述的GM-CSF氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或98%一致的氨基酸序列或由其组成。

在不同的实施方案中：真核转录盒包含与编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF的核酸序列可操作地连接的一种真核启动子；HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu和HIV Env来自一个或多个HIV分化体；HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu和HIV Env来自相同的HIV分化体；所述一个或多个HIV分化体选自下组，该组由以下各项组成：HIV分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L；真核表达盒在人细胞中的表达产生编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF的前体mRNA；真核表达盒包含被定位用于翻译GM-CSF的内部核糖体进入位点；真核表达盒进一步包含以下序列的一个或多个：前导序列、内含子序列和多聚腺苷化序列；真核表达盒进一步包含以下序列的一个或多个：组织纤维蛋白溶酶原激活剂前导序列、CMV内含子A序列和牛生长激素多聚腺苷化序列；HIV Gag在锌指结构域中具有降低RNA包装活性的突变；HIV Pol具有降低蛋白酶活性的突变；HIV Pol具有降低聚合酶活性的突变；HIV Pol具有降低链转移活性的突变；HIV Pol具有降低RNA酶H活性的突变；HIV Pol具有降低蛋白酶活性的突变；HIVPol具有降低聚合酶活性的突变；HIV Pol具有降低链转移活性的突变；HIV Pol具有降低RNA酶活性的突变；载体包含编码一个原核选择标记的序列；载体进一步包含与编码这个原核选择标记的序列可操作地连接的原核转录终止子；编码的GM-CSF是全长的人GM-CSF；编码GM-CSF的序列包含SEQ ID NO:7第6633-7067位核苷酸、SEQ ID NO:8第6648-7082位核苷酸或SEQ ID NO:9第7336-7770位核苷酸的序列；编码的GM-CSF是能够刺激巨噬细胞分化和增殖或者活化抗原递呈细胞的截短人GM-GSF或突变人GM-GSF；GM-CSF包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；HIV Gag包含与SEQ ID NO:A至少95%一致的氨基酸序列，缺乏整合酶结构域的HIV Pol包含与SEQ ID NO:B至少95%一致的氨基酸序列，HIV Tat包含与SEQ ID NO:C至少95%一致的氨基酸序列，HIV Rev包含与SEQ ID NO:D至少95%一致的氨基酸序列，HIV Vpu包含与SEQID NO:E的氨基酸序列至少95%一致的氨基酸序列，并且HIV Env包含与SEQ ID NO:E的氨基酸序列至少95%一致的氨基酸序列；载体包含GEO-D03的序列（SEQ ID NO:7）或与其至少85%、90%、95%或98%相同的序列或者由其组成；载体包含GEO-D06的序列（SEQ ID NO:8）或与其至少85%、90%、95%或98%一致的序列或者由其组成；并且载体包含GEO-D07的序列（SEQ ID NO:9）或与其至少85%、90%、95%或98%一致的序列或者由其组成。

另外，描述了一种引出受试者体内的免疫应答（例如，细胞免疫应答和/或体液免疫应答）的方法，这种方法包括向一位受试者施用一个或多个剂量的包含在此所述的载体的组合物。在不同的实施方案中：向受试者施用至少两个剂量的包含该载体的组合物；相隔至少两个月向受试者施用至少两个剂量的包含该载体的组合物；该方法进一步包括向受试者施用一个或多个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物的步骤；由MVA表达的HIV Gag、HIV Pol和HIV Env来自与该DNA载体编码的HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、和HIV Env相同的分化体；在施用至少一个剂量的包含该载体的组合物之后，向受试者施用至少一个剂量的包含表达HIVGag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物；这种施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加、免疫原特异性抗体滴度增加、免疫原特异性IgA水平增加、或对HIV感染的抵抗力增加。

还描述了一种治疗被HIV感染的受试者的方法，包括向受试者施用一个或多个剂量的包含在此所述载体的组合物。在不同的实施方案中：载体包含GEO-D03的序列（SEQ ID NO:7）或与其至少80%、85%、90%、95%或98%一致的序列或者由其组成；载体包含GEO-D06的序列（SEQ IDNO:8）或与其至少80%、85%、90%、95%或98%一致的序列或者由其组成；载体包含GEO-D07的序列（SEQ ID NO:9）或与其至少80%、85%、90%、95%或98%一致的序列或者由其组成；该方法进一步包括向受试者施用一个或多个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物的步骤；由MVA表达的HIV Gag、HIV Pol和HIV Env来自与该DNA载体编码的HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIVTat、HIV Rev、HIV Vpu、和HIV Env相同的分化体；在向受试者施用至少一个剂量的包含在此所述载体的组合物之后，向该受试者施用至少一个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物；并且这种施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加、免疫原特异性抗体滴度增加、免疫原特异性IgA水平增加、或对HIV感染的抵抗力增加。

本披露提供了表达一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）HIV抗原和人GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；GenBank NP_000749)的质粒载体。还提供了单独使用此类载体或与表达一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）HIV抗原的MVA载体组合使用的方法，以及使用编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）HIV抗原的DNA载体连同编码GM-CSF的DNA载体的组合的方法。这种组合可以在也需要施用编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）HIV抗原的MVA载体的方法中使用。

质粒载体或病毒载体可以包括代表发现于一个或多个HIV分化体中的一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十个）基因的核酸或其任何片段或衍生物，当表达时，其引出针对自其衍生或获得该核酸的病毒（或病毒分化体）的免疫应答。这些核酸可以从HIV纯化或它们可以事先已经克隆、亚克隆或合成，并且在任何情况下，可以与天然发生的核酸序列相同或不同。本披露的质粒载体尤其可以在此称为表达载体、表达构建体、质粒载体或简单地称为质粒，无论它们是否包括疫苗插入片段（即，编码抗原或免疫原的核酸序列）。术语“病毒载体”的类似变形也可以出现（例如，我们可以将“病毒载体”称为“痘病毒载体”、“痘苗病毒载体”、“改良安卡拉痘苗病毒载体”或“MVA载体”）。病毒载体可以包括或可以不包括疫苗插入片段。

本披露提供了含有但不限于具有疫苗插入片段和编码GM-CSF的序列的DNA载体的组合物（包括药学上可接受的或生理学上可接受的组合物）。该插入片段可以包括在此所述的一个或多个序列（插入片段和代表性序列的特征在下文详细描述；这些序列的任一个或这些序列的任何组合可以用作插入片段）。当插入片段表达时，一种或多种表达的蛋白质可以产生针对一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）HIV分化体的免疫应答。可以通过在单一载体（多载体疫苗也是有用的并且在下文进一步描述）的插入片段中包括来自多于一个分化体的序列，增加免疫应答将有效对抗多于一个分化体的可能性。例如，这些载体的任一种的疫苗插入片段或在此所述的载体可以含有一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）设计者序列（例如，如在此所述的含有来自一个或多个HIV分化体的序列的镶嵌序列，例如通过使用从洛斯阿拉莫斯网站可获得的镶嵌疫苗设计者工具（Mosaic Vaccine Designer tool））。这些载体的任一种的疫苗插入片段或在此所述的载体也可以含有一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）序列，这些序列编码存在于如在此所述的一个或多个HIV分化体中的一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）保守蛋白质序列（例如，在Rolland等人,PloS Pathogen 3:e157,2007；Jiang等人,Nature Struct.Mol.Biol.17:955–961,2010；Mullins等人,AIDS Vaccine 2010,Oral Abstract No.OA01.01；和美国专利申请公开号20090092628中描述的那些，通过引用而结合）。

本披露还以组合物（包括药学上可接受的或生理学上可接受的组合物）为特征，这些组合物含有但不限于编码引出（例如，诱导或增强）针对HIV的免疫应答的一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）抗原的至少一种（例如，二、三、四、五、或六种）载体（即，包括疫苗插入片段和/或表达GM-CSF的序列的载体）。一种DNA载体可以编码Gag-Pol或其修饰形式。此外，它可以编码Gag-Pol和Env或其修饰形式。编码的HIV抗原可以是天然发生的HIV抗原的变体，它包括一个或多个点突变、插入或缺失。特别有用的HIV抗原序列包括一个或多个（例如，至少二、三、四、或五个）安全突变（例如，LTR和编码整合酶(IN)、Vif、Vpr、和Nef的序列的缺失）。这些核酸可以编码Gag、PR、RT、IN、Env、Tat、Rev、和Vpu蛋白中的一种或多种（例如，二、三、四、五、六或七种），这些蛋白质的一种或多种（例如，二、三、四、五、六或七种）可以含有安全突变（具体突变在下文详细描述）。而且，分离的核酸可以是任何HIV分化体的，并且来自不同分化体的核酸可以组合使用（如在下文进一步描述的）。在此处所述的工作中，将分化体B插入片段命名为JS（例如，JS2、JS7、和JS7.1)，分化体AG插入片段命名为IC（例如，IC2、IC25、IC48、和IC90)，并且分化体C插入片段命名为IN（例如，IN2和IN3）。这些插入片段在本披露的范围之内，正如含有它们的载体（无论是质粒载体或病毒载体）（具体的载体/插入片段组合在下文称为例如pGA1/JS2、pGA2/JS2等）也是如此。DNA载体也可以编码人GM-CSF(mwlqsllllg tvacsisapa rspspstqpw ehvnaiqear rllnlsrdtaaemnetvevi semfdlqept clqtrlelyk qglrgsltkl kgpltmmash ykqhcpptpe tscatqiitfesfkenlkdf llvipfdcwe pvqe；SEQ ID NO:10）。用于插入GM-CSF的位置的非限制性实例显示在图1中。GM-CSF编码序列可以替换nef编码序列并且，因而转录将产生一种编码以下剪接mRNA的全长mRNA：一种编码Tat的剪接mRNA、一种编码Rev的剪接mRNA、一种编码Vpu-Env的剪接mRNA、和一种编码GM-CSF的剪接mRNA（使用nef剪接序列产生的）。在本披露的疫苗插入片段和载体的另外的实施方案中，GM-CSF编码序列可以含有IRES（内部核糖体进入位点）。例如，IRES序列可以位于编码GM-CSF的核酸序列的5′。在本披露的疫苗插入片段和载体的另外的实施方案中，从编码GM-CSF的核酸序列翻译的GM-CSF蛋白可以是一种多聚蛋白（例如，含有除了GM-CSF的多肽序列（例如，全长蛋白质或具有GM-CSF的一种或多种生物学活性的片段）之外的一个或多个（例如，至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个）氨基酸的一种蛋白质）的一部分。如果GM-CSF表达为多聚蛋白，则可以在使用一种或多种（例如两种）蛋白酶进行内部蛋白酶水解切割后产生全长GM-CSF或具有GM-CSF的一种或多种生物学活性的GM-CSF片段。

本披露的DNA载体可以包括改善稳定性的终止序列。下文讨论终止序列和其他调节成分（例如，启动子和多聚腺苷化序列）。

本披露的组合物可以施用于人，包括儿童。因此，本披露以通过施用一种或多种（例如，二、三、四、五、或六种）类型的载体（例如，一种或多种质粒，这些质粒可以具有或可以不具有相同的序列、组分或插入片段（例如，可以编码抗原的序列）和/或一种或多种（例如，二、三、四、五、或六种）病毒载体（这些病毒载体可以是相同的或不同的或可以表达或可以不表达相同的抗原）免疫患者（或在患者中引出一种免疫应答，它可以包括多表位CD8+T细胞应答）的方法为特征。如上文指出的，载体，无论是质粒载体或病毒载体，可以包括从一个或多个HIV分化体获得或衍生（例如，突变序列是衍生序列）的一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）核酸。当这些序列表达时，它们产生一种抗原或多种抗原，所述抗原引出针对来自一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）HIV分化体的一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、或十二个）表位的免疫应答。

在组合物含有在其主链、调控元件或插入片段方面不同的载体时，载体在组合物中的比率和施用它们的途径可以变化。一个类型的载体对另一个类型载体的比率可以是相等的或大致相等（例如，大致1:1或1:1:1等）。可替代地，该比率可以处于任何所希望的比例（例如，1:2、1:3、1:4…1:10；1:2:1、1:3:1、1:4:1…1:10:1；等）。因而，本披露以含有多种载体的组合物为特征，其中抗原表达载体的相对量是大致相等的或处于所希望的比例。虽然可以产生预先形成的混合物（并且可以是更便利的），当然可以通过施用两种或更多种（例如，三、四、五、或六种）含有载体的组合物（例如，在相同的场合（例如，在彼此数分钟内）或几乎相同的场合（例如，在连续日）)实现相同的目的。

质粒载体可以单独施用（即，一种质粒可以在一种或数种场合，伴以或不伴以一种替代类型的疫苗制剂（例如，伴以或不伴以施用蛋白质或另一种类型的载体，如病毒载体）)并且任选地伴以一种佐剂或与包含下述插入片段的一种替代性加强免疫（例如，活载体疫苗，如重组改良安卡拉痘苗病毒载体（MVA））联合时（例如，在其之前）施用，其中所述插入片段可以与免疫的“引发”部分的插入片段不同或可以是一种相关疫苗插入片段。例如，病毒载体可以含有在作为接种方案的“引发”部分所施用的质粒内所含有的序列的至少一些（例如，编码一种或多种并且可能编码所有相同抗原的序列）。佐剂可以是“基因佐剂（genetic adjuvant）”（即，通过DNA序列递送的蛋白质）。类似地，如在下文进一步描述的，可以通过施用一种活载体疫苗（例如，MVA载体）而不施用基于质粒（或“DNA”）的疫苗来免疫患者（或引出一种免疫应答，它可以包括多表位CD8⁺T细胞应答）。因而，在可替代的实施方案中，本披露以仅具有病毒载体的组合物（任选地具有一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）在此描述的任何插入片段或具有它们的特征的插入片段）和施用它们的方法为特征。基于病毒的方案（例如，“仅MVA”或“MVA-MVA”疫苗方案）与在此对“DNA-MVA”方案所述的那些方案相同，并且任何疫苗中的这些MVA可以处于任何所希望的比例。例如，在任何情况下（无论免疫方案是否使用仅基于质粒的免疫原、仅仅病毒携带的免疫原或两者的组合），可以包括佐剂并且通过施用的多个载体施用多种抗原，包括从任何HIV分化体获得的那些抗原。

如术语“免疫”（和其变体）所提示，本披露的组合物可以施用至仍未被一种病原体感染的受试者（因而，如在此所用的术语“受试者”或“患者”显然包括健康或非HIV感染个体），但是本披露不因而受限制；也可以施用在此所述的组合物来治疗已经暴露于一种病原体或已知被其感染（例如，任何分化体的HIV，包括目前称为分化体A-L的那些或其突变体或重组形式）的受试者或患者。在感染或未感染的患者中，这些载体可以引出降低感染风险或比率（例如，降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)（在未感染患者的情况下）或在感染患者中提供治疗益处的有益免疫应答。

DNA免疫和rMVA免疫的优点在于免疫原可以由MHCI类和II类分子两者呈递。内源合成的蛋白质易于进入将肽表位加载到MHCI以及MHCII分子上的加工途径。MHC I呈递的表位激活（raise）CD8细胞毒T细胞（Tc）应答，而MHC II呈递的表位激活CD4辅助T细胞（Th）。

相反，不在细胞内合成的免疫原在很大程度上限制于加载MHC II表位并且因此激活CD4Th，但是不激活CD8Tc。此外，DNA质粒仅在转染的细胞中表达免疫抗原并且可以用来将免疫应答集中在仅免疫所希望的那些抗原上。相反，活病毒载体表达许多抗原（例如，载体的那些抗原以及免疫抗原）并且引发针对载体和免疫原两者的免疫应答。因而，这些载体可能借助可以由活载体表达的大量抗原而在加强DNA引发的应答方面是高度有效的，该活载体优先加强高度靶向的DNA引发的免疫应答。活病毒载体还刺激增加免疫应答的促炎细胞因子的产生。因而，施用本文所述的一种或多种DNA载体（作为“引发”)并且随后施用一种或多种病毒载体（作为“增强”）可能在产生细胞免疫和体液免疫方面比单独的DNA或单独的活载体更有效。在这些疫苗可以通过DNA表达载体和/或重组病毒施用的情况下，需要在细菌宿主中稳定并且在动物中安全的质粒。本文中披露了可以具有这种附加稳定性的质粒疫苗，连同用于施用它们至动物（包括人）的方法。

由DNA或rMVA编码的抗原必然是蛋白质性质的。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”通常是可互换的，虽然术语“肽”常用来指短的氨基酸残基序列或较大蛋白质的片段。在任何情况下，通过肽键连接的氨基酸残基连续阵列可以通过使用表达DNA的重组技术（例如，如在此描述和例证的疫苗插入片段所进行的）获得、从天然来源纯化而来或合成。下文描述基于DNA的疫苗（以及病毒载体，如基于痘病毒的载体的疫苗）的其他优点。

因此，本披露提供了含有原核复制起点、启动子序列、真核转录盒、多聚腺苷化序列和转录终止序列的载体，真核转录盒含有编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原和GM-CSF的疫苗插入片段。在载体的另外的实施方案中，原核复制起点是ColE1或者启动子序列是CMVIE-内含子A或CMV启动子。在载体的另外的实施方案中，多聚腺苷化序列是牛生长激素多聚腺苷化序列或者转录终止序列是λT0终止子。以上载体的另外的实施方案进一步含有选择标记基因。在另外的实施方案中，载体含有GEO-D03(SEQ ID NO:7)、GEO-D06(SEQ ID NO:8)或GEO-D07(SEQ ID NO:9)的序列。

如上文指出的，本披露还提供了编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原和GM-CSF的疫苗插入片段。在疫苗插入片段的另外的实施方案中，插入片段含有GEO-D03(SEQ IDNO:7)的核苷酸106至7067、GEO-D06(SEQ ID NO:8)的核苷酸99至7082或GEO-D07(SEQ ID NO:9)的核苷酸787至7770的序列。

在任何以上描述的载体或疫苗插入片段中，疫苗插入片段可以含有一种序列，它编码选自下组的免疫原的一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）：Gag、gp160、gp120、gp41、pol、env、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif和Vpr。在所有以上载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原来自一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、或十二个）HIV分化体（例如，HIV分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、和L）。在以上载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原来自相同的HIV分化体（例如，HIV分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、或L）。在所有以上载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原（例如，Gag、Env（例如，gp120、gp41、或gp160)、Pol、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif、和Vpr）是突变体或天然变体（例如，作为重组或替代性剪接结果的免疫原）。例如，在任何以上载体或疫苗插入片段中，突变体免疫原是gag，并且突变存在于编码基质蛋白（p17）、衣壳蛋白（p24）、核衣壳蛋白（p7）、或C端肽（p6）的序列中。在以上载体或疫苗插入片段的任一者中，突变体免疫原可以是pol，并且突变存在于编码蛋白酶蛋白(p10)、逆转录酶(p66/p51)、或整合酶蛋白(p32)的序列中。在任何以上载体和疫苗插入片段中，插入片段可以含有编码Gag、Pol、Tat、Rev、和Env的序列。在以上载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，插入片段可以含有编码Gag、Pol、Tat、Rev、Env、和Vpu的序列。

在任何以上载体或疫苗插入片段中，编码的GM-CSF可以是全长的人GM-CSF。在载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，编码GM-CSF的序列可以含有SEQ ID NO:7第6633-7067位核苷酸、SEQ ID NO:8第6648-7082位核苷酸或SEQ ID NO:9第7336-7770位核苷酸的序列。在任何以上载体或疫苗插入片段中，编码的GM-CSF可以是能够刺激巨噬细胞分化和增殖或者活化抗原呈递树突细胞的截短的人GM-CSF或突变人GM-GSF。在以上载体和疫苗插入片段的另外的实施方案中，由疫苗编码的翻译的GM-CSF多肽不含有免疫原（例如，HIV免疫原）的多肽序列。

本披露进一步提供了诱导受试者体内免疫应答的方法，这些方法需要向受试者施用一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的任何上述载体。在这些方法的另外的实施方案中，受试者具有HIV或处于产生HIV感染的风险。在这些方法的其他实例中，施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加（例如，至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、40%、或50%）、免疫原特异性抗体滴度不增加或增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍）、免疫原特异性IgA水平（例如，直肠分泌物中的IgA水平）增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍）、每微克总IgA在0.03至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.1至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.2至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、抗HIV感染性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）、中和抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍）、抗体依赖性细胞毒性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、或300%）、免疫原特异性CD4辅助T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）和/或免疫原特异性CD8细胞毒T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）。

本披露进一步提供了治疗具有HIV的受试者的方法，这些方法需要向受试者施用一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的任何上述载体。在这些方法的另外的实施方案中，施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加（例如，至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、40%、或50%）、免疫原特异性抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍）、免疫原特异性IgA水平（例如，直肠分泌物中的IgA水平）增加（例如，例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍）、每微克总IgA在0.03至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.1至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.2至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、中和抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍）、抗体依赖性细胞毒性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、或300%）、免疫原特异性CD4辅助T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）和/或免疫原特异性CD8细胞毒T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）。

在任何以上方法中，载体含有一种疫苗插入片段，它含有编码选自下组的一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）免疫原的序列：Gag、Pol、Env（例如，gp160、gp120、和gp41)、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif、和Vpr。在任何以上方法中，载体可以含有GEO-D03(SEQ ID NO:7)、GEO-D06(SEQ ID NO:8)或GEO-D07(SEQ ID NO:9)的序列。在以上方法的另外的实施方案中，向受试者施用至少一个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的至少一种（例如，二、三、四、五、或六种）载体。在以上方法的另外的实例中，将至少两个剂量的至少一种（例如，二、三、四、五、或六种）载体相隔至少1周（例如，至少2周、3周、1个月、5周、6周、7周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、或18个月）施用。在其他实例中，以上方法进一步包括施用一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、或十三种）免疫原（例如，Gag、gp41、gp120、gp160、pol、env、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif、Vpr、pr、rt、和in（整合酶）)的MVA疫苗的步骤。在以上方法的另外的实施方案中，由MVA编码的一种或多种免疫原来自一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、或十二个）HIV分化体。在以上方法的另外的实例中，由MVA编码的一种或多种免疫原来自相同的HIV分化体。

在任何以上方法中，在施用至少一个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的任何上述载体之后（例如，至少1日、2日、3日、4日、5日、6日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周、16周、20周、或24周之后），向受试者施用至少一个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的MVA疫苗。在以上方法的另外的实施方案中，向受试者施用至少一个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的MVA疫苗，同时施用一个剂量的任何上述载体。在任何上述方法中，受试者可以是人。

本披露进一步提供了使用任何上述载体制造用于诱导受试者体内的免疫应答的药剂的方法。在这些方法的另外的实施方案中，受试者具有HIV或处于产生HIV感染的风险。在这些方法的另外的实施方案中，载体含有GEO-D03(SEQ ID NO:7)、GEO-D06(SEQ ID NO:8)或GEO-D07(SEQ ID NO:9)的序列。

术语“诱导免疫应答”表示至少免疫原特异性抗体的亲合力增加（例如，至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、40%、或50%）、免疫原特异性抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、或500倍）、免疫原特异性IgA水平（例如，直肠分泌物中的IgA水平）增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍）、每微克总IgA在0.03至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.1至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.2至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、抗体依赖性细胞毒性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、或300%）、免疫原特异性CD4辅助T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%)或免疫原特异性CD8细胞毒T细胞增加（例如，至少5%,10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）。

对于术语“天然变体”，表示天然存在于受试者或病毒中的序列。例如，人基因经常含有存在于一个群体内某些个体中的单核苷酸多态性。在体外连续传代或当在感染的受试者中复制时，病毒经常在它们的核酸中获得自发突变。HIV序列内部的突变可以赋予药物治疗抗性或改变该病毒在受试者体内的感染或复制率。HIV分化体的几种天然变体序列是本领域已知的（参见，例如，洛斯阿拉莫斯DNA数据库网站）。

对于术语“突变体”，表示与野生型或优势多肽序列或核苷酸序列相比时，序列中的至少一个（例如，至少二、三、四、五、六、七、八、九、或十个）氨基酸或核苷酸变化。突变可以天然发生于细胞中或可以通过分子生物学技术导入靶序列中。对于术语“突变体”，可以包括一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十个）氨基酸或核苷酸缺失、添加、或置换。

在附图和下文说明中叙述本披露的一种或多种实施方案的详细内容。本披露的其他特征、目的和优点将从本说明及附图并且从权利要求书中显而易见。

附图简要说明

图1.表达HIV抗原和GM-CSF的DNA载体的示意图。

图2.恒河猴的免疫程序。

图3.直肠内激发条件。

图4.SIV239DNA和重组MVA疫苗的示意图。D，SIV239DNA疫苗；Dg，共表达GM-CSF的SIV239DNA疫苗；M，SIV239MVA疫苗。阴影显示转录控制元件。对于DNA疫苗，转录由包括内含子A的巨细胞病毒立即早期启动子（CMVIE）启动并且由牛生长激素多聚腺苷化序列（BGHpA）终止。对于MVA疫苗，转录处于p7.5(env)和mH5(gag-pol)启动子的控制下。gag、Pr、RT、tat、rev、env是分别编码SIV239的组特异性抗原、蛋白酶、逆转录酶、转录激活物、调节蛋白和包膜糖蛋白的序列。Xs表示gag中逆转录酶序列及包装序列中的失活点突变。

图5.由GM-CSF佐剂化和非佐剂化的DNA/MVA疫苗引出的体液免疫应答。在第0和8周施用DNA引发免疫并且在第16和24周施用MVA加强免疫。A，试验中在免疫前、2、10、18、21、26、和37周测量的血清中Env特异性IgG应答。相对于恒河猴IgG的标准曲线估计的IgG的微克数。值是中位数±四分位数范围。B，呈现了在免疫前、在所示免疫后2周以及激发前的在直肠分泌物中Env特异性IgA应答的Tukey图。将IgA呈现为Env特异性IgA除以总IgA。C，在第二次MVA免疫后2周测量的针对免疫原SIV239Env和激发SIVE660 Env的引出IgG的亲合力指数。亲合力指数在试验中随时间增加并且在感染后进一步增加。D，具有两种Env的假型的中和滴度，其中两种Env从遗传多样的SIVE660储存物中分子克隆。SIVE660.11的滴度在第二次MVA加强后2周确定；并且对于SIVE660.17，在第二次MVA加强后13周确定。滴度相应于TZM-bl测定法中实现抑制剂量50（ID50）的血清稀释度。E，在第二次MVA加强后2周SIVmac239gp120包覆的CEM.NKRCCR5细胞的ADCC滴度。

在小图C-E中，箱线图呈现了应答的中位数和第25和第75百分位数。在箱线图上方显示目标Env以及在DDMM方案与DgDgMM方案之间的差异显著性。使用双面Wilcoxon秩和检验进行统计比较。

图6.在M11恒河猴的直肠分泌物中的SIVmac251Env特异性IgA抗体。

图7.在M11恒河猴的直肠分泌物中的SIV Gag/Pol-特异性抗体。

图8.由GM-CSF佐剂化和非佐剂化DNA/MVA疫苗引出的细胞免疫应答。在第0和8周施用DNA引发免疫并且在第16和24周施用MVA加强免疫。A：疫苗引发的CD4。B：试验中在免疫前、2、10、17、21、25、和37周的CD8T细胞应答。应答是在Gag和Env肽刺激PBMC后由ICS评分的IFN-γ分泌细胞。灰色箱图代表检测的背景。C：疫苗引出的分泌IFN-γ的CD4反应的宽度。D：在第一次和第二次MVA免疫后1周，由受13种Gag和11种Env肽汇集物刺激的PBMC的ICS所度量的CD8T细胞应答。E和F：在第二次MVA免疫后1周，由CD4和CD8T细胞应答引出的细胞因子产生的多官能性。使用Boolean分析来确定响应于Gag和Env的产生IFN-γ、IL-2、和TNF-α的细胞的频率。仅考虑大于0.07%细胞因子阳性细胞的那些应答用于分析。箱线图呈现了产生1、2、或3种细胞因子的应答细胞（作为总细胞因子阳性细胞的比例）百分数的中位数和四分位数间距。单一或双重生产者的各个亚组的细胞因子产生模式是总体相似的（数据未显示）。

图9.共表达的GM-CSF增强免于感染的保护作用。A：激发至感染的次数的卡普兰-迈耶曲线。未被12次激发感染的动物在14次激发时作图。P=0.003是在DgDgMM与未接种疫苗组之间激发至感染的次数的差异显著性（对数-秩Mandel-Cox检验）。B：在感染动物中暂时的激发后病毒血症。调整感染日期，以第一周为检测到感染的第一周。数据呈现为均数±一个标准偏差以显示各组中总体病毒血症水平的差异。各组之间的差异不是显著的，这归因于小的组大小和应答的变异性。灰色箱图代表检测的背景。

图10.在没有感染的反复激发的动物中缺乏记忆性Ab应答。A：在最后激发后各周，未感染的恒河猴中缺乏可检测的记忆性Env特异性IgA应答。B：感染的疫苗接种的动物中针对Env的强记忆性IgA应答。C：在最后激发后各周，在未感染的恒河猴中缺乏针对Env的可检测记忆性IgG应答。D：感染的疫苗接种的动物中针对Env的强记忆性IgG应答。数据呈现为中位数±四分位数间距。灰色箱图代表检测的背景。

图11.激发后的体液及细胞免疫应答。A：感染的疫苗接种的恒河猴中的SIV239 Env特异性IgG的滴度。注意感染动物中的强IgG应答。相对于恒河猴IgG的标准曲线估计的IgG滴度。D：感染动物中的激发后T细胞。

图12.疫苗引出的针对激发病毒Env的IgG的亲合力与保护作用相关。A：针对激发病毒SIVE660Env的引出的IgG的亲合力与攻击至感染的次数之间的显著相关性。数据呈现为针对3次独立测定的均数±一个标准偏差。未被12次激发感染的动物在14次激发时作图。使用双侧斯皮尔曼等级统计分析进行相关。B：疫苗接种的恒河猴的TRIM5α基因型不限制激发至感染的次数。r，限制性TRIM5α基因型（对于TRIM5αTFP或CYPA是纯合或杂合的）；s，易感基因型（对于TRIM5αQ是纯合的）；m，中等易感（对于限制性和容许性等位基因是杂合的）。未被12次激发感染的动物在第14次激发时作图。

图13.疫苗引出的针对激发病毒Env的IgG的亲合力与保护作用相关。A：针对SIV239Env的引出IgG的亲合力与激发至感染的次数之间缺乏相关性。在A中，数据是针对3次独立测定的均数±标准偏差。未被12次激发感染的动物在14次激发时作图。使用双侧斯皮尔曼等级统计分析进行相关。B：疫苗接种的恒河猴的Trim5α基因型与峰病毒血症高度之间缺乏相关性。r，限制性TRIM5α基因型（对于TRIM5αTFP或CYPA是纯合或杂合的）；s，易感基因型（对于TRIM5αQ是纯合的）；m，中等易感（对于限制性和容许性等位基因是杂合的）。水平线表示激发至感染的中位激发次数。对于激发至感染的次数与峰病毒血症高度两者，注意未接种疫苗的对照而不是接种疫苗的动物怎样对Trim5α限制作用敏感。

图14.表达HIV抗原和GM-CSF的GEO-D03DNA载体的序列（SEQ IDNO:7）。

图15.GEO-D06DNA载体(SEQ ID NO:8)表达HIV抗原和GM-CSF的序列。

图16.表达HIV抗原和GM-CSF的GEO-D07DNA载体的序列（SEQ IDNO:9）。

详细说明

本披露包括多种载体和载体类型（例如，质粒载体和病毒载体），每种载体可以，但不必然地，包括一个或多个编码一种或多种抗原的核酸序列，所述抗原引出（例如，诱导或增强）针对自其获得或衍生这种抗原的病原体的免疫应答（编码引出免疫应答的蛋白质的序列可以在此称为“疫苗插入片段”或简单地“插入片段”；当突变被引入天然发生的序列时，所得到的突变体是从天然发生的序列“衍生”的）。我们指出，这些载体不必然编码抗原以澄清没有“插入片段”的载体处于本披露的范围之内并且这些插入片段本身也是本披露的组合物。

因此，本披露以在此披露的核酸序列、其类似物和含有这些核酸的组合物（无论是载体加上插入片段或仅是插入片段；例如，生理上可接受的溶液，这些溶液可以包括载体如脂质体、钙、粒子（例如，金珠）或用来递送DNA至细胞的其他试剂）为特征。这些类似物可以是这样的序列，它们与在此披露的那些序列不相同，但是在与包括在本发明序列（例如，本文中披露的JS、IC、或IN序列中任一者）中的那些位置类似的位置处包括相同或相似的突变（例如，相同的点突变或相似的点突变）。可以在不同的HIV分化体中鉴定一个给定的残基或结构域，即使它并不精确地出现在相同的数字位置处。这些类似物也可以是包括突变的序列，虽然这些突变与在此所述的那些突变不同，但类似地使HIV基因产物失活。例如，截短到比此处所述基因之一更大或更小的程度但类似地被失活（例如，丧失特定酶活性）的一个基因是在本披露的范围之内。

在US-2003-0175292-A1（通过引用而结合）中更详细描述的病原体和抗原包括任何分化体的人免疫缺陷病毒（例如，来自任何已知的分化体或来自任何分离物（例如，分化体A、AG、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、或L）。另外的HIV序列和突变体序列是本领域已知的（例如，在洛斯阿拉莫斯的HIV序列数据库和在斯坦福的HIV RT/蛋白酶序列数据库）。当这些载体包括来自一种病原体的序列时，可以将它们施用至患者以引出免疫应答。因而，在此还描述了施用单独或彼此组合的抗原编码载体的方法。可以实施这些方法免疫患者（从而降低该患者被感染的风险）或治疗已经感染的患者；当这些抗原表达时可以引出细胞免疫应答和体液免疫应答，可以基本上预防感染（例如，免疫可以保护患者免受随后的病原体激发）或限制感染对患者健康的影响程度。虽然在许多情况下患者将人类患者，但是本披露并不如此限制。也可以治疗其他动物，包括非人灵长类、驯养动物和家畜。

在此所述的这些组合物，无论它们针对何种病原体或病原体亚型（例如，HIV分化体）)，可以包括核酸载体（例如，质粒）。如在此指出的，可以使用具有命名为pGA1、pGA2的质粒的一个或多个特征或特性（尤其是定向的终止序列和强启动子）的载体（当然，包括那些载体本身）作为疫苗或疗法的基础。可以使用标准重组技术（其中几种展示于下文实例中）工程化此类载体以包括编码抗原的序列，当施用至患者并且随后在其中表达时，这些抗原将引出（例如，诱导或增强）免疫应答，这种免疫应答为患者提供某种形式的对抗自其获得或衍生这些抗原的病原体的保护作用（例如，免受感染的保护、抵抗疾病的保护、或疾病的一种或多种体征或症状的减轻）。编码的抗原可以是任何HIV分化体或亚型或其任何重组形式。就来自免疫缺陷病毒的插入片段而言，不同分化体表现出聚类多样性，其中在一个分化体之内的每一分离物具有总体相似的偏离这个分化体的共有序列的多样性（参见，例如，Subbarao等人,AIDS 10(增刊A):S13-23,1996)。因而，大多数分离物可以用作相同分化体的其他分离物的序列的合理代表。因此，本披露的这些组合物可以用源自重组事件、选择剪接、或突变的基因或核酸分子的天然变体（这些变体可以在此简单地称为HIV的“重组形式”）而制成，并且在此所述的这些方法可以用这些天然变体实施。

而且，在任何构建体之内的一个或多个插入片段可以被突变以降低它们在人体中的天然生物学活性（并且因此增加它们的安全性）。

两个或更多个序列中的至少一个可以是突变体或经突变，从而限制病毒RNA的衣壳化（优选地，所述突变略微限制衣壳化）。可以使用本领域已知的技术导入突变和确定它们的影响（例如，对表达或免疫原性的影响）；仍然表达良好（例如，表达得与其野生型对应物大约一样好或较之更好的抗原)但与其野生型对应物相比生物学较活性更低的抗原是在本披露的范围之内。用于评定免疫应答的技术也是可获得的。例如，可以检测抗病毒抗体或病毒特异性T细胞。令人希望的是，提供的突变体载体或疫苗插入片段导致免疫原特异性抗体的亲合力增加（例如，至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、40%、或50%）、免疫原特异性抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、或500倍）、免疫原特异性IgA水平（例如，直肠分泌物中的IgA水平）增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍）、每微克总IgA在0.03至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.1至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、每微克总IgA在0.2至0.3ng之间的免疫原特异性IgA水平、抗HIV感染性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）、抗体依赖性细胞毒性增加（例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、或300%）、免疫原特异性CD4辅助T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）和/或免疫原特异性CD8细胞毒T细胞增加（例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%）、和/或中和抗体滴度增加（例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍）。

突变体构建体（例如，疫苗插入片段）可以包括编码在此所述的一个或多个置换突变体（参见，例如，实例）或另一个HIV分化体中的类似突变的序列。此外或可替代地，可以通过缺失编码HIV抗原的基因序列的部分使得这些抗原较具有较低活性。因而，本披露的组合物可以包括编码抗原的构建体，虽然这些抗原能够引出免疫应答，但它们是突变体（无论是否编码长度或含量与相应野生型序列不同的蛋白质）并且因此在患者中表达时执行其正常生物学功能的能力较低。如上文指出的，可以使用分子生物学和免疫学中的标准技术评定表达、免疫原性和活性。

这些DNA载体表达HIV-1抗原和GM-CSF，并且那些构建体可以被施用至如在此所述的患者。可以将GM-CSF序列导入表达HIV-1抗原的多种不同的DNA载体中。下文和在US-2003-0175292-A1中描述的JS7样插入片段是特别有用的。可以通过转染细胞如293T细胞（一种人胚肾细胞系）和评定抗原表达水平（通过例如，抗原捕获ELISA或蛋白质印迹法）来测试在本披露的范围之内的任何质粒的表达。

包括在这些载体和疫苗插入片段中的GM-CSF序列可以是一种全长的人GM-CSF（SEQ ID NO:10）或可以是一种多肽，它包括与GM-CSF(SEQ ID NO:10)至少95%一致的序列并且具有GM-CSF的一种或多种（例如，2种或3种）生物学活性（例如，能够刺激巨噬细胞分化和增殖、或活化抗原呈递树突细胞）。GM-CSF可以包括一种或多种突变（例如，一个或多个（例如，至少二、三、四、五、或六个）氨基酸置换、缺失、或添加））。令人希望的是，任何突变GM-CSF蛋白还具有（如上文所述的）GM-CSF的一种或多种（例如，2种或3种）生物学活性。用于测量GM-CSF蛋白的生物学活性的测定法是本领域已知的（参见，例如，美国专利号7,371,370；通过引用以其全部内容结合在此）。

本披露的核酸载体编码GM-CSF和从任何HIV分化体或分离物（即，HIV的任何亚型或重组形式）获得或衍生的至少一种抗原（它也可以称为免疫原）。这种抗原（或免疫原）可以是：HIV病毒的结构成分；是糖基化、豆蔻酰化的、或磷酸化的；是在胞内、在细胞表面上表达、或分泌的一种组分（可以将通常不分泌的抗原与指导分泌的信号序列连接）。更具体地，该抗原可以是Gag、Pol、Env（例如，gp160或gp120或利用CCR5的Env)、Tat、Rev、Vpu、Nef、Vif、Vpr、或VLP（例如，从VLP衍生的能够形成VLP（包括Env缺陷型HIV VLP）的多肽）的全部或抗原性部分。

具体的插入片段和带有插入片段的组合物包括以下。当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码单一抗原时，这种抗原可以是野生型或突变gag序列（例如，在一个或多个编码锌指的序列中于位置392、395、413、或416处的一个或多个半胱氨酸残基处具有变成另一个残基（例如，丝氨酸）的突变的gag序列，或者这种突变可以将位置390、393、411、或414处的一个或多个半胱氨酸残基改变成另一个残基（例如，丝氨酸））。

当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码多种蛋白质抗原时，这些抗原之一可以是野生型或突变gag序列，包括上文描述的那些。类似地，当一种组合物包括多于一个类型的载体或多于一个类型的插入片段时，这些载体或插入片段的至少一个（无论是编码单一抗原还是多种抗原）可以包括野生型或突变体gag序列，包括上文描述的那些或来自其他HIV分化体的类似序列。例如，当组合物包括第一和第二载体时，在任一种或两种载体中的疫苗插入片段（无论这种插入片段是否编码单一或多种抗原）可以编码gag；当两种载体都编码gag时，第一载体中的gag序列可以来自一个HIV分化体（例如，分化体B）而第二载体中的gag序列可以来自另一个HIV分化体（例如，分化体C）。

当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码单一抗原时，这种抗原可以是野生型或突变体pol。这个序列可以通过缺失或替换一个或多个核酸进行突变，并且这些缺失或置换可以产生比其野生型对应物具有较低酶活性（例如，较低的整合酶活性、较低的逆转录酶（RT）活性、或较低的蛋白酶活性）的Pol基因产物。例如，可以通过失活聚合酶活性位点或通过削弱链转移活性抑制RT。可替代地或另外地，可以抑制聚合酶的RNA酶H活性。当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码多种蛋白质抗原时，这些抗原之一可以是野生型或突变体pol序列，包括上文描述的那些（这些编码多种蛋白质的插入片段也可以编码上文描述的野生型或突变体gag序列）。类似地，当一种组合物包括多于一种类型的载体或多于一种类型的插入片段时，这些载体或插入片段的至少之一（无论是编码单一抗原还是多种抗原）可以包括野生型或突变体pol序列（和任选地，野生型或突变体gag序列，包括上文描述的那些（即，这些插入片段可以编码Gag-Pol）。例如，当组合物包括第一和第二载体时，任一种或两种载体中的疫苗插入片段（无论这种插入片段是编码单一抗原还是多种抗原）可以编码Pol；在两种载体都编码Pol的情况下，第一载体中的Pol序列可以来自一个HIV分化体（例如，分化体B）而第二载体中的Pol序列可以来自另一个HIV分化体（例如，分化体A或G）。

当一个插入片段包括pol序列的一些或全部时，pol序列的可以任选第加以改变的另一个部分是编码蛋白酶活性的序列（无论影响Pol的其他酶活性的序列是否已经改变）。当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码单一抗原时，这种抗原可以是野生型或突变体Env、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr、或Vpu。当组合物包括带有插入片段的载体或仅包括插入片段并且这种插入片段编码多种蛋白质抗原时，这些抗原之一可以是野生型或突变体Env。例如，表达多种蛋白质的插入片段可以编码野生型或突变体gag-Pol和Env；它们还可以编码野生型或突变体gag-Pol和Env以及Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr、或Vpu中的一种或多种（它们中的每一种可以是野生型或突变体）。如同其他抗原，Env、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr、或Vpu可以是由于缺失、添加、或置换一个或多个氨基酸残基（例如，这些抗原的任一种可以包括点突变）所致的突变体。就Env而言，一个或多个突变可以位于图19中所示的任一个结构域内。例如，一个或多个氨基酸可以从Env的gp120表面和/或gp41跨膜切割产物中缺失。就Gag而言，一个或多个氨基酸可以从以下一种或多种蛋白质缺失：基质蛋白（p17）、衣壳蛋白（p24）、核衣壳蛋白（p7）和C端肽（p6）。例如，这些区域中的一个或多个区域内的氨基酸可以缺失（当载体是病毒载体如MVA时，这可能是特别希望的）。就Pol而言，一个或多个氨基酸可以从蛋白酶蛋白（p10）、逆转录酶蛋白（p66/p51）、或整合酶蛋白（p32）缺失。

更具体地，本披露的组合物可以包括一种载体（例如，质粒载体或病毒载体），它编码：（a）一种其中已经失活一个或多个锌指以限制对病毒RNA包装的Gag蛋白；（b）一种Pol蛋白，其中（i）整合酶活性已经通过缺失一些或全部的pol序列而被抑制并且（ii）聚合酶、链转移和/或逆转录酶的RNA酶H活性已经通过在pol序列内中的一个或多个点突变而被抑制；和（c）具有或不具有突变的Env、Tat、Rev、和Vpu。在这个实施方案中，如同在其他实施方案中，编码的蛋白质可以从HIV的A、B或C亚型（例如，HIV-1)或其重组形式获得或衍生。当这些组合物包括不相同的载体时，每种类型的载体中的序列可以来自不同的HIV分化体（或亚型或其重组形式）。例如，本披露以包括质粒载体的组合物为特征，这些质粒载体编码刚才所述的抗原（Gag-Pol、Env等），其中这些质粒的一些包括从一个分化体获得或衍生的抗原而其他质粒包括从另一个分化体获得（或衍生）的抗原。代表二、三、四、五、六个或更多个分化体（包括全部分化体）的混合物是在本披露的范围之内。

当一种组合物中包括第一和第二载体时，任一种载体可以是pGA1/JS2、pGA1/JS7、pGA1/JS7.1、pGA2/JS2、pGA2/JS7、pGA2/JS7.1（可以使用在限制酶切位点中带有用于添加疫苗插入片段的其他排列的pGA1.1、pGA1.2或pGA载体替代pGA1，并且可以使用pGA2.1或pGA2.2替代pGA2）。类似地，任一种载体可以是pGA1/IC25、pGA1/IC2、pGA1/IC48、pGA1/IC90、pGA2/IC25、pGA2/IC2、pGA2/IC48、或pGA2/IC90（在此再一次可以使用pGA1.1或pGA1.2替代pGA1，并且可以使用pGA2.1或pGA2.2替代pGA2）。在可替代的实施方案中，编码的蛋白质可以是HIV的C亚型（例如，HIV1)或其重组形式的那些蛋白质或从其中衍生的那些蛋白质。例如，载体可以是pGA1/IN2、pGA1.1/IN2、pGA1.2/IN2、pGA1/IN3、pGA1.1/IN3、pGA1.2/IN3、pGA2/IN2、pGA2.1/IN2、pGA2.2/IN2、pGA2/IN3、pGA2.1/IN3、或pGA2.2/IN3。

编码的蛋白质也可以是HIV分化体（或亚型）E、F、G、H、I、J、K或L的任一个或其重组形式的那些蛋白质或从其中衍生的那些蛋白质。一个HIV-1分类系统已经由洛斯阿拉莫斯国家实验室公布（HIV序列Compendium-2001,Kuiken等人，由理论生物物理学研究组（TheoreticalBiology and Biophysics Group）T-10公布，洛斯阿拉莫斯,NM,（2001）），最近的HIV序列是在洛斯阿拉莫斯HIV序列数据库网站上可获得。

本披露的组合物也可以包括一种载体（例如，质粒载体），它编码：(a）一种其中已经失活一个或两个锌指的Gag蛋白；（b）一种Pol蛋白，其中（i）整合酶活性已经通过缺失一些或全部的pol序列而被抑制，（ii）聚合酶、链转移和/或逆转录酶的RNA酶H活性已经通过在pol序列内部的一个或多个点突变而被抑制和（iii）蛋白酶的蛋白酶解活性已经通过一个或多个点突变而被抑制；并且（c）具有或不具有突变的Env、Tat、Rev、和Vpu。如上文指出的，蛋白水解酶活性可以通过在SEQ ID NO:8的位置1641-1643处或在另一个HIV分化体的序列中类似的位置处导入突变而抑制。例如，这些质粒可以含有在此所述的插入片段如JS7、IC25和IN3。如同编码其他抗原的质粒那样，编码刚才所述的抗原的质粒可以与编码从一个不同HIV分化体（或亚型或其重组形式）获得或衍生的抗原的其他质粒组合（例如，与其混合）。这些插入片段本身(sans载体)也在本披露的范围之内。如在此文所述的，插入片段可以含有这些序列，它们编码一个或多个保守蛋白质序列和/或可以含有一个或多个设计者序列（例如，含有来自一个或多个HIV分化体的序列的镶嵌序列）。

本披露的其他载体包括编码一种Gag蛋白（例如，其中一个或两个锌指已经失活的一种Gag蛋白）；一种Pol蛋白（例如，其中已经抑制整合酶、RT、和/或蛋白酶活性的一种Pol蛋白）；一种Vpu蛋白（它可以由具有突变起始密码子的序列编码）；及Env、Tat、和/或Rev蛋白（处于野生型或突变体形式）的质粒。如同编码其他抗原的质粒那样，编码刚才所述的抗原的质粒可以与编码从一个不同HIV分化体（或亚型或其重组形式）获得或衍生的抗原的其他质粒组合（例如，与其混合）。这些插入片段本身(sans载体）也在本披露的范围之内。

上文描述的质粒，包括表达分化体B HIV-1序列的JS2或JS7系列的那些质粒，可以施用至任何受试者，但是可以最有益地施用至已经暴露于或可能暴露于分化体B的HIV的受试者（这同样适用于除质粒载体之外的载体）。类似地，可以将表达分化体C HIV-1序列的IN系列的质粒或其他载体施用至已经暴露于或可能暴露于HIV分化体C的受试者。由于可以将表达多种分化体的抗原的载体组合以引出针对多于一个分化体的免疫应答（无论一种载体表达多种抗原、或来自不同分化体的镶嵌或保守元件抗原或多种载体表达从来自不同分化体的单一抗原，可以均实现这一点），可以定制疫苗制剂以最佳地保护给定的受试者。例如，如果受试者可能暴露于除了分化体B之外的分化体占优势的世界地区，则可以配制和施用表达一种抗原（或多种抗原）的一种载体或多种载体，其中所述抗原将优化针对这个优势分化体或这些分化体的免疫应答的引出。

这些载体表达的抗原不是质粒载体的可以改变的唯一部分。有用的质粒可以含有或可以不含有显著抑制转录（通过互补碱基配对，依赖DNA模板形成RNA分子的过程）的终止序列。有用的终止序列包括λT0终止子和其功能片段或变体。这种终止序列以相同方向设置在载体之内并且处于表达在原核生物中的任何开放阅读框的C末端处（即，终止序列和开放阅读框是可操作地连接的）。通过防止质粒在原核细胞中复制时从选择标记至疫苗插入片段的通读，终止子在细菌生长和质粒复制时稳定了该插入片段。

选择标记基因是本领域已知的并且例如包括这些基因，它们编码对其中表达这种标记的细胞赋予抗生素抗性（例如，针对卡那霉素、氨苄青霉素、或青霉素的抗性）的蛋白质。选择标记如此命名，因为它允许人们通过在若这种标记缺乏将破坏细胞的条件下借助于细胞存活而选择这些细胞。选择标记、终止序列或这两者（或每一者或者两者的部分）可以是，但不必需是，在质粒施用至患者之前从其中切除。类似地，质粒载体可以按照圆环形式、在通过用限制性核酸内切酶消化线性化之后、或在载体“主链”的一些部分已经改变或缺失之后施用。

核酸载体也可以包括一个复制起点（例如，一个原核复制起点）和一个转录盒，这个转录盒除了含有编码抗原的插入片段可以克隆至其中的一个或多个限制性核酸内切酶位点之外，还任选地包括一个启动子序列和一个多聚腺苷化信号。可以使用称作强启动子的启动子并且它们可以是优选的。此类启动子之一是巨细胞病毒（CMV）中间早期启动子，不过可以使用其他（包括更弱的）启动子而不脱离本披露的范围。类似地，可以选择强的多聚腺苷化信号（例如，从牛生长激素（BGH）编码基因衍生的信号、或兔β珠蛋白多聚腺苷化信号（Bohm等人,J.J.Immunol.Methods193:29-40,1996；Chapman等人,Nucl.Acids Res.19:3979-3986,1991；Hartikka等人,Hum.Gene Therapy 7:1205-1217,1996；Manthorpe等人,Hum.Gene Therapy 4:419-431,1993；Montgomery等人,DNA Cell Biol.12:777-783,1993））。

这些载体可以进一步包括前导序列（一种作为组织纤维蛋白溶酶原激活剂基因前导序列（tPA）的合成性同源物的前导序列是在转录盒中任选的）和/或内含子序列，如巨细胞病毒(CMV)内含子A或SV40内含子。内含子A的存在增加了来自RNA病毒、细菌和寄生虫的许多抗原的表达，这大概是通过为表达的RNA提供支持作为真核mRNA加工和发挥作用的序列所致。表达也可以通过本领域已知的其他方法增强，所述其他方法包括，但不限于，针对真核细胞优化的原核mRNA的密码子使用（Andre等人，J.Virol.72:1497-1503,1998；Uchijima等人，J.Immunol.161:5594-5599,1998)。多顺反子载体可以用来表达多于一种免疫原或一种免疫原和一种免疫刺激性蛋白（Iwasaki等人，J.Immunol.158:4591-4601,1997a；Wild等人，Vaccine 16:353-360,1998）。因而（并且对于载体构建体的的其他任选组分也是适用的），编码来自一个或多个HIV分化体或分离物的一种或多种抗原的载体可以，但是不必然地，包括一个前导序列和一个内含子（例如，CMV内含子A)。

本披露的载体在可以用于接受抗原编码序列的位点方面和在转录盒是否包括CMVIE启动子中的内含子A序列方面不同。因此，本领域的技术人员可以修饰质粒内的插入位点或克隆位点而不脱离本披露的范围。内含子A和tPA前导序列两者已经在某些情况下显示出增强抗原表达（Chapman等人，Nucleic Acids Res 19:3979-3986,1991）。

如在此进一步描述的，本披露的这些载体可以与一种佐剂（包括一种基因佐剂）一起施用。因此，这些核酸载体，无论它们表达的抗原是什么，可以任选地包括此类基因佐剂如GM-CSF、IL-15、IL-2、干扰素应答因子、flt-3分泌形式、CD40配体和突变的半胱天冬氨酸酶基因。基因佐剂也可以按照融合蛋白的形式供应，例如通过将一个或多个C3d基因序列（例如，1-3个（或更多个）C3d基因序列）与表达的抗原融合。

在施用的载体是pGA载体的情况下，它可以包含例如pGA1(SEQID NO:1)或其衍生物（例如，SEQ ID NO:2和3)、或pGA2(SEQ ID NO:4)或其衍生物（例如，SEQ ID NO:5和6)的序列。在此更详细地描述了pGA载体（还参见实施例1-8）。pGA1是一个3897bp的质粒，它包括一个启动子（bp 1-690）（CMV-内含子A（bp 691-1638））、tPA前导序列（bp 1659-1721)的一个合成模拟物、牛生长激素多聚腺苷化序列（bp1761-1983）、λT0终止子（bp 1984-2018）、卡那霉素抗性基因（bp2037-2830）和ColEI复制基因（bp 2831-3890）。图2中显示了pGA1构建体的DNA序列（SEQ ID NO:1）。在图1中，所示的限制性酶切位点用于克隆编码抗原的序列。当一个疫苗插入片段的5′末端克隆在tPA前导序列上游时，使用了Cla I或BspD I位点。Nhe I位点用于将一个序列克隆在具有合tPA前导序列的框中。列于Sma I和Bln I之间的位点用于克隆编码抗原的序列的3′末端。

pGA2是缺乏pGA1中存在的947bp内含子A序列的一个2947bp质粒。pGA2与pGA1相同，除了缺乏内含子A序列之外。pGA2用于克隆不需要用于高效表达的上游内含子的序列、或用于克隆这些序列，在这些序列中上游内含子可能干扰良好表达所需要的剪接模式。图5呈现了具有用于克隆疫苗插入片段的有用限制酶切位点的pGA2的示意图。图6a显示了pGA2的DNA序列(SEQ ID NO:2)。用于将疫苗插入片段克隆到pGA2中的限制酶切位点的用途与用于将片段克隆到pGA1中的限制性位点的用途相同。pGA2.1和pGA2.2是pGA2的多克隆位点衍生物。图7a和图8a分别显示了pGA2.1(SEQ ID NO:5)和pGA2.2(SEQ ID NO:6)的DNA序列。

具有与在此披露的那些主链序列不同的“主链”序列的pGA质粒也在本披露的范围之内，只要这些质粒基本上保持为治疗有效而必需的所有特征（例如，可以替换核苷酸、添加核苷酸、或缺失核苷酸，只要当施用至患者时这种质粒诱导或增强针对给定或所希望的病原体的免疫应答即可）。例如，可以缺失或替换1-10个、11-20个、21-30个、31-40个、41-50个、51-60个、61-70个、71-80个、81-90个、91-100个、或多于100个核苷酸。

在一个实施方案中，本披露的这些方法（例如，在患者中引出免疫应答的方法）可以通过向患者施用治疗有效量的一种生理学上可接受的组合物来进行，这种组合物包括一种载体，这种载体可以含有编码引出针对HIV的免疫应答的一种或多种抗原的疫苗插入片段。这种载体可以是一种质粒载体，它具有上文描述的并且与选择标记基因可操作地连接的pGA构建体的一个或多个特征（例如，一个选择标记基因、一个原核复制起点、一个终止序列（例如，λT0终止子）和一个真核转录盒，这个真核转录盒包含启动子序列、编码从一种免疫缺陷病毒衍生的至少一种抗原的核酸插入片段和多聚腺苷化信号序列）。当然，本披露的疫苗插入片段可以由没有pGA构建体的特征的质粒载体（例如，除pGA1或pGA2之外的的载体）递送。可替代地，这种组合物可以包括包含在此所述的插入片段的任何病毒或细菌载体。因此，本披露还包括施用至少两种（例如，三、四、五、或六中）载体（例如，含有相同疫苗插入片段（即，编码相同抗原的插入片段）的质粒或病毒载体）。如在其他地方解释的，患者可以接受两种类型的载体，并且这些载体的每一种可以引出针对不同分化体的HIV的免疫应答。例如，本披露以其中患者接受一种组合物的方法为特征，这种组合物包括（a）第一载体，它包含编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引出针对第一亚型或重组形式的人免疫缺陷病毒（HIV）的免疫应答，和（b）第二载体，它包含编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引出针对第二亚型或重组形式的HIV的免疫应答。第一和第二载体可以是本文所述的那些载体的任一种。类似地，第一和第二载体中的插入片段可以是在此所述的那些插入片段的任一种。

治疗有效量的一种载体（无论是否考虑第一、第二、第三等载体）可以与生理学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂一起和任选地连同佐剂通过肌内途径、粘膜途径、或皮内途径施用。治疗有效量的相同或不同的载体可以与生理学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂一起和任选地连同加强免疫应答的佐剂通过肌内或皮内途径施用。此类组分可以由本领域普通技术人员轻易地选择，无论掺入疫苗或借以递送这些抗原的载体中的抗原的确切性质是什么。

引出免疫应答的方法可以通过仅施用本披露的质粒载体、通过仅施用本披露的病毒载体、或通过同时施用这两者（例如，可以施用一种“引发”这种免疫应答的质粒载体（或质粒载体的混合物或组合）)和一种“加强”这种免疫应答的病毒载体（或病毒载体的混合物或组合）)来实施。当施用质粒载体和病毒载体时，它们的插入片段可以是“匹配的”。为了是“匹配的”，质粒载体和病毒载体之内的这些插入片段的一个或多个序列（例如，编码Gag的序列、或编码Env等的序列）可以是相同的，但是该术语并不如此限制。“匹配”的序列也可以彼此不同。例如，当DNA载体中使用的序列经突变或进一步突变以允许（或优化）在病毒载体感染的细胞中编码这些序列的病毒载体的复制和编码的抗原（例如，Gag、Gag-Pol、或Env)的表达时，由这种病毒载体表达的插入片段与这种DNA载体表达的那些插入片段“匹配”。

在这些方法的某些实施方案中，向受试者施用一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的一种载体，这种载体含有一个原核复制起点、一个启动子序列、一个含有编码一种或多种免疫原和GM-CSF的疫苗插入片段的真核表达盒、一个多聚腺苷化序列和一个转录终止序列。如果向受试者施用两个或更多个剂量的在此所述的载体，则此类剂量两者可以相隔至少1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周、16周、20周、或24周施用。一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的一种载体（如在此所述）可以进一步与一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的编码一种或多种（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、或十种）HIV免疫原的MVA疫苗一起施用。在此类实施方案中，这种MVA疫苗可以在相隔例如1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周、16周、20周、或24周后施用至受试者。一次或多次（例如，二、三、四、五、或六次）施用了至少一个（例如，二、三、四、五、或六个）剂量的在此所述的载体之一。在另外的实施方案中，在向受试者施用在此所述的至少一种载体的同时向该受试者施用至少一个剂量的一种MVA疫苗。在在评估（例如，由医师进行的医学评估）受试者体内的免疫应答后，可以向受试者施用另外剂量的一种或多种在此所述的载体和/或在此所述的MVA疫苗。

将本披露的至少一些免疫缺陷病毒疫苗插入片段设计成从单个DNA中产生非感染性的VLP（可以包括真VLP以及病毒蛋白聚集物的一个术语）。这通过使用通常由免疫缺陷病毒用来从单个病毒RNA中表达多个基因产物的亚基因组剪接元件而实现。亚基因组剪接模式受（i）全长病毒RNA中存在的剪接位点和接纳体（ii）Rev应答元件（RRE）和（iii）Rev蛋白的影响。逆转录病毒RNA中的剪接位点使用真核mRNA中的剪接位点的规范序列。RRE是一个大约200bp的RNA结构，它与Rev蛋白相互作用以允许病毒RNA从胞核转运至细胞质。在缺乏Rev的情况下，免疫缺陷病毒的大约10kb RNA大多经历剪接以产生调节基因Tat、Rev、和Nef的mRNA。这些基因由RT与Env之间和在基因组3′末端处存在的外显子编码。在Rev存在下，除多重剪接的Tat、Rev和Nef的mRNA之外，还表达了单一剪接的Env的mRNA和未剪接的Gag和Pol的mRNA。

从单个DNA表达非感染性的VLP提供了许多相对于免疫缺陷病毒疫苗的优点。从单个DNA表达许多蛋白质为接种疫苗的宿主提供了应答于这些蛋白质中所包含的宽泛的T-细胞表位和B-细胞表位的机会。表达含有多个表位的蛋白质允许通过多种组织相容性类型呈递表位。通过使用完整的蛋白质，为不同组织相容性类型的宿主提供了产生广基的（broad-based）T细胞应答的机会。这可能对于有效遏制其高突变速率支持轻易逃避免疫应答的免疫缺陷病毒感染是重要的（Evans等人，Nat.Med.5:1270-1276,1999；Poignard等人，Immunity10:431-438,1999,Evans等人，1995）。在本发明疫苗接种方案的背景下，如同药物疗法中那样，需要针对逃避的多突变的多表位T细胞应答将比单表位T细胞应答（其仅需要针对逃避的单突变）提供更好的保护。

也可以将免疫原工程化以通过靶向表达的抗原至特定细胞区室而或多或少有效地产生抗体或Tc。例如，与定位于细胞内部的抗原相比，抗体应答由展示在细胞的质膜上或从细胞中分泌出来的抗原更有效地产生(Boyle等人，Int.Immunol.9:1897-1906,1997；Inchauspe等人，DNA Cell.Biol.16:185-195,1997)。Tc应答可以通过使用N端遍在蛋白化信号增强，这种N端遍在蛋白化信号将DNA编码的蛋白质靶向至蛋白体，引起快速的细胞浆降解作用和更有效的肽加载于MHC I途径中（Rodriguez等人，J.Virol.71:8497-8503,1997；Tobery等人，J.Exp.Med.185:909-920,1997；Wu等人，J.Immunol.159:6037-6043,1997）。关于DNA产生免疫应答的机理基础的综述，参考Robinson和Pertmer,Advances in Virus Research，第53卷，Academic Press(2000)。

操纵免疫应答的另一种方法是将免疫原与免疫靶向分子或免疫刺激分子融合。迄今为止，这些融合的最成功者已经将分泌的免疫原靶向到抗原呈递细胞（APC）或淋巴结上（Boyle等人，Nature 392:408-411,1998）。因而，本披露以在此所述的与免疫靶向分子或免疫刺激分子如CTLA-4、L-选择素、或细胞因子（例如，白细胞介素如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL10、IL-15、或IL-21）融合的HIV抗原为特征。编码此类融合物的核酸和含有它们的组合物（例如，载体和生理学上可接受的制剂）也在本披露的范围之内。

DNA可以按照多种方式递送，可以用这些方式的任一种将本披露的质粒递送至受试者。例如，DNA可以在例如盐水中注射（例如，使用皮下注射针）、作为弹丸递送（例如，借助将DNA包覆的珠加速的基因枪）或通过电穿孔递送。盐水注射将DNA递送至细胞外间隙中，而基因枪法将轰击DNA直接递送至细胞中。电穿孔短暂地破坏细胞膜的完整性，从而允许DNA进入。盐水注射需要比基因枪法大得多的DNA量（典型地多于100-1000倍）(Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:11478-11482,1993)。这些类型的递送还不同在于，盐水注射法和电穿孔法偏向于1型辅助T细胞反应，而基因枪递送偏向于2型辅助T细胞反应（Feltquate等人，J.Immunol.158:2278-2284,1997；Pertmer等人，J.Virol.70:6119-6125,1996）。在盐水中注射的DNA快速地扩散全身。由基因枪递送的DNA更多局限于靶位点。在任一个接种方法后，细胞外质粒DNA具有大约10分钟的短半寿期（Kawabata等人，Pharm.Res.12:825-830,1995；Lew等人，Hum.Gene THer6:553,1995）。通过盐水注射的接种可以是肌内（i.m.）注射、皮内（i.d.）注射、或粘膜注射（如下文更详细地描述）；可以将基因枪递送物施用至皮肤或手术暴露的组织如肌肉。

虽然其他递送途径通常是较不有利的，然而可以用它们来施用本披露的组合物。例如，DNA可以施加至粘膜或通过肠胃外接种途径施加。鼻内施用盐水中的DNA已经获得良好的成功（Asakura等人，Scand.J.Immunol.46:326-330,1997；Sasaki等人，Infect.Immun.66:823-826,1998b）和有限的成功（Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:11478-82,1993）。在将DNA递送至阴道粘膜后，基因枪法已经成功地产生IgG（Livingston等人，Ann.New York Acad.Sci.772:265-267,1995）。还已经使用脂质体（McCluskie等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8:401-414,1998）、微球体（Chen等人，J.Virol.72:5757-5761,1998a；Jones等人，Vaccine 15:814-817,1997）、和重组志贺菌载体（Sizemore等人，Science270:299-302,1995；Sizemore等人，Vaccine 15:804-807,1997）在递送DNA至粘膜表面方面实现了某种成功。可以使用例如这些介质（脂质体、微球体和重组志贺菌载体）来递送本披露的核酸。

为产生一种应答所需要的DNA的剂量取决于递送方法、宿主、载体、和编码的抗原。递送的方法可以是最有影响力的参数。10μg至5mg的DNA通常用于DNA的盐水注射，而0.2μg至20μg的DNA更典型地用于DNA的基因枪递送。通常，较低剂量的DNA用于小鼠中（对于盐水注射为10-100μg，并且对于基因枪递送为0.2μg至2μg)，并且较高剂量的DNA用于灵长类中（对于盐水注射为100μg至1mg，并且对于基因枪递送为2μg至20μg）。基因枪递送所需要的少得多的DNA量反映出金珠直接递送DNA至细胞中。

除上文描述的DNA载体之外，众多不同的痘病毒可以单独（即，没有核酸或DNA引发）使用或用作作疫苗方案的加强组分。MVA已经是在小鼠模型中特别有效的（Schneider等人，Nat.Med.4:397-402,1998）。MVA是一个为根除天花运动目标所开发的高度减毒的痘苗病毒株，并且它已经在超过100,000个人中进行了安全性测试（Mahnel等人，Berl.Munch Tierarztl Wochenschr 107:253-256,1994；Mayr等人，Zentralbl.Bakteriol.167:375-390,1978）。在鸡细胞中超过500次传代期间，MVA丢失了大约10%的基因组和在灵长类细胞中高效复制的能力。尽管其复制受限，但是已经证明MVA是一种高度有效的表达载体（Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10847-10851,1992），在灵长类中产生针对副流感病毒（Durbin等人，J.Infect.Dis.179:1345-1351,1999）、麻疹（Stittelaar等人，J.Virol.74:4236-4243,2000）、和免疫缺陷病毒（Barouch等人，J.Virol.75:5151-5158,2001；Ourmanov等人，J.Virol.74:2740-2751,2000；Amara等人，J.Virol.76:7625-7631,2002）的保护性免疫应答。MVA的相对高的免疫原性已经部分地归因于丢失几种抗免疫病毒防御基因（Blanchard等人，J.Gen.Virol.79:1159-1167,1998）。

已经使用痘苗病毒来工程化用于重组基因表达的病毒载体并且用作重组活疫苗（Mackett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:7415-7419；Smith等人，Biotech.Genet.Engin.Rev.2:383-407,1984）。可以将编码在此所述的任何HIV抗原的DNA序列导入痘苗病毒的基因组中。如果这种基因整合在病毒DNA中对于病毒生活周期为非必需的位点处，则新产生的重组痘苗病毒病毒可能是感染性的（即，能够感染外来细胞）并且可能表达整合的DNA序列。优选地，在本披露的组合物和方法中表征的病毒载体是高度减毒的。开发了几个避免不希望的天花接种副作用的痘苗病毒减毒株。通过安卡拉痘苗病毒株在鸡胚成纤维细胞（CVA；参见Mayr等人，Infection 3:6-14,1975）上长期连续传代，产生了改良安卡拉痘苗病毒（MVA）病毒。MVA病毒从美国典型培养物保藏中心（American TypeCulture Collection)（ATCC；No.VR-1508；Manassas,VA）是公开可得的。已经在临床试验中展示了MVA株的令人希望的特性（Mayr等人，Zentralbl.Bakteriol.167:375-390,1978；Stickl等人，Dtsch.Med.Wschr.99:2386-2392,1974；还参见Sutter和Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10847-10851,1992）。在这些研究过程中，在超过120,000个人（包括高风险患者）中，没有与MVA疫苗的使用相关的副作用。

MVA载体可以如下制备。将包含DNA序列的一个DNA构建体在允许同源重组发生的条件下导入MVA感染的细胞中，其中所述DNA序列编码一种外来多肽（例如，在此所述的任何HIV抗原）并且其侧翼为与MVA基因组内部的天然发生的缺失（例如，缺失III或其他非必需位点）相邻的MVA DNA序列；已经鉴定了总计31,000个碱基对的六个基因组DNA主要缺失（命名为缺失I、II、III、IV、V、和VI）（Meyer等人,J.Gen.Virol.72:1031-1038,1991））。也可以将插入引入到天然发生的缺失（其中缺失位点经修饰以增强插入的稳定性）中，或使用在插入位点侧翼的序列将插入引入在必需基因之间。必需基因之间已经证明有用的一个位点是18G1（参见，例如，Wyatt等人，Retrovirology 6:416,2009)。一旦DNA构建体已经导入真核细胞中并且外来DNA已经与病毒DNA重组，则可以通过本领域已知的方法分离重组痘苗病毒（可以通过使用检测标记促进分离）。待插入的DNA构建体可以是线性或环状的（例如，质粒、线性化质粒、基因、基因片段、或修饰的HIV基因组）。外来DNA序列插入在天然发生的缺失的侧翼序列之间、在经修饰的天然发生的缺失的序列之间、或在标记两个必需基因的界限的序列之间。为了更好地表达DNA序列，该序列可以包括调节序列（例如，启动子,如痘苗病毒11kDa基因或7.5kDa基因的启动子）。可以通过多种方法（包括磷酸钙辅助转染（Graham等人，Virol.52:456-467,1973和Wigler等人，Cell 16:777-785,1979）、电穿孔（Neumann等人，EMBO J.1:841-845,1982）、显微注射（Graessmann等人，Meth.Enzymol.101:482-492,1983）、通过脂质体（Straubinger等人，Meth.Enzymol.101:512-527,1983）、通过球状体（Schaffner,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:2163-2167,1980）、或通过本领域已知的其他方法将这种DNA构建体导入MVA感染的细胞中。

当通过病毒载体递送DNA时，可以实现适当的剂量，正如使用质粒载体时可以做到那样。例如，可以递送1x10⁸pfu的一种基于MVA的疫苗，并且施用可以经肌内、皮内、静脉内、或粘膜进行。

因此，本披露以一种组合物为特征，这种组合物包括（a）第一病毒载体，它包含编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引出针对第一亚型或重组形式的人免疫缺陷病毒（HIV）的免疫应答，和（b）第二病毒载体，它包含编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引出针对第二亚型或重组形式的HIV的免疫应答。这种病毒载体可以是重组痘病毒或改良安卡拉痘苗病毒(MVA)病毒，并且插入片段可以是来自任何分化体的在此所述的任何HIV抗原（例如，可以施用预防或治疗有效量的编码进化体A、B、或C HIV（例如，HIV-1抗原）的MVA。而且，当与质粒载体联合施用时（例如，在“DNA引发”后施用时），源自MVA的序列可以与质粒序列“匹配”。例如，表达重组分化体B序列的痘苗病毒（例如，MVA）可以与JS系列的质粒插入片段匹配。类似地，表达重组分化体A序列的痘苗病毒（例如，MVA）可以与IC系列的质粒插入片段匹配；表达重组分化体C序列的痘苗病毒（例如，MVA）可以与IN系列的质粒插入片段匹配。虽然下文例示了具体的分化体，然而本披露并不如此限制。含有病毒载体的组合物可以包括表达来自任何已知分化体（包括分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、或L)的HIV抗原的病毒载体。当然，引出免疫应答的方法可以用也表达来自任何这些分化体的抗原的组合物或用设计者HIV基因如镶嵌基因（例如，含有来自一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）HIV分化体的序列）或保守表位基因（例如，编码一个或多个（例如，二、三、四、五、或六个）保守蛋白质表位序列的核酸序列）来进行。

此处描述的质粒或病毒载体可以与一种佐剂（即，添加至一种疫苗以增加这种疫苗的免疫原性的任何物质）一起施用，并且它们可以通过任何常规的施用途径（例如，肌内、皮内、静脉内或粘膜；参见下文）施用。与此处所述的载体（无论基于DNA还是病毒的载体）一起使用的佐剂可以是一种缓慢释放抗原的佐剂（例如，该佐剂可以是脂质体），或它可以是一种本身具有强烈免疫原性的佐剂（这些佐剂被认为协同起作用）。因此，此处描述的疫苗组合物可以包括已知的佐剂或促进DNA摄入、将免疫系统细胞募集至接种部位、或促进相应淋巴样细胞的免疫活化的其他物质。这些佐剂或物质包括油和水乳液、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、卡介苗、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、藻酸钠、Bacto佐剂、某些合成聚合物如聚氨基酸和氨基酸的共聚物、皂甙、REGRESSIN(Vetrepharm，雅典，GA.)、阿夫立定（N,N-双十八烷基-N′,N′-双(2-羟乙基）-丙二胺）、石蜡油和胞壁酰二肽。还有用的是结合有物质如MPL和QS21的由Smith Kline研制的命名为AS01、AS02、AS03、AS04的佐剂和由Novartise研制的命名为MF59的佐剂。AS02含有在水包油乳液中的MPLTM和QS-21。AS04也由MPL组成，但是与明矾组合。MPL由在脂肪酸取代的程度和位置方面变化的一系列4′-单磷酰脂质A种类组成。它从明尼苏达沙门氏菌R595的脂多糖（LPS）中通过用温和酸和碱水解处理LPS，随后纯化修饰的LPS来制备。也可以使用编码在相同或共接种的载体上的免疫调节分子的基因佐剂。例如，GM-CSF、IL-15、IL-2、干扰素应答因子和突变的半胱天冬氨酸酶基因可以包含在编码病原性免疫原（如HIV抗原）的载体上或在施用这种免疫原的相同时间或在这个时间附近施用的独立载体上。表达的抗原也可以与佐剂序列（如C3d的1个、2个、3个或更多个拷贝）融合。

可以按照多种方式施用在此所述的组合物，包括经过任何肠胃外或局部用途径。例如，可以通过静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌内方法接种个体。接种可以是例如采用皮下注射针、无针递送装置如驱使液体流进入靶部位中的那些装置、或使用将金珠上的DNA轰击到靶部位中的基因枪。可以通过多种方法将包含病原体疫苗插入片段的载体施用至粘膜表面，这些方法包括但不限于电穿孔、鼻内给药（例如，滴鼻剂或吸入剂）、或通过溶液剂、凝胶剂、泡沫剂、或栓剂直肠内或阴道内给药。可替代地，可以按片剂、胶囊剂、咀嚼片、糖浆、乳剂等形式口服给予包含疫苗插入片段的载体。在可替代的实施方案中，可以经皮、通过被动皮肤贴剂、离子导入手段等给予载体。

可以用任何生理学可接受的介质将包含疫苗插入片段的载体（无论是基于核酸的载体或活载体）引入患者中。例如，本领域已知的适合的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖、或缓冲溶液。这些介质可以包括助剂，如稀释剂、稳定剂（即，糖（先前提到的葡萄糖和右旋糖）和氨基酸）、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、增强粘度或易注射性（syringability）的添加剂、着色剂等。优选地，介质或载体将不产生副作用或将仅产生远逊于所传递益处的副作用。

通过以下实例进一步说明本披露，这些实例以说明的方式提供并且不应当解释为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、公开的专利申请和专利特此通过引用以其全部内容结合。已经描述了本披露的许多实施方案。然而，将理解的是，可以作出多种修改而不脱离本披露的精神和范围。

实施例

实例1.表达GM-CSF的DNA载体诱导免疫应答

下文描述了显示研究结果的研究，这些研究结果比较了用两种DNA载体免疫，一种载体表达GM-CSF并且一种载体不表达GM-CSF。图1显示了表达HIV抗原和GM-CSF的适合的DNA载体。

激发实验的详细讨论

我们测试了基于SIVmac239（SIV239）的疫苗诱导抗体和T细胞以预防异源SIVsmE660（SIVE660）激发所致感染的能力。这种疫苗由用来引发免疫应答的重组DNA和用来加强应答的重组MVA组成。这种疫苗的DNA组分和MVA组分均表达免疫缺陷病毒的三种主要蛋白质：Gag、Pol、和Env，并且产生非感染性病毒样颗粒。在存在和缺乏与SIV免疫原共表达的GM-CSF下测试SIV疫苗。

使用反复的中等剂量直肠激发设计这项研究以更好地模拟人暴露（McDermott等人，J.Virol.78:3140-3144,2004；Keele等人，J.Exp.Med.206:1117-1134,2009）。同样，为了更好地代表人暴露，这项研究包括使用与免疫原异源的激发病毒。具体而言，SIVmac239序列用于疫苗中，并且将SIVsmE660（一种在Gag中91%相关并且在Env中83%相关的病毒）用于攻击（Yeh等人，J.Virol.83:2686-2696,2009；Reynolds等人，J.Exp.Med.205:2537-2550,2008）。这种变异水平是与当前大流行中的分化体B分离株之间观察到的变异水平可比较的（Yeh等人，2009；Reynolds等人，2008）。我们的首要目标是测试免疫对激发至感染的次数的影响；并且随后，对于感染的动物，测试免疫对控制激发后病毒复制的影响。次要目标是鉴定潜在的保护相关性。

如在2图中所示，在时间0和在第8和第16周用DNA HIV抗原载体（D）或DNA HIV抗原/GM-CSF载体(D_GM)免疫恒河猴。然后在第16和第24周用MVA载体免疫它们。恒河猴经受直肠内（见图3）激发每周一次持续12周或直至随着异源SIV E660激发观察到感染为止。由这种病毒编码的Gag与这种免疫原91%相关并且由这种病毒编码的Env83%相关。以5000TCID₅₀（约MID₃₀，1.8x10⁷个病毒RNA拷贝）进行激发。

图4显示了在这些研究中所使用的SIV239DNA和重组MVA疫苗的示意图。通过在表达SIV239Gag、Pol和Env序列的质粒中插入恒河猴GM-CSF序列，构建了共表达GM-CSF的DNA疫苗（SIV239DNA）。这种共表达GM-CSF的DNA表达大约200ng GM-CSF/106个瞬时转染的293T细胞，一个已发现与用于细胞性癌疫苗的增强的免疫应答相关的表达水平。一种单重组MVA也表达了Gag、Pol和Env，但是不共表达GM-CSF（Van Rompay等人，J.Virol.83:2686-2696,2009）。两种疫苗均表达膜结合型三聚体形式的包膜糖蛋白，目的在于引出针对病毒粒子和感染细胞上存在的Env形式的抗体。MVA疫苗表达病毒样颗粒，而DNA疫苗中过量表达的Gag-pol序列形成胞内聚集物以及病毒样颗粒。DNA免疫原中GM-CSF的共表达未引起血液学或血液化学方面的变化或未引出针对GM-CSF的可检测抗体（数据未显示）。

DDMM和DgDgMM方案引出了Env特异性血清IgG的相似时间模式和幅度，但是引出了直肠分泌物中Env特异性IgA的不同模式（图5A、B)。在两个组中，IgG应答在MVA加强后上升并且到激发时间时下降到其峰值的大约20%。在第一次MVA加强后检测到被测量为特异活性（每μg总IgA的Env IgA的ng数）的IgA，并且在第二次MVA加强后在检测频率和高度方面均增加。在激发时，IgA滴度已经缩减大约50%。在峰IgA应答时，在DgDgMM组中57%的动物内检测到Env特异性IgA，与DDMM基团中12%的动物形成对比。Env IgA在分泌物中的特异活性比血液中更大，这表明直肠IgA源自局部粘膜合成。

进一步分析引出的IgG应答表明，由DgDgMM方案引出的Env特异性IgG在性质上不同于由DDMM方案引出的Env特异性IgG。GM-CSF在免疫原中的共表达增加了Env特异性IgG应答的亲合力（图5C）。这种增强对于免疫原的SIV239 Env是明显的并且对于激发病毒的SIVE660Env显示出一种趋势。与较高的亲合力一致，GM-CSF佐剂化组中的Env特异性Ab具有较高的中和活性和较高的ADCC活性（图5D和E）（Xiao等人,J.Virol.84:7161-7163,2010）中和活性的滴度对于两个易于中和的从遗传多样的SIVE660激发储存物中衍生的分离物：SIV660.11和SIVE660.17增加，并且对于SIVE660.11实现显著性。一个更难于中和分离物SIVE660.CR54的中和Ab低于TZM-bl测定法中的检测水平（数据未显示）。还测试了ADCC活性，并且来自DDMM和DgDgMM两组的血清均含有能够介导ADCC活性的抗体。来自DgDgMM的血清具有比DDMM血清显著更高的ADCC活性（图5E）。图6和图7呈现了关于M11恒河猴直肠分泌物中的Env特异性和Gag/Pol特异性IgA抗体水平的数据。

使用外周血单核细胞（PBMC）的胞内细胞因子染色（ICS）对引出的T细胞应答分析它们的幅度、宽度和细胞因子共表达，这些外周血单核细胞用代表SIV239Gag和Env的肽汇集物进行刺激（图8）。ICS测定法测试了干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达谱。与其中这两个组之间存在差异的引出的抗体应答相反，未检测到T细胞应答的差异。两种疫苗方案均引出了CD4和CD8T细胞应答的相似时间幅度（图8A和B）、CD4和CD8T细胞应答的相似宽度（图8C和D）和相应CD4和CD8T细胞的相似多功能性模式（图8E和F，和数据未显示）。在贯穿免疫阶段所实施的增殖测定中也没发现差异（数据未显示）。

反复直肠激发在末次MVA免疫后6个月时（当疫苗引出的应答已经缩减成记忆应答的时间）启动。感染在DDMM疫苗组和DgDgMM疫苗组中均延迟，DgDgMM组以高度显著的水平抵抗感染（图9A）。如上文指出的，DgDgMM组中71%（5/7）的动物针对12次激发受到保护，而仅25%（2/8）DDMM组动物受到保护。9只对照动物除1只之外均因第5次激发而感染并且剩余的动物在第11次激发时感染。GM-CSF佐剂化组与未接种疫苗组的保护作用的差异是高度显著的（p=0.003,Mantel Cox检验）。在佐剂化组与非佐剂化组之间和在非佐剂化组与未接种疫苗组之间的差异显示在我们的组大小范围内没有实现显著性的趋势。激发后病毒血症的时间水平表明GM-CSF佐剂化组中一种更严紧和持久的控制（图9B）。尽管DgDgMM组中存在令人鼓舞的对照，这个组中的模式没有与其他组显著不同，原因是DgDgMM组中感染的动物数目小以及在其他组中激发后对照的可变水平。

在两个疫苗组中，对感染的预防是彻底的。在末次激发后12个月期间没有找到病毒复制或引出SIV特异性免疫应答的证据。这包括在直肠分泌物中缺乏记忆性Env特异性IgA应答（图10A)、在血液中缺乏记忆性Env特异性IgG应答（图10C）和缺乏Nef（一种在激发病毒中存在但不存在于疫苗中的蛋白质）的应答T细胞。这与接种疫苗和感染的动物形成强烈对比，在这些动物中，直肠分泌物中的强记忆性Env特异性IgA应答（图10B）、血液中记忆性IgG应答（图10D）和Nef的应答T细胞（数据未显示）清楚地是显而易见的。

接种疫苗和感染的动物还显示血液中的强记忆性IgG应答（图11B）。

在GM-CSF佐剂化组中较高的中和抗体滴度及ADCC抗体活性以及抗Env IgA的存在与保护作用不相关（表1）。引出的T细胞应答也与激发至感染的次数不相关（表1）。与亲合力的关联对于激发病毒的Env是特异的，而对SIV239免疫原的Env没有观察到这种关联（表1）。

表1.疫苗引出的应答与激发至感染的次数之间的关联1

1除第1次和第2次MVA加强后1周进行宽度的关联之外，在第2次MVA加强后1周进行了T细胞的关联。在第2次MVA加强后2周进行了Ab应答的关联，除了SIVE660.17的中和Ab的关联是在第2次MVA加强后13周进行以外。所有关联是针对15个XY对，除了在第2次MVA后宽度y是针对13个XY对的那些关联之外。这些关联使用了双尾非参数斯皮尔曼检验。在没有用于多重比较的邦弗朗尼校正的情况下显示P值。对于16个分析的显著性0.05的邦弗朗尼校正具有针对E660Env的亲合力与感染预防之间的关联的P值0.003。

感染预防的相关分析揭示了在针对激发E660Env的Env特异性IgG的亲合力与激发至感染的次数之间的强相关（r=0.9,p=<0.0001)（图12A）。亲合力关联表明，具有大于40的亲合力指数的动物在12次激发期间在很大程度生受到保护而免于感染。

为了检验TRIM5α（一种在恒河猴中呈多态性的先天限制性因子）是否可能在我们的研究结果发挥作用，将恒河猴针对TRIM5α分型。如上文指出的，这些分析的结果揭示，在接种疫苗的动物中在激发至感染的次数与限制性（r）、中等限制性（m）、或易感性（s）TRIM5α基因型的存在之间没有关联（图12B）。在7只受保护的动物中，4只具有易感性TRIM5α基因型；3只具有中等易感性基因型；并且没有一个具有限制性基因型。因而，可能没有TRIM5α在接种疫苗和受保护的动物中限制感染的证据。

对于针对免疫原的SIV239Env的疫苗引出的IgG的亲合力，没有观察到亲合力与感染预防之间的关联（图13A）。同样，在E660.11或E660.17的中和滴度、直肠分泌物中抗Env IgA的存在或测试的T细胞应答与感染预防之间没有观察到关联（数据未显示）。在一项重叠试验中也观察到针对E660Env的疫苗引出的Ab的亲合力与感染预防之间的强关联，这项重叠试验测试了作为239疫苗佐剂的CD40配体。测试CD40配体的试验的关联直接重叠测试GM-CSF的试验的那些关联，从而增强并重复了Ab的非中和活性是感染预防的强相关的研究结果。

DNA引发中用于MVA加强的共表达的GM-CSF实现了高度显著的对抗反复直肠激发的保护作用，而没有共表达的GM-CSF的疫苗仅显示感染预防的趋势。在共表达的GM-CSF存在下，71%的接种疫苗的动物受到保护而免于12次反复直肠激发，而在缺乏共表达的GM-CSF的情况下，该组仅25%的动物受到保护。这些结果表明，将低GM-CSF表达水平靶向到DNA免疫部位可以充当预防免疫缺陷病毒感染的强力佐剂。感染预防的强相关物是疫苗引出的Env特异性IgG的亲合力。具有大约40或更高的亲合力指数的动物未感染，而具有低于40的亲合力指数的那些动物显示其亲合力指数与感染所需要的激发次数之间的强关联。给定这些结果，我们提出，由三聚体膜结合型Env引出的Ab可能识别病毒粒子和感染细胞上的Env，并且如果这种Ab具有足够的亲合力，则它可以启动Fc-介导的保护机制，如补体(C′)介导的溶解、调理作用、ADCC和抗体依赖性细胞介导的病毒抑制作用(ADCVI)(Xiao等人，J.Virol.84:7161-7173m2010；Huber等人，J.Intern.Med.262:5-25,2007)。Ab的Fc区域也可以与宫颈粘液结合，从而为病毒感染提供Ab陷阱(Hope等人，Program andAbstracts of AIDS Vaccine 2010，摘要S04.01)。在用我们的HIV疫苗的恒河猴研究中，我们已经显示，由我们的分化体B疫苗引出的Env特异性Ab对伴随的分化体B具有广谱亲合力，但是对伴随的分化体C分离物没有广谱亲合力；并且显示，由我们的分化体C疫苗引出的Ab对伴随的分化体C的Env具有广谱亲合力，但是对伴随的分化体B分离物的Env没有广谱亲合力(Zhao等人，J.Virol.83:4102-4111,2009)。因而，我们提出高亲合力Ab可以具有广阔的内分化体（intraclade）活性。这种提议与关于补体和Fc介导的Ab介导保护机制的研究一致，这些研究显示患者血清具有介导针对患者分离物的这些活性的良好宽度（breadth）。

DNA疫苗中GM-CSF的共表达增加针对SIV239免疫原Env和SIVE660激发Env两者的亲合力。然而，为了观察亲合力与激发至感染的次数之间的关联，需要测量针对激发储存物（challenge stock）的SIVE660Env的亲合力。SIV239Env可以引出针对SIVE660Env的保护性亲合力，但是需要使用激发Envl来评估这种保护作用的靶。这些结果显示在Env上存在高亲合力Ab的多个保守靶，并且表明每一分离物将展示不同的保守靶格局。

与Ab应答相反（其中我们测量的5个特征中有4个被共表达的GM-CSF增强）；我们针对T细胞应答所测量的特征中没有一个改变。这可能反映了我们的测定法集中于1型辅助T细胞而不是滤泡CD4+辅助T细胞的特征的应答上，其中后者支持生发中心中的Ab应答的成熟或受到GM-CSF刺激的树突细胞促进的2型辅助T细胞的引出。GM-CSF刺激展示GM-CSF受体的髓样树突细胞的扩大和分化。髓样树突细胞优先移行至淋巴结边缘区，在淋巴结边缘区中用于B细胞成熟的生发中心经历形成。GM-CSF刺激的髓样树突细胞产生IL-6，一种用于形成生发中心和生发中心中B细胞生长和分化的重要细胞因子。同样，GM-CSF刺激的髓样树突细胞促进2型辅助T细胞（一种不展示由HIV用作共受体的CCR5趋化因子受体的辅助细胞类型）的引出。因而，GM-CSF佐剂可以通过引出不在粘膜表面植入优选的感染靶的辅助T细胞类型而促进感染预防。

疫苗引出的IgG的亲合力与激发至感染的次数之间的强关联首次证明，亲合力可以为防止免疫缺陷病毒激发所致的感染提供血清学相关物。这种证明为HIV疫苗研制引入了一个新概念，非中和性但是紧密结合Ab可以介导粘膜感染的预防。引出广泛中和性Ab的能力已经令疫苗开发者困惑，并且在天然感染中是罕见的。相反，在实际上所有感染中引出针对天然形式Env的结合Ab。因而，引出针对天然形式Env的高亲合力结合Ab的疫苗可能能够为一种疫苗提供保护性体液组分。

发现Ab应答的亲合力对于保护作用是重要的先前的疫苗实例包括结合疫苗。这些疫苗在2岁以下的儿童中将T细胞非依赖性免疫原转变成T细胞依赖性免疫原并且允许由多糖刺激出来的Ab经历亲合力成熟。例如，由针对B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）(Hib)（Scgkesubger等人，JAMA 267:1489-1494,1992）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumononiae）(pneumococcus)（Anttila等人，J.Infect.Dis.177:1614-1621,1998）的疫苗引出的Ab应答的亲合力对于其保护活性是关键的。失效的麻疹病毒疫苗和呼吸道合胞病毒疫苗引出非保护性低亲合力Ab（Polack等人，Nat.Med.9:1209-1213,2003；Delgado等人，Nat.Med.15:34-41,2009）。测量针对HIV-1免疫原的亲合力可能是特别重要的，原因在于针对高度糖基化Env的Ab成熟缓慢（Parekh等人，AIDS Res.HumanRetroviruses 17:137-146,2001）。

总之，我们的数据显示，用于MVA加强的共表达GM-CSF的DNA引发在71%的恒河猴中引出预防感染的免疫应答，这些恒河猴接受以比人异性间性交期间的HIV-1更频繁30至300倍传播的异源SIV剂量的12次反复直肠内激发（Royce等人，New Eng.J.Med.336:1072-1078,1997）。SIVE660激发具有与典型HIV感染相同的趋向性（Margolis等人，Nat.Rev.Microbiol.4:312-317,2006）并且与SIV239疫苗株的遗传距离与HIV-1分化体特异性疫苗相对于分化体分离物之内具有的遗传距离相似。有争议地，将一种非中和性血清学标记（针对激发病毒Env引出的IgG的亲合力）鉴定为感染预防的相关物。

对于共表达GM-CSF的疫苗所发现的感染预防增强的程度是没有预料到的。使用高剂量激发的先前研究已经显示，共表达GM-CSF的载体可以增强疫苗介导的峰病毒血症减弱(Lai等人，GM-CSF DNA：GM-CSF DNA:an adjuvant for higher avidity IgG，rectal IgA,and increasedprotection against the acute phase of a SHIV-89.6P challenge by a DNA/MVAimmunodeficiency virus vaccine（一种用于更高亲合力IgG、直肠IgA和对抗DNA/MVA免疫缺陷病毒疫苗所致SHIV-89.6P激发急性期的保护作用增加的佐剂）.Virology 369:153-67,2007；Zhao等人，Preclinical studies ofhuman immunodeficiency virus/AIDS vaccines:inverse correlation betweenavidity of anti-Env antibodies and peak postchallenge viremia（人免疫缺陷病毒/AIDS疫苗的临床前研究：抗Env抗体亲合力与激发后峰病毒血症之间的反相关）.J Virol 83:4102-11,2009）。在这项研究中，使用反复的中度剂量激发，出现了实际的感染预防（不仅仅控制峰病毒血症），而GM-CSF将这种预防从25%增加至71%。这种预防与针对激发病毒Env的Env特异性抗体应答的亲合力相关。使用共表达的CD40配体作为佐剂同时实施的研究也增强了Env特异性抗体应答的亲合力，但是没有增强感染预防到对共表达GM-CSF的疫苗所观察到的相同程度。因而，GM-CSF共表达显得是通过高亲合力抗体结合之外的机制提供了保护作用。我们提议，这可以反映GM-CSF共表达促进该疫苗引发2型辅助T细胞（Th2），而不是1型辅助T细胞（Th1）.DNA的盐水注射倾向于引发Th1辅助细胞（Feltquate等人，Different T helper cell types and antibody isotypesgenerated by saline and gene gun DNA immunization（由盐水和基因枪DNA免疫产生的不同辅助T细胞类型和抗体同种型）.Journal of Immunology158:2278-84,1997；Oran等人，DNA vaccines,combining form of antigen andmethod of delivery to raise a spectrum of IFN-gamma and IL-4 CD4+andCD8+T cells（DNA疫苗，产生一系列IFN-γ和IL-4CD4+和CD8+T细胞的抗原及递送方法的组合形式）.Journal of Immunology 171:1995-2005,2003)。Th1辅助细胞在其表面上展示还充当HIV感染共受体的CCR5趋化因子受体（Bonecchi等人，Differential expression of chemokine receptorsand chemotactic responsiveness of type 1 T helper cells and type 2 T helpercells（1型辅助T细胞和2型辅助T细胞的趋化因子受体和趋化应答性的不同表达）.Journal of Experimental Medicine 187:129-34,1998)。相反，在缺乏其他刺激性信号的情况下，GM-CSF刺激髓样树突细胞（DC）以引出Th2辅助细胞，但是需要除GM-CSF之外的信号（如CD40配体、TNF-α）以引出Th1细胞（Faith等人,Functional plasticity of human respiratory tractdendritic cells:GM-CSF enhances T(H)2 development（人呼吸道树突细胞的功能塑性：GM-CSF增强T(H)2发育）.J Allergy Clin Immunol 116:1136-43,2005；Stumbles等人,Resting respiratory tract dendritic cells preferentiallystimulate T helper cell type 2(Th2)responses and require obligatory cytokinesignals for induction of Th1 immunity（静息性呼吸道树突细胞优先刺激辅助T细胞2型（Th2）应答并且需要用于诱导Th1免疫的必须的细胞因子信号）.Journal of Experimental Medicine188:2019-31,1998）。Th2细胞展示CCR4和CCR3并且不展示由Th1细胞所展示的CCR5趋化因子受体（Sallusto等人，The role of chemokine receptors in directing traffic of naive,type 1 and type 2 T cells（趋化因子受体在指导天然1型和2型T细胞的转变中的作用）.Curr Top Microbiol Immunol 246:123-8,1999)。可能的是，GM-CSF佐剂可以使展示CCR5的CD4 T细胞的引出最小化，特别是当GM-CSF佐剂由扩充髓样DC的DNA提供时，无需提供其他模式识别受体刺激。对于HIV疫苗而言，这是令人希望的，因为抗病毒CCR5 CD4T细胞对于感染是优先靶（Douek等人，HIV preferentially infects HIV-specificCD4+T cells（HIV优先感染HIV特异性CD4+T细胞）.Nature 417:95-8,2002)。同样，通过接种的病毒特异性CCR5展示CD4T细胞的高水平引出已经显示出降低了疫苗效力）（Kannanganat等人,Preexisting VacciniaVirus Immunity Decreases SIV-Specific Cellular Immunity but Does NotDiminish Humoral Immunity and Efficacy of a DNA/MVA Vaccine（预先存在的痘苗病毒免疫降低了DNA/MVA疫苗的SIV特异性细胞免疫但是不减弱体液免疫和效力）.J Immunol;185:7262-73）。

方法

疫苗。通过将恒河猴GM-CSF序列插入表达SIV239 Gag、PR、RT、Env、Tat、和Rev的pGA1/SIV239 DNA质粒（称为D）以产生共表达GM-CSF的质粒（称为Dg)，构建共表达GM-CSF的DNA疫苗（图4）。这些DNA疫苗通过从亚基因组剪接和移码从单一RNA中表达多种SIV蛋白。使用脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点（IRES），GM-CSF由与Env相同的mRNA表达。对于每106个瞬时转染的293T细胞，Dg表达大约200ng的GM-CSF。

一种单重组MVA（先前命名为DR1或MVASIVgpe并且此处命名为M）表达Gag、Pol和Env，但是不共表达GM-CSF（图20）。这种MVA疫苗在MVA的缺失III中编码gag和RT序列并且在MVA的缺失II中编码env序列。这种MVA疫苗表达VLP，而DNA疫苗中过量表达的Gag形成胞内聚集物以及VLP。这种DNA疫苗表达Env的完整gp160形式，并且这种MVA疫苗编码一种gp150形式，这种形式经截短以除去gp41亚基的C末端处的146个氨基酸，以便增强在感染细胞的质膜上的表达并且稳定插入片段（Wyatt等人,Virology 372:260-272,2008）。两种疫苗均表达膜结合型三聚体形式的包膜糖蛋白。

研究设计。动物研究在耶基斯国家灵长类研究中心实施并且由埃默里大学动物管理与使用委员会批准。年轻成体雄性恒河猴经预先筛查以排除使用具有Mamu-A*01组织相容性类型的动物并且限制使用具有Mamu-B*08和B*17类型的动物至每组一只，因为这些组织相容性类型与增强的SIV感染控制相关（Kirmaier等人,PloS Biology 8,2010）。将动物随机分组至佐剂化疫苗组和非佐剂化疫苗组，每组8只。在第0和8周施用3mg DNA疫苗并且在第16和24周施用1×10⁸个空斑形成单位的MVA疫苗。所有疫苗接种均通过针头注射而肌内递送。在激发时加入的对照组由9只年轻成体雄性动物组成，它们类似地经选择以呈Mamu A*01、B*08和B*17阴性。

使用5000个半数组织培养感染剂量（1.8x10⁷拷贝的病毒RNA）的SIVE660，在末次MVA免疫之后开始6个月的重复给药直肠内激发（Keele等人,J.Exp.Med.206:1117-1134,2009）。在三个独立试验中，这个剂量在不依赖Mamu类型、性别、年龄和机构环境的每个暴露感染大约30%的接种疫苗的动物（数据未显示，B Felber和G.Pavlakis，个人通讯）。在激发之前，GM-CSF佐剂化组中的一只动物因自残而被实施安乐死。在整个研究期间，进行血液学和临床化学检验以评估与使用GM-CSF相关的任何潜在毒理学效应。如所描述那样，通过代表TRIM5TFP、CYPA和Q等位基因的PCR片段的序列分析确定了TRIM5基因型（Kirmaier等人，2010）。

抗体测定法。使用SIV239VLP或rgp130mac251（Immunodiagnostics,Woburn,MA）作为Env抗原的来源，在用于IgG和IgA的测定中分别确定血清中的Env特异性IgG和用Weck-Cel海棉收集的直肠分泌物中的Env特异性IgA的滴度（Lai等人,Virology 369:153-167,2007）。使用双重ELISA确定在1.5M NaSCN洗涤x100后留下的Ab的亲合力指数或分数（Lai等人,2007）。使用从通过瞬时转染293T细胞所产生的VLP中捕获的SIV239Env和从在恒河猴PBMC上扩增一轮后的激发病毒储存物捕获的SIVE660ENV作为抗原底物。使用来自接种疫苗的恒河猴的汇集血清作为每一测定中的参考标准。这种样品具有平均亲合力指数38和标准偏差3。使用HIV假病毒粒子和萤光素酶报道基因测定法在TZM-bl细胞中实施中和测定法，这些HIV假病毒粒子具有代表来自遗传多样的SIVE660储存物中的分离物的Env（Montefiori,Evaluating neutralizing antibodies against HIV,SIV andSHIV in a luciferase reporter gene assay（在萤光素酶报道基因测定法中评价针对HIV、SIV和SHIV的中和抗体）,New York:John Wiley and Sons,2004）。通过修改一种先前公开的方法来实施抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）的测定（Packard等人,J.Immunol.179:3812-3820,2007）。简而言之，使用重组SIVmac239 gp120（Immune Tech Corp）来包被CEM.NKRCCR5细胞作为靶，并且来自未感染的人健康供体的白细胞分离法样品以30:1的效靶比（effector to target ratio）用作效应器。用以粒酶B切割后发射荧光的底物预加载靶细胞。在37℃孵育1小时后，将已经从效应细胞接受粒酶B并且评分为荧光阳性的靶细胞的%报道为粒酶B%（GzB%）活性。如果在扣减不与血清孵育的效应细胞和靶细胞的GzB%后，%GzB是>9％，则血清稀释物视为阳性。

细胞免疫测定。使用与刺激PBMC的SIV239免疫原匹配的肽汇集物（按11重叠的15聚体），实施细胞免疫测定和应答的宽度（Lai等人,Virology369:153-167,2007）。使用细胞内细胞因子染色（ICS）测量应答细胞。使用13种Gag肽汇集物和11种Env肽汇集物测试应答的宽度。进行Boolean分析以测量多功能性（(Kannanganat等人,J.Virol.81:12071-12076,2007）。使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色的丧失测试增殖（Velu等人,J.Virol.81:5819-5828,2007）。

统计学。使用Graphpad Prism和TIBCO Spotfire SPLUS 8.1实施统计。

实例2编码HIV免疫原和人GM-CSF的DNA载体

产生了含有原核复制起点、启动子序列、真核转录盒、多聚腺苷化序列和转录终止序列的三种示例性DNA载体，其中该真核转录盒包含编码一种或多种免疫原和GM-CSF的疫苗插入片段。DNA载体GEO-D03显示在17图中(SEQ ID NO:7)。DNA载体GEO-D06显示在18图中(SEQID NO:8)。DNA载体GEO-D07显示在19图中(SEQ ID NO:9)。

如在此所述，GEO-D03、GEO-D06和GEO-D07载体可以用来在受试者（例如，具有HIV的受试者或存在发生HIV的风险的受试者）体内诱导免疫应答、用来治疗具有HIV的受试者、用来制造在受试者（例如，具有HIV的受试者或存在发生HIV的风险的受试者）体内诱导免疫应答的药剂。

实例3.I期临床研究

下文描述了在健康的未感染的未接触过痘苗病毒的成年参与者中评价一种引发-加强疫苗GEO-D03DNA（SEQ ID NO:7）和MVA/HIV 62的安全性和免疫原性的I期临床研究。

这个I期试验是一项剂量递增研究，其中0.3mg GEO-D03并且随后3mg EO-D03 DNA将用来引发恒定的MVA62B加强（1x108 TCID50）。这种剂量递增将允许仔细评估GEO-D03在其首次引入人体时的反应原性和耐受性。

受试者纳入标准包括：年龄18至50岁，总体健康良好，血红蛋白≥11/0g/dL,WBC为3,000至12,000个细胞/mm³，总淋巴细胞计数≥800个细胞/mm³，愿意接受HIV检验结果，血小板在125,000至550,000mm³之间，ALT<1.25倍规定正常上限，肌酐≤规定正常上限,心肌肌钙蛋白I或T不超过规定正常上限，HIV-1或-2血试验阴性和乙型肝炎表面抗原阴性。

在DDMMM方案中，GEO-D03/MVA62B的这个I期试验将在第0和第8周测试两次DNA引发，随后在第16、24和32周测试3次MVA加强。HVTN 065的结果表明，对于最大T细胞应答，需要两次DNA引发。HVTN 065的结果还表明，对于最佳Ab应答可能需要3次MVA接种。关于Ab应答的时间研究显示MMM方案中的第3次MVA增加了抗Env Ab滴度大约4倍。

描述了两种产品。第一种是质粒DNA疫苗GEO-D03（SEQ IDNONO:7），它是在cGMP/GLP条件下制造的。第二种产品MVA/HIV62B（MVA62B）是一种由BioReliance Ltd,Glasgow,Scotland在cGMP/GLP条件下制造的重组痘苗病毒。

GEO-D03是从pGA2/JS7（JS7）质粒DNA疫苗产生的，这种质粒DNA疫苗在BB-IND 12930下的HVTN 065和205中施用至正常受试者。GEO-D03因在缺失的nef序列的位置中插入人GM-CSF的435个碱基对开放阅读框而不同于JS7（图14；SEQ ID NO:7)。JS7是由一个命名为pGA2的2.9kb表达载体和一个6.6kb疫苗插入片段组成的9.5kb质粒DNA，其中所述疫苗插入片段表达来自经历过亚基因组剪接的单一转录物的多种HIV-1分化体B蛋白。这种疫苗插入片段表达HIV-1的BH10株的蛋白酶（PR）和逆转录酶（RT）序列；来自HXB-2序列和ADA HIV-1序列的重组体的tat、rev、vpu、和env；和来自HIV-1HXB-2的gag。通过缺失长末端重复序列（LTR）、vif、vpr、和nef以及编码整合酶的pol区域；并且通过将失活点突变导入病毒RNA的包装序列和蛋白酶、逆转录酶、链转移及Pol的RNA酶H结构域中，使这种疫苗无感染性。通过使用标准重组DNA技术插入合成基因实现GM-CSF的添加。随着添加GM-CSF基因，新质粒（GEO-D03）的大小是9.9kb。除了HIV-1序列之外，在GEO-D03质粒DNA之内没有已知的病毒蛋白或致癌蛋白编码序列。在293T细胞中瞬时转染中，GEO-D03表达每24小时大约200ng人GM-CSF（每10⁶个细胞）。

MVA/HIV62B(MVA62B)是从用来构建JS7DNA的相同序列表达HIV-1gag、pol和env基因的高度减毒的痘苗病毒。Mayr和同事首先于1975年在德国生产MVA作为天花疫苗用于被视为对于标准痘苗病毒接种2,3存在不良风险的个体。

MVA源自在安卡拉疫苗接种站经驴-小牛-驴传代保存多年的皮肤痘苗病毒绒毛膜尿囊痘苗病毒安卡拉株（CVA）。在1953年，Mayr和同事纯化了CVA并且将它经牛传代2次。在1954/55年，这种纯化的产物用于联邦德国作为天花疫苗。在1958年，采用CVA的减毒实验始于在鸡胚成纤维细胞（CEF）中终末稀释。在360次传代后，将这个病毒通过3次连续空斑纯化进行克隆并且在CEF中维持至570传代。在570次传代之后，病毒在来自经确认没有造白细胞组织增生的鸡群中的细胞上进行空斑纯化。

在CEF中连续传代的过程中，9%的DNA从CVA株中丢失并且对哺乳动物细胞的毒力大大减弱。特别地，所得到的MVA株在人细胞2-4中经历顿挫感染。在516次传代后，这种病毒被称为“改良安卡拉痘苗病毒”并且交给德国国家研究所，Bayerische Landesimpfanstalt，在那里用高达2×10⁶pfu剂量实施人临床试验。

来自在原代CEF中已经在1974年2月22日收获的第572代的冷冻干燥的MVA病毒样品在2001年8月从德国Mayr博士直接送抵NIAID处的Bernard Moss博士。使用经认证的试剂（包括γ照射过的胎牛血清（来自无牛海绵状脑病的来源）和胰蛋白酶，将重建的病毒通过终末稀释法在CEF（从10日龄无特异病原体[SPF]的能育鸡蛋制得，这些鸡蛋由B&E蛋品公司，York Springs,Pennsylvania分销）中空斑纯化3次。进行无菌性检验和支原体检验并且均为阴性。这种MVA病毒用来制备当前的重组MVA/HIV62构建体。

通过将Gag-Pol表达盒导入MVA的缺失III中并将Env表达盒导入缺失II5中来构建MVA/HIV62。两个表达盒均使用mH5早期/晚期启动子用于疫苗插入片段的表达。MVA/HIV62中的pol基因含有与JS7DNA疫苗中存在的突变相同的突变，除了不包括PR中的失活点突变之外。Env表达盒含有一个上游起始密码子，它具有表达一个33个氨基酸的融合蛋白的潜能，该融合蛋白由一个多克隆位点所编码的7个氨基酸残基和Vpu的26个C端氨基酸组成。这个上游起始密码子减弱了Env的表达。在该融合蛋白中的序列在基因组数据库中没有针对这个7氨基酸序列及其在已知Vpu匹配之外的融合的匹配。

MVA62在SPF CEF中制造并且配制在由PBS和7.5%蔗糖组成的缓冲液中。针对DNA疫苗和MVA疫苗两者的安慰剂是符合美国药典的0.9%注射用氯化钠。

主要终点1是确定严重局部反应原性（疼痛、触痛、红斑、硬结、和最高严重性）和全身反应原性（发热、不适感/疲劳、肌痛、头痛、恶心、呕吐、寒战、关节痛、和最高严重性）在接种的前72小时之内的频率。主要终点2是对于治疗组的箱线图的本地实验室值的分布。主要终点3是治疗组在整个试验期间所有其他不良事件的频率。

次要终点1是在末次MVA加强后2周时评定HIV-1特异性抗Env抗体应答：针对ADA gp140的HIV结合Ab的的频率和滴度，及针对HIV-1-MN的中和抗体的频率和滴度，以及针对tier 1和tier 2分离物的中和Ab的宽度。次要终点2是评定HIV-1特异性CD4+和CD8+T细胞应答：在末次MVA疫苗接种后2周时由IFN-γ和/或IL-2度量的针对HIV肽的CD4+T细胞应答的频率，这些HIV肽代表由HIV-1免疫原表达的Gag、Pol和Env蛋白；并且在末次MVA疫苗接种后2周时由IFN-γ和/或IL-2度量的针对HIV肽的CD8+T细胞应答的频率，这些HIV肽代表由HIV-1免疫原表达的Gag、Pol和Env蛋白。

探索性目标1将通过测试DNA疫苗对抗GM-CSF Ab的引出评定安全性。探索性终点1将确定在第2次GEO-D03疫苗接种后2周时抗GM-CSF Ab的频率和滴度。

探索性目标2将评定Env特异性抗Env引出的结合性Ab的亲合力。探索性终点2将使用biacore分析（在Duke实施）和用磷酸盐缓冲盐水或硫氰酸钠洗液处理的双重ELISA，测定在第3次MVA接种后2周时Env特异性抗Env结合Ab的亲合力指数。

探索性目标3将在HIV血清学检验研究结束时通过商业测定法评估疫苗诱导的阳性结果的频率。探索性终点3将使用商业Ab并且在适宜时使用蛋白质印迹试验测定HIV阳性Ab应答的频率。

探索性目标4将测试在每次DNA免疫后3、5、7、和14天时GM-CSF在血液中的存在。探索性终点4将确定在每次DNA免疫后3、5、和7天时GM-CSF在血液中的滴度。

探索性目标5将使用luminex测定法评定应答T细胞的Th1和Th2细胞因子的产生。探索性终点5将确定在刺激后48小时由肽刺激的PBMC产生的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL10和IL-13的滴度。

探索性目标6将评定在第1次、第2次和第3次MVA加强后GM-CSF佐剂化应答的特征。探索性终点6将实施在第1次、第2次和第3次MVA加强后在第1、3和7天时的PBMC微阵列分析。

探索性目标7将评定抗Env Ab应答的时间滴度以评定第3次MVA加强的重要性。

探索性终点3将评定在第1次、第2次和第3次MVA加强后针对不同底物的Env特异性Ab的滴度。

实例4载体中使用的示例性HIV免疫原序列

下文提供了可以包括在此处所述的任何载体或疫苗插入片段中的免疫原核酸序列的非限制性实例。另外，提供了可以由存在于在此所述的任何载体或疫苗插入片段中的序列编码的免疫原蛋白质序列的非限制性实例。下文所列的免疫原序列中的一个或多个（例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、或十二）可以包含于所提供的任何载体和疫苗插入片段（如果是一个核酸序列）中或由其编码（如果是一个蛋白质序列）。env HIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:11）（存在于GEO-D03中的序列）

ATGAAAGTGAAGGGGATCAGGAAGAATTATCAGCACTTGTGGAAAT

GGGGCATCATGCTCCTTGGGATGTTGATGATCTGTAGTGCTGTAGAA

AATTTGTGGGTCACAGTTTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAAGAAGC

AACCACCACTCTATTTTGTGCATCAGATGCTAAGCATATGATACAG

AGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCC

AACCCACAAGAAGTAGTATTGGAAAATGTGACAGAAAATTTTAACA

TGTGGAAAAATAACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGT

TTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTG

TGTTACTTTAAATTGCACTGATTTGAGGAATGTTACTAATATCAATAA

TAGTAGTGAGGGAATGAGAGGAGAAATAAAAAACTGCTCTTTCAAT

ATCACCACAAGCATAAGAGATAAGGTGAAGAAAGACTATGCACTTT

TTTATAGACTTGATGTAGTACCAATAGATAATGATAATACTAGCTATAG

GTTGATAAATTGTAATACCTCAACCATTACACAGGCCTGTCCAAAGG

TATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTACCCCGGCTGGTTTTG

CGATTCTAAAGTGTAAAGACAAGAAGTTCAATGGAACAGGGCCATG

TAAAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCAGTA

GTGTCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGG

TAGTAATTAGATCTAGTAATTTCACAGACAATGCAAAAAACATAATA

GTACAGTTGAAAGAATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACA

ACAATACAAGGAAAAGTATACATATAGGACCAGGAAGAGCATTTTAT

ACAACAGGAGAAATAATAGGAGATATAAGACAAGCACATTGCAACA

TTAGTAGAACAAAATGGAATAACACTTTAAATCAAATAGCTACAAAA

TTAAAAGAACAATTTGGGAATAATAAAACAATAGTCTTTAATCAATC

CTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAATGCACAGTTTTAATTGTGGA

GGGGAATTTTTCTACTGTAATTCAACACAACTGTTTAATAGTACTTG

GAATTTTAATGGTACTTGGAATTTAACACAATCGAATGGTACTGAAG

GAAATGACACTATCACACTCCCATGTAGAATAAAACAAATTATAAAT

ATGTGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGAG

GACAAATTAGATGCTCATCAAATATTACAGGGCTAATATTAACAAGA

GATGGTGGAACTAACAGTAGTGGGTCCGAGATCTTCAGACCTGGGG

GAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAA

GTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAAA

GAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAACGATAGGA

GCTATGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCG

CAGCGTCAATAACGCTGACGGTACAGGCCAGACTATTATTGTCTGGT

ATAGTGCAACAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAAC

AGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGC

AAGAGTCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAGGGATCAACAGCTCCTA

GGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATCTGCACCACTGCTGTGC

CTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAAACTCTGGATATGATTTGGGAT

AACATGACCTGGATGGAGTGGGAAAGAGAAATCGAAAATTACACA

GGCTTAATATACACCTTAATTGAAGAATCGCAGA ACCAACAAGAAA

AGAATGAACAAGACTTATTAGCATTAGATAAGTGGGCAAGTTTGTG

GAATTGGTTTGACATATCAAATTGGCTGTGGTATGTAAAAATCTTCAT

AATGATAGTAGGAGGCTTGATAGGTTTAAGAATAGTTTTTACTGTACT

TTCTATAGTAAATAGAGTTAGGCAGGGATACTCACCATTGTCATTTCA

GACCCACCTCCCAGCCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAAT

CGAAGAAGAAGGTGGAGACAGAGACAGAGACAGATCCGTGCGATT

AGTGGATggatccttagcacttatctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttga

gagacttactcttgattgtaacgaggattgtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggt

ggaatctcctacagtattggagtcaggagctaaagaatagtgctgttagcttgctcaatgccacagctatagcagt

agctgaggggacagatagggttatagaagtagtacaaggagcttatagagctattcgccacatacctagaaga

ataagacagggcttggaaaggattttgctataa

Env HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:12）（由GEO-D03编码的序列）

MKVKGIRKNYQHLWKWGIMLLGMLMICSAVENLWVTVYYGVPVWK

EATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLENVTENF

NMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTDLRNVTNI

NNSSEGMRGEIKNCSFNITTSIRDKVKKDYALFYRLDVVPIDNDNTSYR

LINCNTSTITQACPKVSFEPIPIHYCTPAGFAILKCKDKKFNGTGPCKNV

STVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRS SNFTDNAKNIIVQLKES

VEINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHCNISRTKWNNTL

NQIATKLKEQFGNNKTIVFNQSSGGDPEIVMHSFNCGGEFFYCNSTQLF

NSTWNFNGTWNLTQSNGTEGNDTITLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAP

PIRGQIRCS SNITGLILTRDGGTNSSGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKY

KVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGTIGAMFLGFLGAAGSTMGA

ASITLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARV

LAVERYLRDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKTLDMIWDNMT

WMEWEREIENYTGLIYTLIEESQNQQEKNEQDLLALDKWASLWNWF

DISNWLWYVKIFIMIVGGLIGLRIVFTVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPA

PRGPDRPEGIEEEGGDRDRDRSVRLVDGSLALIWDDLRSLCLFSYHRL

RDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNAT

AIAVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERILL

env HIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:13）（存在于GEO-D06中的序列）

ATGAGAGTGAAGGGGATACTGAGGAATTATCGACAATGGTGGATAT

GGGGCATCTTAGGCTTTTGGATGTTAATGATTTGTAATGGAAACTTG

TGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAAGAAGCAAAAA

CTACTCTATTCTGTGCATCAAATGCTAAAGCATATGAGAAAGAAGTA

CATAATGTCTGGGCTACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCC

ACAAGAAATGGTTTTGGAAAACGTAACAGAAAATTTTAACATGTGG

AAAAATGACATGGTGAATCAGATGCATGAGGATGTAATCAGCTTATG

GGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAGTTGACCCCACTCTGTGTC

ACTTTAGAATGTAGAAAGGTTAATGCTACCCATAATGCTACCAATAAT

GGGGATGCTACCCATAATGTTACCAATAATGGGCAAGAAATACAAAA

TTGCTCTTTCAATGCAACCACAGAAATAAGAGATAGGAAGCAGAGA

GTGTATGCACTTTTTTATAGACTTGATATAGTACCACTTGATAAGAAC

AACTCTAGTAAGAACAACTCTAGTGAGTATTATAGATTAATAAATTGT

AATACCTCAGCCATAACACAAGCATGTCCAAAGGTCAGTTTTGATCC

AATTCCTATACACTATTGTGCTCCAGCTGGTTATGCGATTCTAAAGTG

TAACAATAAGACATTCAATGGGACAGGACCATGCAATAATGTCAGC

ACAGTACAATGTACACATGGAATTAAGCCAGTGGTATCAACTCAGCT

ATTGTTAAACGGTAGCCTAGCAGAAGGAGAGATAATAATTAGATCTG

AAAATCTGACAGACAATGTCAAAACAATAATAGTACATCTTGATCAA

TCTGTAGAAATTGTGTGTACAAGACCCAACAATAATACAAGAAAAA

GTATAAGGATAGGGCCAGGACAAACATTCTATGCAACAGGAGGCAT

AATAGGGAACATACGACAAGCACATTGTAACATTAGTGAAGACAAA

TGGAATGAAACTTTACAAAGGGTGGGTAAAAAATTAGTAGAACACT

TCCCTAATAAGACAATAAAATTTGCACCATCCTCAGGAGGGGACCTA

GAAATTACAACACATAGCTTTAATTGTAGAGGAGAATTTTTCTATTGC

AGCACATCAAGACTGTTTAATAGTACATACATGCCTAATGATACAAA

AAGTAAGTCAAACAAAACCATCACAATCCCATGCAGCATAAAACAA

ATTGTAAACATGTGGCAGGAGGTAGGACGAGCAATGTATGCCCCTC

CCATTGAAGGAAACATAACCTGTAGATCAAATATCACAGGAATACTA

TTGGTACGTGATGGAGGAGTAGATTCAGAAGATCCAGAAAATAATA

AGACAGAGACATTCCGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGAACAATT

GGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGCGGCAGAAATTAAGCCATTG

GGAGTAGCACCCACTCCAGCAAAAAGGAGAGTGGTGGAGAGAGA

AAAAAGAGCAGTAGGATTAGGAGCTGTGTTCCTTGGATTCTTGGGA

GCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATAACGCTGACGGTAC

AGGCCAGACAATTGTTGTCTGGTATAGTGCAACAGCAAAGCAATTT

GCTGAGGGCTATCGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACGGTC

TGGGGCATTAAGCAGCTCCAGACAAGAGTCCTGGCTATCGAAAGAT

ACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGGGCTTTGGGGCTGCTCTGGAAA

ACTCATCTGCACCACTAATGTACCTTGGAACTCCAGTTGGAGTAACA

AATCTCAAACAGATATTTGGGAAAACATGACCTGGATGCAGTGGGA

TAAAGAAGTTAGTAATTACACAGACACAATATACAGGTTGCTTGAAG

ACTCGCAAACCCAGCAGGAAAGAAATGAAAAGGATTTATTAGCATT

GGACAATTGGAAAAATCTGTGGAATTGGTTTAGTATAACAAACTGG

CTGTGGTATATAAAAATATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGATAGGC

TTAAGAATAATTTTTGCTGTGCTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAG

GGATACTCACCTTTGTCGTTTCAGACCCTTACCCCAAACCCAAGGG

GACCCGACAGGCTCGGAAGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGGGCAA

GACAGAGACAGATCGATTCGATTAGTGAACGGATTCTTAGCACTTG

CCTGGGACGACCTGTGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGATT

GAGAGACTTAATATTGGTGACAGCGAGAGCGGTGGAACTTCTGGGA

CACAGCAGTCTCAGGGGACTACAGAGGGGGTGGGAAGCCCTTAAG

TATCTGGGAGGTATTGTGCAGTATTGGGGTCTGGAACTAAAAAAGA

GGGCTATTAGTCTGCTTGATACTGTAGCAATAGCAGTAGCTGAAGGC

ACAGATAGGATTATAgaattcctccaaagaatttgtagagctatccgcaacatacctagaaggataa

gacagggctttgaagcagctttgcagtaa

Env HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:14）（由GEO-D06编码的序列）

MRVKGILRN YRQWWIWGILGFWMLMICNGNLWVTVYYGVPVWKEA

KTTLFCASNAKAYEKEVHNVWATHACVPTDPNPQEMVLENVTENFN

MWKNDMVNQMHEDVISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLECRKVNATHNA

TNNGDATHNVTNNGQEIQNCSFNATTEIRDRKQRVYALFYRLDIVPLD

KNNSSKNNSSEYYRLINCNTSAITQACPKVSFDPIPIHYCAPAGYAILKC

NNKTFNGTGPCNNVSTVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEGEIIIRSENL

TDNVKTIIVHLDQSVEIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQTFYATGGIIGNIRQA

HCNISEDKWNETLQRVGKKLVEHFPNKTIKFAPSSGGDLEITTHSFNCR

GEFFYCSTSRLFNSTYMPNDTKSKSNKTITIPCSIKQIVNMWQEVGRA

MYAPPIEGNITCRSNITGILLVRDGGVDSEDPENNKTETFRPGGGDMRN

NWRSELYK YKAAEIKPLGVAPTPAKRRVVEREKRAVGLGAVFLGFLGA

AGSTMGAASITLTVQARQLLSGIVQQQSNLLRAIEAQQHLLQLTVWGI

KQLQTRVLAIERYLKDQQLLGLWGCSGKLICTTNVPWNSSWSNKSQT

DIWENMTWMQWDKEVSNYTDTIYRLLEDSQTQQERNEKDLLALDN

WKNLWNWFSITNWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIIFAVLSIVNRVRQGYSPL

SFQTLTPNPRGPDRLGRIEEEGGGQDRDRSIRLVNGFLALAWDDLWSL

CLFSYHRLRDLILVTARAVELLGHSSLRGLQRGWEALKYLGGIVQYW

GLELKKRAISLLDTVAIAVAEGTDRIIEFLQRICRAIRNIPRRIRQGFEAA

LQ

gagHIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:15）（存在于GEO-03中的序列）

ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGAT

GGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATT

AAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTT

AATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGG

GACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATC

ATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGA

GATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCA

AAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAG

GACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACAT

CCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATG

CATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGAT

ACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAA

ACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT

GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTG

CATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAAC

CAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACA

AATAGGATGGATGACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATTT

ATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATA

GCCCTACCAGCATTCTGGACATAGACAAGGACCAAAAGAACCCTT

TAGAGACTATGTAGACCGGTTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAA

GCTTCACAGGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCC

AAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGACC

AGCGGCTACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTAGGA

GGACCCGGCCATAAGGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAA

GTAACAAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTAGGAA

CCAAAGAAAGATTGTTAAGAGCTTCAATAGCGGCAAAGAAGGGCA

CACAGCCAGAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCAGCTGGAA

AAGCGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACA

GGCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCA

GGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAA

GAGAGCTTCAGGTCTGGGGTAGAGACAACAACTCCCCCTCAGAAG

CAGGAGCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATC

ACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAATAA

Gag HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:16）（由GEO-D03编码的序列）

MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVN

PGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDT

KEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMV

HQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV

GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIA

GTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQ

GPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTIL

KALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNSATIMMQR

GNFRNQRKIVKSFNSGKEGHTARNCRAPRKKGSWKSGKEGHQMKDC

TERQANFLGKIWPSYKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRSGVETTTPPQK

QEPIDKELYPLTSLRSLFGNDPSSQ

gagHIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:17）（存在于GEO-D06中的序列）

ATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGAGGGGGAAAATTAGATAAAT

GGGAAAAGATTAGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAACACTATATGCT

AAAACACCTAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTGGAAAGATTTGCACTT

AACCCTGGCCTTTTAGAGACATCAGAAGGCTGTAAACAAATAATAA

AACAGCTACAACCAGCTCTTCAGACAGGAACAGAGGAACTTAGGT

CATTATTCAATGCAGTAGCAACTCTCTATTGTGTACATGCAGACATAG

AGGTACGAGACACCAAAGAAGCATTAGACAAGATAGAGGAAGAAC

AAAACAAAAGTCAGCAAAAAACGCAGCAGGCAAAAGAGGCTGAC

AAAAAGGTCGTCAGTCAAAATTATCCTATAGTGCAGAATCTTCAAGG

GCAAATGGTACACCAGGCACTATCACCTAGAACTTTGAATGCATGG

GTAAAAGTAATAGAAGAAAAAGCCTTTAGCCCGGAGGTAATACCCA

TGTTCACAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACAC

CATGTTAAATACCGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTA

AAAGATACCATCAATGAGGAGGCTGCAGAATGGGATAGATTACATCC

AGTACATGCAGGGCCTGTTGCACCAGGCCAAATGAGAGAACCAAG

GGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTAACCTTCAGGAACAAATA

GCATGGATGACAAGTAACCCACCTATTCCAGTGGGAGATATCTATAA

AAGATGGATAATTCTGGGGTTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCC

CTGTCAGCATTTTAGACATAAGACAAGGGCCAAAGGAACCCTTTAG

AGATTATGTAGACCGGTTCTTTAAAACTTTAAGAGCTGAACAAGCTT

CACAAGATGTAAAAAATTGGATGGCAGACACCTTGTTGGTCCAAAA

TGCGAACCCAGATTGTAAGACCATTTTAAGAGCATTAGGACCAGGA

GCTACATTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAAGGAGTGGGAGGAC

CTAGCCACAAAGCAAGAGTGTTGGCTGAGGCAATGAGCCAAACAG

GCAGTACCATAATGATGCAGAGAAGCAATTTTAAAGGCTCTAAAAG

AACTGTTAAATCCTTCAACTCTGGCAAGGAAGGGCACATAGCTAGA

AATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTCTTGGAAATCTGGAAAG

GAAGGACACCAAATGAAAGACTGTGCTGAGAGGCAGGCTAATTTTT

TAGGGAAAATTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTCCT

TCAGAACAGGCCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAG

GTTCGAGGAGACAACCCCTGCTCCGAAGCAGGAGCTGAAAGACAG

GGAACCCTTAACCTCCCTCAAATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGT

CTCAATAA

Gag HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:18）（由GEO-D06编码的序列）

MGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKHYMLKHLVWASRELERFAL

NPGLLETSEGCKQIIKQLQPALQTGTEELRSLFNAVATLYCVHADIEVR

DTKEALDKIEEEQNKSQQKTQQAKEADKKVVSQNYPIVQNLQGQMV

HQALSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTV

GGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIA

GTTSNLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQ

GPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQASQDVKNWMADTLLVQNANPDCKTIL

RALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTGSTIMMQRSN

FKGSKRTVKSFNSGKEGHIARNCRAPRKKGSWKSGKEGHQMKDCAE

RQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQNRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQELK

DREPLTSLKSLFGSDPLSQ

polHIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:19）（存在于GEO-D03中的序列）

TTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAGGGAAT

TTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAGAGAGC

TTCAGGTCTGGGGTAGAGACAACAACTCCCCCTCAGAAGCAGGAG

CCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTT

TGGCAACGACCCCTCGTCACAATAAAGATAGGGGGGCAACTAAAGG

AAGCTCTATTAGCCACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATG

AGTTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGA

GGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTG

TGGACATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCA

ACATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTAAAT

TTTCCCATTAGCCCTATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAGCCAGG

AATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAA

GATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAGATGGAAAAGGAAGGG

AAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATT

TGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGAT

TTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAAT

TAGGAATACCACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAAC

AGTACTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATGAAG

ACTTCAGGAAATATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGA

CACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAA

AGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAG

CCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGAA

CGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAA

AAATAGAGGAGCTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGACTTACCAC

ACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGT

TATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAGCCTATAGTGCTGCC

AGAAAAAGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAGTTAGTGGG

GAAATTGAATACCGCAAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGG

CAATTATGTAAACTCCTTAGAGGAACCAAAGCACTAACAGAAGTAA

TACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGAG

AGATTCTAAAAGAACCAGTACATGGAGTGTATTATGACCCATCAAAA

GACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGCCAATGGACAT

ATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAATAT

GCAAGAATGAGGGGTGCCCACACTAATGATGTAAAACAATTAACAG

AGGCAGTGCAAAAAATAACCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAA

GACTCCTAAATTTAAACTGCCCATACAAAAGGAAACATGGGAAACA

TGGTGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGT

TTGTTAATACCCCTCCTTTAGTGAAATTATGGTACCAGTTAGAGAAA

GAACCCATAGTAGGAGCAGAAACCTTCTATGTAGATGGGGCAGCTA

ACAGGGAGACTAAATTAGGAAAAGCAGGATATGTTACTAATAGAGG

AAGACAAAAAGTTGTCACCCTAACTAACACAACAAATCAGAAAAC

TCAGTTACAAGCAATTTATCTAGCTTTGCAGGATTCGGGATTAGAAG

TAAACATAGTAACAGACTCACAATATGCATTAGGAATCATTCAAGCA

CAACCAGATCAAAGTGAATCAGAGTTAGTCAATCAAATAATAGAGC

AGTTAATAAAAAAGGAAAAGGTCTATCTGGCATGGGTACCAGCACA

CAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTGCT

GGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGA

TGAACATTAG

Pol HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:20）（由GEO-D03编码的序列）

FFREDLAFLQGKAREFSSEQTRANSPTRRELQVWGRDNNSPSEAGAD

RQGTVSFNFPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLATGADDTVLEEMSLPG

RWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLL

TQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTE

MEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFW

EVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINN

ETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMND

LYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYEL

HPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNTASQIYPGIKVRQLCKL

LRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQ

GQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTES

IVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLW

YQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQKVVTLTNTT

NQKTQLQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSESELVNQIIE

QLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVLFLDGIDKAQD

EH

polHIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:21）（存在于GEO-D06中的序列）

TTTTTTAGGGAAAATTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAAT

TTCCTTCAGAACAGGCCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGC

TTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCTGCTCCGAAGCAGGAGCTGAAA

GACAGGGAACCCTTAACCTCCCTCAAATCACTCTTTGGCAGCGACC

CCTTGTCTCAATAAAAATAGGGGGCCAGATAAGGAGGCTCTCTTA

GCCACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAG

GAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGAGGAATTGGAGGTTTTATCAA

AGTAAGACAGTATGATCAAATACTTATAGAAATTTGTGGAAAAA AGG

CTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCCACACCTGTCAACATAATTGGA

AGAAATATGCTGACTCAGATTGGATGCACGCTAAATTTTCCAATTAG

TCCCATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGC

CCAAAGGTTAAACAATGGCCATTGACAGAGGAGAAAATAAAAGCAT

TAACAGCAATTTGTGATGAAATGGAGAAGGAAGGAAAAATTACAAA

AATTGGGCCTGAAAATCCATATAACACTCCAATATTCGCCATAAAAA

AGAAGGACAGTACTAAGTGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACT

TAATAAAAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCA

CACCCAGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTGACAGTACTAGAT

GTGGGGGATGCATATTTTTCAGTTCCTTTAGATGAAAGCTTTAGGAG

GTATACTGCATTCACCATACCTAGTAGAAACAATGAAACACCAGGGA

TTAGATATCAATATAATGTGCTTCCACAAGGATGGAAAGGATCACCA

GCAATATTCCAGAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCCTTTAGAGC

ACAAAATCCAGAAATAGTCATCTATCAATATATGAATGACTTGTATGT

AGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAACATAGAGCAAAGATAGAGGAA

TTAAGAGAACATCTATTAAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAGA

AACATCAGAAAGAACCCCCATTTCTTTGGATGGGGTATGAACTCCAT

CCTGACAAATGGACAGTACAGCCTATACAGCTGCCAGAAAAGGAGA

GCTGGACTGTCAATGATATACAGAAGTTAGTGGGAAAATTAAACAC

GGCAAGCCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGACAACTTTGTAGA

CTCCTTAGAGGGGCCAAAGCACTAACAGACATAGTACCACTAACTG

AAGAAGCAGAATTAGAATTGGCAGAGAACAGGGAAATTCTAAAAG

AACCAGTACATGGAGTATATTATGACCCTTCAAAAGACTTGATAGCT

GAAATACAGAAACAGGGACATGACCAATGGACATATCAAATTTACC

AAGAACCATTCAAAAATCTGAAAACAGGGAAGTATGCAAAAATGA

GGACTGCCCACACTAATGATGTAAAACGGTTAACAGAGGCAGTGCA

AAAAATAGCCTTAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGATTCCTAAAC

TTAGGTTACCCATCCAAAAAGAAACATGGGAGACATGGTGGACTGA

CTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAATTTGTTAATACTC

CTCCCCTAGTAAATTATGGTACCAGCTAGAGAAGGAACCCATAATA

GGAGTAGAAACTTTCTATGTAGATGGAGCAGCTAATAGGGAAACCA

AAATAGGAAAAGCAGGGTATGTTACTGACAGAGGAAGGCAGAAAA

TTGTTTCTCTAACTGAAACAACAAATCAGAAGACTCAATTACAAGC

AATTTATCTAGCTTTGCAAGATTCAGGATCAGAAGTAAACATAGTAA

CAGACTCACAGTATGCATTAGGAATTATTCAAGCACAACCAGATAAG

AGTGAATCAGGGTTAGTCAACCAAATAATAGAACAATTAATAAAAA

AGGAAAGGGTCTACCTGTCATGGGTACCAGCACATAAAGGTATTGG

AGGAAATGAACAAGTAGACAAATTAGTAAGTAGTGGAATCAGGAG

AGTGCTATAATAA

Pol HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:22）（由GEO-D06编码的序列）

FFRENLAFPQGEAREFPSEQARANSPTSRELQVRGDNPCSEAGAERQG

TLNLPQITLWQRPLVSIKIGGQIKEALLATGADDTVLEEMNLPGKWKP

KMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGKKAIGTVLVGPTPVNIIGRNMLTQIG

CTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTAICDEMEKE

GKITKIGPENPYNTPIFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQL

GIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDESFRRYTAFTIPSRNNETPGI

RYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRAQNPEIVIYQYMNDLYVG

SDLEIGQHRAKIEELREHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDK

WTVQPIQLPEKESWTVNDIQKLVGKLNTASQIYPGIKVRQLCRLLRGA

KALTDIVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGHD

QWTYQIYQEPFKNLKTGKYAKMRTAHTNDVKRLTEAVQKIALESIVIW

GKIPKLRLPIQKETWETWWTDYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLE

KEPIIGVETFYVDGAANRETKIGKAGYVTDRGRQKIVSLTETTNQKTQ

LQAIYLALQDSGSEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESGLVNQIIEQLIKK

ERVYLSWVPAHKGIGGNEQVDKLVSSGIRRVL

rev HIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:23）（存在于GEO-D03中的序列）

ATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCCTCAAGACA

GTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAGCCC

CGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATCGAAGAAGAAGGTGGA

GACAGAGACAGAGACAGATCCGTGCGATTAGTGGATggatccttagcacttat

ctgggacgatctgcggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtaacgaggatt

gtggaacttctgggacgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctcctacagtattggagtcagga

gctaaagaatag

Rev HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:24）（由GEO-D03编码的序列）

MAGRSGDSDEELLKTVRLIKFLYQSNPPPSPEGTRQARRNRRRRWRQR

QRQIRAISGWILSTYLGRSAEPVPLQLPPLERLTLDCNEDCGTSGTQGV

GSPQILVESPTVLESGAKE

rev HIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:25）（存在于GEO-D06中的序列）

ATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGCGCTCCTCAGAGCA

GTGAGGATCATCAGAATTTTGTATCAAAGCAACCCTTACCCCAAACC

CAAGGGGACCCGACAGGCTCGGAAGAATCGAAGAAGAAGGTGGA

GGGCAAGACAGAGACAGATCGATTCGATTAGTGAACGGATTCTTAG

CACTTGCCTGGGACGACCTGTGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCA

CCGATTGAGAGACTTAATATTGGTGACAGCGAGAGCGGTGGAACTT

CTGGGACACAGCAGTCTCAGGGGACTACAGAGGGGGTGGGAAGCC

CTTAA

Rev HIV分化体C蛋白质序列(SEQ ID NO:26)（由GEO-D06编码的序列）

MAGRSGDSDEALLRAVRIIRILYQSNPYPKPKGTRQARKNRRRRWRAR

QRQIDSISERILSTCLGRPVEPVPLQLPPIERLNIGDSESGGTSGTQQSQG

TTEGVGSP

tatHIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:27）（存在于GEO-D03中的序列）

ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAA

GTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGC

TTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTAT

GGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCCTCAAGACAG

TCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAGCCCC

GAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATCGAAGAAGAAGGTGGAG

ACAGAGACAGAGACAGATCCGTGCGATTAG

Tat HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:28）（由GEO-D03编码的序列）

MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYG

RKKRRQRRRAPQDSQTHQVSLSKQPTSQPRGDPTGPKESKKKVETET

ETDPCD

tatHIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:29）（存在于GEO-D06中的序列）

ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTAGAGCCCTGGAACCATCCAGGAA

GTCAGCCTGAAACTGCTTGCAATAACTGTTATTGTAAACGCTATAGC

TACCATTGTCTAGTTTGCTTTCAGAGAAAAGGCTTAGGCATTTCCTA

TGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGCGCTCCTCAGAGCA

GTGAGGATCATCAGAATTTTGTATCAAAGCAACCCTTACCCCAAACC

CAAGGGGACCCGACAGGCTCGGAAGAATCGAAGAAGAAGGTGGA

GGGCAAGACAGAGACAGATCGATTCGATTAG

Tat HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:30）（由GEO-D06编码的序列）

MEPVDPNLEPWNHPGSQPETACNNCYCKRYSYHCLVCFQRKGLGISY

GRKKRRQRRSAPQSSEDHQNFVSKQPLPQTQGDPTGSEESKKKVEGK

TETDRFD

vpu HIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:31）（存在于GEO-D03中的序列）

ATGCAACCTTTACAAATATTAGCAATAGTAGCATTAGTAGTAGCAGC

AATAATAGCAATAGTTGTGTGGACCATAGTATTCATAGAATATAGGAA

AATATTAAGACAAAGAAAAATAGACAGGTTAATTGATAGGATAACA

GAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAAAGTGAAGGGGATCAGGA

AGAATTATCAGCACTTGTGGAAATGGGGCATCATGCTCCTTGGGATG

TTGATGATCTGTAG

Vpu HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:32）（由GEO-D03编码的序列）

MQPLQILAIVALVVAAIIAIVVWTIVFIEYRKILRQRKIDRLIDRITERAE

DSGNESEGDQEELSALVEMGHHAPWDVDDL

vpu HIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:33）（存在于GEO-D06中的序列）

ATGTTAGATTTAGATTATAAATTAGCAGTAGGAGCATTTATAGTAGCA

CTACTCATAGCAATAGTTGTGTGGACCATAGTATTTATAGAATATAGG

AAATTGTTAAGACAAAGAAAAATAGACTGGTTAATTAAAAGAATTA

GGGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGAAGGGGATACTG

AGGAATTATCGACAATGGTGGATATGGGGCATCTTAGGCTTTTGGAT

GTTAATGATTTGTAA

Vpu HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:34）（由GEO-D06编码的序列）

MLDLDYKLAVGAFIVALLIAIVVWTIVFIEYRKLLRQRKIDWLIKRIRER

AEDSGNESEGDTEELSTMVDMGHLRLLDVNDL

env HIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:35）（存在于MVA62B中的序列）

ATGAAAGTGAAGGGGATCAGGAAGAATTATCAGCACTTGTGGAAAT

GGGGCATCATGCTCCTTGGGATGTTGATGATCTGTAGTGCTGTAGAA

AATTTGTGGGTCACAGTTTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAAGAAGC

AACCACCACTCTATTTTGTGCATCAGATGCTAAGCATATGATACAG

AGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCC

AACCCACAAGAAGTAGTATTGGAAAATGTGACAGAAAATTTTAACA

TGTGGAAAAATAACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGT

TTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTG

TGTTACTTTAAATTGCACTGATTTGAGGAATGTTACTAATATCAATAA

TAGTAGTGAGGGAATGAGAGGAGAAATAAAAAACTGCTCTTTCAAT

ATCACCACAAGCATAAGAGATAAGGTGAAGAAAGACTATGCACTTT

TCTATAGACTTGATGTAGTACCAATAGATAATGATAATACTAGCTATA

GGTTGATAAATTGTAATACCTCAACCATTACACAGGCCTGTCCAAAG

GTATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTACCCCGGCTGGTTTT

GCGATTCTAAAGTGTAAAGACAAGAAGTTCAATGGAACAGGGCCAT

GTAAAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCAGT

AGTGTCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAG

GTAGTA ATTAGATCTAGTAATTTCACAGACAATGCAA AAAACATAAT

AGTACAGTTGAAAGAATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAAC

AACAATACAAGGAAAAGTATACATATAGGACCAGGAAGAGCATTTTA

TACAACAGGAGAAATAATAGGAGATATAAGACAAGCACATTGCAAC

ATTAGTAGAACAAAATGGAATAACACTTTAAATCAAATAGCTACAAA

ATTAAAAGAACAATTTGGGAATAATAAAACAATAGTCTTTAATCAAT

CCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAATGCACAGTTTTAATTGTGG

AGGGGAATTCTTCTACTGTAATTCAACACAACTGTTTAATAGTACTT

GGAATTTTAATGGTACTTGGAATTTAACACAATCGAATGGTACTGAA

GGAAATGACACTATCACACTCCCATGTAGAATAAAACAAATTATAAA

TATGTGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGA

GGACAAATTAGATGCTCATCAAATATTACAGGGCTAATATTAACAAG

AGATGGTGGAACTAACAGTAGTGGGTCCGAGATCTTCAGACCTGGG

GGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAA

AGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAA

AGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAACGATAGG

AGCTATGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGC

GCAGCGTCAATAACGCTGACGGTACAGGCCAGACTATTATTGTCTGG

TATAGTGCAACAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAA

CAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGG

CAAGAGTCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAGGGATCAACAGCTCCT

AGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATCTGCACCACTGCTGTG

CCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAAACTCTGGATATGATTTGGGA

TAACATGACCTGGATGGAGTGGGAAAGAGAAATCGAAAATTACACA

GGCTTAATATACACCTTAATTGAGGAATCGCAGAACCAACAAGAAA

AGAATGAACAAGACTTATTAGCATTAGATAAGTGGGCAAGTTTGTG

GAATTGGTTTGACATATCAAATTGGCTGTGGTATGTAAAAATCTTCAT

AATGATAGTAGGAGGCTTGATAGGTTTAAGAATAGTTTTTACTGTACT

TTCTATAGTAAATAGAGTTAGGCAGGGATACTCACCATTGTCATTTCA

GACCCACCTCCCAGCCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAAT

CGAAGAAGAAGGTGGAGACAGAGACTAA

Env HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:36）（由MVA62B编码的序列）

MKVKGIRKNYQHLWKWGIMLLGMLMICSAVENLWVTVYYGVPVWK

EATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLENVTENF

NMWKNNMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTDLRNVTNI

NNSSEGMRGEIKNCSFNITTSIRDKVKKDYALFYRLDVVPIDNDNTSYR

LINCNTSTITQACPKVSFEPIPIHYCTPAGFAILKCKDKKFNGTGPCKNV

STVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSSNFTDNAKNIIVQLKES

VEINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHCNISRTKWNNTL

NQIATKLKEQFGNNKTIVFNQSSGGDPEIVMHSFNCGGEFFYCNSTQLF

NSTWNFNGTWNLTQSNGTEGNDTITLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAP

PIRGQIRCSSNITGLILTRDGGTNSSGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKY

KVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGTIGAMFLGFLGAAGSTMGA

ASITLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARV

LAVERYLRDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKTLDMIWDNMT

WMEWEREIENYTGLIYTLIEESQNQQEKNEQDLLALDKWASLWNWF

DISNWLWYVKIFIMIVGGLIGLRIVFTVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPA

PRGPDRPEGIEEEGGDRD

env HIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:37）（存在于MVA71C中的序列）

ATGAGAGTGAAGGGGATACTGAGGAATTATCGACAATGGTGGATAT

GGGGCATCTTAGGCTTTTGGATGTTAATGATTTGTAATGGAAACTTG

TGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAAGAAGCAAAAA

CTACTCTATTCTGTGCATCAAATGCTAAAGCATATGAGAAAGAAGTA

CATAATGTCTGGGCTACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCC

ACAAGAAATGGTTTTGGAAAACGTAACAGAAAATTTTAACATGTGG

AAAAATGACATGGTGAATCAGATGCATGAGGATGTAATCAGCTTATG

GGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAGTTGACCCCACTCTGTGTC

ACTTTAGAATGTAGAAAGGTTAATGCTACCCATAATGCTACCAATAAT

GGGGATGCTACCCATAATGTTACCAATAATGGGCAAGAAATACAAAA

TTGCTCTTTCAATGCAACCACAGAAATAAGAGATAGGAAGCAGAGA

GTGTATGCACTTTTCTATAGACTTGATATAGTACCACTTGATAAGAAC

AACTCTAGTAAGAACAACTCTAGTGAGTATTATAGATTAATAAATTGT

AATACCTCAGCCATAACACAAGCATGTCCAAAGGTCAGTTTTGATCC

AATTCCTATACACTATTGTGCTCCAGCTGGTTATGCGATTCTAAAGTG

TAACAATAAGACATTCAATGGGACAGGACCATGCAATAATGTCAGC

ACAGTACAATGTACACATGGAATTAAGCCAGTGGTATCAACTCAGCT

ATTGTTAAACGGTAGCCTAGCAGAAGGAGAGATAATAATTAGATCTG

AAAATCTGACAGACAATGTCAAAACAATAATAGTACATCTTGATCAA

TCTGTAGAAATTGTGTGTACAAGACCCAACAATAATACAAGAAAAA

GTATAAGGATAGGGCCAGGACAAACATTCTATGCAACAGGAGGCAT

AATAGGGAACATACGACAAGCACATTGTAACATTAGTGAAGACAAA

TGGAATGAAACTTTACAAAGGGTGGGTAAAAAATTAGTAGAACACT

TCCCTAATTAAGACAATAAAATTTGCACCATCCTCAGGAGGGGACCTA

GAAATTACAACACATAGCTTTAATTGTAGAGGAGAATTCTTCTATTG

CAGCACATCAAGACTGTTTAATAGTACATACATGCCTAATGATACAA

AAAGTAAGTCAAACAAAACCATCACAATCCCATGCAGCATAAAACA

AATTGTAAACATGTGGCAGGAGGTAGGACGAGCAATGTATGCCCCT

CCCATTGAAGGAAACATAACCTGTAGATCAAATATCACAGGAATACT

ATTGGTACGTGATGGAGGAGTAGATTCAGAAGATCCAGAAAATAAT

AAGACAGAGACATTCCGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGAACAAT

TGGAGAAGTGAATTATTAAATATAAAGCGGCAGAAATTAAGCCATT

GGGAGTAGCACCCACTCCAGCAAAAAGGAGAGTGGTGGAGAGAG

AAAAAAGAGCAGTAGGATTAGGAGCTGTGTTCCTTGGATTCTTGGG

AGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATAACGCTGACGGTA

CAGGCCAGACAATTGTTGTCTGGTATAGTGCAACAGCAAAGCAATT

TGCTGAGGGCTATCGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACGGT

CTGGGGCATTAAGCAGCTCCAGACAAGAGTCCTGGCTATCGAAAGA

TACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGGGCTTTGGGGCTGCTCTGGAA

AACTCATCTGCACCACTAATGTACCTTGGAACTCCAGTTGGAGTAAC

AAATCTCAAACAGATATTTGGGAAAACATGACCTGGATGCAGTGGG

ATAAAGAAGTTAGTAATTACACAGACACAATATACAGGTTGCTTGAA

GACTCGCAAACCCAGCAGGAAAGAAATGAAAAGGATTTATTAGCAT

TGGACAATTGGAAAAATCTGTGGAATTGGTTTAGTATAACAAACTGG

CTGTGGTATAtAAAAATATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGATAGGC

TTAAGAATAATTTTTGCTGTGCTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAG

GGATACTCACCTTTGTCGTTTCAGACCCTTACCCCAAACCCAAGGG

GACCCGACAGGCTCGGAAGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGGGCAA

GACAGAGACTAA

Env HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:38）（由MVA71C编码的序列）

MRVKGILRNYRQWWIWGILGFWMLMICNGNLWVTVYYGVPVWKEA

KTTLFCASNAKAYEKEVHNVWATHACVPTDPNPQEMVLENVTENFN

MWKNDMVNQMHEDVISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLECRKVNATHNA

TNNGDATHNVTNNGQEIQNCSFNATTEIRDRKQRVYALFYRLDIVPLD

KNNSSKNNSSEYYRLINCNTSAITQACPKVSFDPIPIHYCAPAGYAILKC

NNKTFNGTGPCNNVSTVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEGEIIIRSENL

TDNVKTIIVHLDQSVEIVCTRPNNNTRKSIRIGPGQTFYATGGIIGNIRQA

HCNISEDKWNETLQRVGKKLVEHFPNKTIKFAPSSGGDLEITTHSFNCR

GEFFYCSTSRLFNSTYMPNDTKSKSNKTITIPCSIKQIVNMWQEVGRA

MYAPPIEGNITCRSNITGILLVRDGGVDSEDPENNKTETFRPGGGDMRN

NWRSELYKYKAAEIKPLGVAPTPAKRRVVEREKRAVGLGAVFLGFLGA

AGSTMGAASITLTVQARQLLSGIVQQQSNLLRAIEAQQHLLQLTVWGI

KQLQTRVLAIERYLKDQQLLGLWGCSGKLICTTNVPWNSSWSNKSQT

DIWENMTWMQWDKEVSNYTDTIYRLLEDSQTQQERNEKDLLALDN

WKNLWNWFSITNWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIIFAVLSIVNRVRQGYSPL

SFQTLTPNPRGPDRLGRIEEEGGGQDRD

gagHIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:39）（存在于MVA62B中的序列）

ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGAT

GGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATT

AAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTT

AATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGG

GACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATC

ATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGA

GATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCA

AAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAG

GACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACAT

CCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATG

CATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGAT

ACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAA

ACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT

GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTG

CATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAAC

CAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACA

AATAGGATGGATGACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATTT

ATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATA

GCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAAGAACCCTT

TAGAGACTATGTAGACCGGTTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAA

GCTTCACAGGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCC

AAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGACC

AGCGGCTACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTAGGA

GGACCCGGCCATAAGGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAA

GTAACAAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTAGGAA

CCAAAGAAAGATTGTTAAGTGTTTCAATTGTGGCAAAGAAGGGCAC

ACAGCCAGAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAA

TGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACAG

GCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAG

GGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAG

AGAGCTTCAGGTCTGGGGTAGAGACAACAACTCCCCCTCAGAAGC

AGGAGCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCA

CTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAATAA

Gag HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:40）（由MVA62B编码的序列）

MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVN

PGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDT

KEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMV

HQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV

GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIA

GTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQ

GPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTIL

KALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNSATIMMQR

GNFRNQRKIVKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKD

CTERQANFLGKIWPSYKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRSGVETTTPPQ

KQEPIDKELYPLTSLRSLFGNDPSSQ

gagHIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:41）（存在于MVA71C中的序列）

ATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGAGGGGGAAAATTAGATAAAT

GGGAAAAGATTAGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAACACTATATGCT

AAAACACCTAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTGGAAAGATTTGCACTT

AACCCTGGCCTTTTAGAGACATCAGAAGGCTGTAAACAAATAATAA

AACAGCTACAACCAGCTCTTCAGACAGGAACAGAGGAACTTAGGT

CATTATTCAATGCAGTAGCAACTCTCTATTGTGTACATGCAGACATAG

AGGTACGAGACACCAAAGAAGCATTAGACAAGATAGAGGAAGAAC

AAAACAAAAGTCAGCAAAAAACGCAGCAGGCAAAAGAGGCTGAC

AAAAAGGTCGTCAGTCAAAATTATCCTATAGTGCAGAATCTTCAAGG

GCAAATGGTACACCAGGCACTATCACCTAGAACTTTGAATGCATGG

GTAAAAGTAATAGAAGAAAAAGCCTTTAGCCCGGAGGTAATACCCA

TGTTCACAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACAC

CATGTTAAATACCGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTA

AAAGATACCATCAATGAGGAGGCTGCAGAATGGGATAGATTACATCC

AGTACATGCAGGGCCTGTTGCACCAGGCCAAATGAGAGAACCAAG

GGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTAACCTTCAGGAACAAATA

GCATGGATGACAAGTAACCCACCTATTCCAGTGGGAGATATCTATAA

AAGATGGATAATTCTGGGGTTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCC

CTGTCAGCATTTTAGACATAAGACAAGGGCCAAAGGAACCCTTTAG

AGATTAtGTAGACCGGTTCTTTAAAACTTTAAGAGCTGAACAAGCTT

CACAAGATGTAAAAAATTGGATGGCAGACACCTTGTTGGTCCAAAA

TGCGAACCCAGATTGTAAGACCATTTTAAGAGCATTAGGACCAGGA

GCTACATTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAAGGAGTGGGAGGAC

CTAGCCACAAAGCAAGAGTGTTGGCTGAGGCAATGAGCCAAACAG

GCAGTACCATAATGATGCAGAGAAGCAATTTTAAAGGCTCTAAAAG

AACTGTTAAATGCTTCAACTGTGGCAAGGAAGGGCACATAGCTAGA

AATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAG

GAAGGACACCAAATGAAAGACTGTGCTGAGAGGCAGGCTAATTTTT

TAGGGAAAATTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTCCT

TCAGAACAGGCCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAG

GTTCGAGGAGACAACCCCTGCTCCGAAGCAGGAGCTGAAAGACAG

GGAACCCTTAACCTCCCTCAAATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGT

CTCAATAA

Gag HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:42）（由MVA71C编码的序列）

MGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKHYMLKHLVWASRELERFAL

NPGLLETSEGCKQIIKQLQPALQTGTEELRSLFNAVATLYCVHADIEVR

DTKEALDKIEEEQNKSQQKTQQAKEADKKVVSQNYPIVQNLQGQMV

HQALSPRTLNAWVKVIEEKAF SPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTV

GGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIA

GTTSNLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQ

GPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQASQDVKNWMADTLLVQNANPDCKTIL

RALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTGSTIMMQRSN

FKGSKRTVKCFNCGKEGHIARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCAE

RQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQNRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQELK

DREPLTSLKSLFGSDPLSQ

pol HIV分化体B DNA序列（SEQ ID NO:43）（存在于MVA62B中的序列）

TTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAGGGAAT

TTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAGAGAGC

TTCAGGTCTGGGGTAGAGACAACAACTCCCCCTCAGAAGCAGGAG

CCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTT

TGGCAACGACCCCTCGTCACAATAAAGATAGGGGGGCAACTAAAGG

AAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATG

AGTTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGA

GGTTTTATCAAAGTA AGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTG

TGGACATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCA

ACATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTAAAT

TTTCCCATTAGCCCTATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAGCCAGG

AATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAA

AATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGG

AAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAGAATCCATACAATACTCCAGTATT

TGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGGAAATTAGTAGAT

TTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAAT

TAGGAATACCACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAAC

AGTACTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATGAAG

ACTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAG

ACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGA

AAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGA

GCCTTTTAAAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGA

ACGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACA

AAAATAGAGGAGCTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGACTTACCA

CACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGG

TTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAGCCTATAGTGCTGC

CAGAAAAAGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAGTTAGTGG

GGAAATTGAATACCGCAAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAG

GCAATTATGTAAACTCCTTAGAGGAACCAAAGCACTAACAGAAGTA

ATACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGA

GAGATTCTAAAAGAACCAGTACATGGAGTGTATTATGACCCATCAAA

AGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGCCAATGGAC

ATATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAAT

ATGCAAGAATGAGGGGTGCCCACACTAATGATGTAAAACAATTAAC

AGAGGCAGTGCAAAAAATAACCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGA

AAGACTCCTAAATTTAAACTACCCATACAAAAGGAAACATGGGAAA

CATGGTGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGA

GTTTGTTAATACCCCTCCTTTAGTGAAATTATGGTACCAGTTAGAGA

AAGAACCCATAGTAGGAGCAGAAACCTTCTATGTAGATGGGGCAGC

TAACAGGGAGACTAAATTAGGAAAAGCAGGATATGTTACTAACAAA

GGAAGACAAAAGGTTGTCCCCCTAACTAACACAACAAATCAGAAA

ACTCAGTTACAAGCAATTTATCTAGCTTTGCAGGATTCAGGATTAGA

AGTAAACATAGTAACAGACTCACAATATGCATTAGGAATCATTCAAG

CACAACCAGATAAAAGTGAATCAGAGTTAGTCAATCAAATAATAGA

GCAGTTAATAAAAAAGGAAAAGGTCTATCTGGCATGGGTACCAGCA

CACAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTG

CTGGAATCAGGAAAATACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAA

GATGAACATTAG

Pol HIV分化体B蛋白质序列（SEQ ID NO:44）（由MVA62B编码的序列）

FFREDLAFLQGKAREFSSEQTRANSPTRRELQVWGRDNNSPSEAGAD

RQGTVSFNFPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPG

RWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLL

TQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTE

MEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFW

EVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINN

ETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFKKQNPDIVIYQYMND

LYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYEL

HPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNTASQIYPGIKVRQLCKL

LRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQ

GQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTES

IVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLW

YQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNKGRQKVVPLTNTT

NQKTQLQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIE

QLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKILFLDGIDKAQDE

H

pol HIV分化体C DNA序列（SEQ ID NO:45）（存在于MVA71C中的序列）

TTTTTTAGGGAAAATTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAAT

TTCCTTCAGAACAGGCCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGC

TTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCTGCTCCGAAGCAGGAGCTGAAA

GACAGGGAACCCTTAACCTCCCTCAAATCACTCTTTGGCAGCGACC

CCTTGTCTCAATAAAAATAGGGGGCCAGATAAAGGAGGCTCTCTTA

GACACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAG

GAAAATGGAAACCAAA AATGATAGGAGGAATTGGAGGTTTTATCAA

AGTAAGACAGTATGATCAAATACTTATAGAAATTTGTGGAAAAA AGG

CTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCCACACCTGTCAACATAATTGGA

AGAAATATGCTGACTCAGATTGGATGCACGCTAAATTTTCCAATTAG

TCCCATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGC

CCAAAGGTTAAACAATGGCCATTGACAGAGGAGAAAATAAAAGCAT

TAACAGCAATTTGTGATGAAATGGAGAAGGAAGGAAAAATTACAAA

AATTGGGCCTGAAAATCCATATACACTCCAATATTCGCCATAAAAA

AGAAGGACAGTACTAAGTGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACT

TAATAAAAGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCA

CACCCAGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTGACAGTACTAGAT

GTGGGGGATGCATATTTTTCAGTTCCTTTAGATGAAAGCTTTAGGAG

GTATACTGCATTCACCATACCTAGTAGAAACAATGAAACACCAGGGA

TTAGATATCAATATAATGTGCTTCCACAAGGATGGAAAGGATCACCA

GCAATATTCCAGAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCCTTTAGAGC

ACAAAATCCAGAAATAGTCATCTATCAATATATGAATGACTTGTATGT

AGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAACATAGAGCAAAGATAGAGGAA

TTAAGAGAACATCTATTAAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAGA

AACATCAGAAAGAACCCCCATTTCTTTGGATGGGGTATGAACTCCAT

CCTGACAAATGGACAGTACAGCCTATACAGCTGCCAGAA AAGGAGA

GCTGGACTGTCAATGATATACAGAAGTTAGTGGGAAAATTAAACAC

GGCAAGCCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGACAACTTTGTAGA

CTCCTTAGAGGGGCCAAAGCACTAACAGACATAGTACCACTAACTG

AAGAAGCAGAATTAGAATTGGCAGAGAACAGGGAAATTCTAAAAG

AACCAGTACATGGAGTATATTATGACCCTTCAAAAGACTTGATAGCT

GAAATACAGAAACAGGGACATGACCAATGGACATATCAAATTTACC

AAGAACCATTCAAAAATCTGAAAACAGGGAAGTATGCAAAAATGA

GGACTGCCCACACTAATGATGTAAAACGGTTAACAGAGGCAGTGCA

AAAAATAGCCTTAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGATTCCTAAAC

TTAGGTTACCCATCCAAAAAGAAACATGGGAGACATGGTGGACTGA

CTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAATTTGTTAATACTC

CTCCCCTAGTAAAATTATGGTACCAGCTAGAGAAGGAACCCATAATA

GGAGTAGAAACTTTCTATGTAGATGGAGCAGCTAATAGGGAAACCA

AAATAGGAAAAGCAGGGTATGTTACTGACAGAGGAAGGCAGAAAA

TTGTTTCTCTAACTGAAACAACAAATCAGAAGACTCAATTACAAGC

AATTTATCTAGCTTTGCAAGATTCAGGATCAGAAGTAAACATAGTAA

CAGACTCACAGTATGCATTAGGAATTATTCAAGCACAACCAGATAAG

AGTGAATCAGGGTTAGTCAACCAAATAATAGAACAATTAATAAAAA

AGGAAAGGGTCTACCTGTCATGGGTACCAGCACATAAAGGTATTGG

AGGAAATGAACAAGTAGACAAATTAGTAAGTAGTGGAATCAGGAG

AGTGCTATAG

Pol HIV分化体C蛋白质序列（SEQ ID NO:46）（由MVA71C编码的序列）

FFRENLAFPQGEAREFPSEQARANSPTSRELQVRGDNPCSEAGAERQG

TLNLPQITLWQRPLVSIKIGGQIKEALLDTGADDTVLEEMNLPGKWKP

KMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGKKAIGTVLVGPTPVNIIGRNMLTQIG

CTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTAICDEMEKE

GKITKIGPENPYNTPIFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQL

GIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDESFRRYTAFTIPSRNNETPGI

RYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRAQNPEIVIYQYMNDLYVG

SDLEIGQHRAKIEELREHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDK

WTVQPIQLPEKESWTVNDIQKLVGKLNTASQIYPGIKVRQLCRLLRGA

KALTDIVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGHD

QWTYQIYQEPFKNLKTGKYAKMRTAHTNDVKRLTEAVQKIALESIVIW

GKIPKLRLPIQKETWETWWTDYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLE

KEPIIGVETFYVDGAANRETKIGKAGYVTDRGRQKIVSLTETTNQKTQ

LQAIYLALQDSGSEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESGLVNQIIEQLIKK

ERVYLSWVPAHKGIGGNEQVDKLVSSGIRRVL

已经描述了本披露的许多实施方案。虽然如此，将理解的是，可以作出多种修改而不脱离本披露的精神和范围。因此，其他的实施方案在以下权利要求书的范围之内。

Claims (39)

1.一种载体，包含：

原核复制起点；和

包含疫苗插入片段的真核转录盒，该疫苗插入片段编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIV Env和GM-CSF。

2.如权利要求1所述的载体，其中所述真核转录盒包含与编码HIVGag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、HIVEnv和GM-CSF的核酸序列可操作地连接的真核启动子。

3.如权利要求2所述的载体，其中HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、和HIV Env来自一个或多个HIV分化体。

4.如权利要求3所述的载体，其中HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、和HIV Env来自相同的HIV分化体。

5.如权利要求3所述的载体，其中一个或多个HIV分化体选自下组，该组由以下各项组成：HIV分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L。

6.如权利要求2所述的载体，其中该真核转录盒在人细胞中的表达产生编码HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIVVpu、HIV Env和GM-CSF的前体mRNA。

7.如权利要求2所述的载体，其中该真核表达盒包含一个被定位用于翻译GM-CSF的内部核糖体进入位点。

8.如权利要求6所述的载体，其中该真核表达盒进一步包含以下一项或多项：前导序列、内含子序列和多聚腺苷化序列。

9.如权利要求8所述的载体，其中所述真核表达盒进一步包含以下一项或多项：组织纤维蛋白溶酶原激活剂前导序列、CMV内含子A序列和牛生长激素多聚腺苷化序列。

10.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Gag在锌指结构域中具有降低RNA包装活性的突变。

11.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Pol具有降低蛋白酶活性的突变。

12.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Pol具有降低聚合酶活性的突变。

13.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Pol具有降低链转移活性的突变。

14.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Pol具有降低RNA酶H活性的突变。

15.如权利要求1所述的载体，其中该载体包含编码原核选择标记的序列。

16.如权利要求15所述的载体，进一步包含与编码该原核选择标记的序列可操作地连接的原核转录终止子。

17.如权利要求1所述的载体，其中编码的GM-CSF是全长的人GM-CSF。

18.如权利要求17所述的载体17，其中编码GM-CSF的序列包含SEQID NO:7第6633-7067位核苷酸、SEQ ID NO:8第6648-7082位核苷酸或SEQ ID NO:9第7336-7770位核苷酸的序列。

19.如权利要求1所述的载体，其中编码的GM-CSF是能够刺激巨噬细胞分化和增殖或者活化抗原呈递细胞的截短的人GM-GSF或突变人GM-GSF。

20.如权利要求1所述的载体，其中该GM-CSF包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

21.如权利要求1所述的载体，其中该HIV Gag包含与SEQ ID NO:A至少95%一致的氨基酸序列，该缺乏整合酶结构域的HIV Pol包含与SEQID NO:B至少95%一致的氨基酸序列，该HIV Tat包含与SEQ ID NO:C至少95%一致的氨基酸序列，该HIV Rev包含与SEQ ID NO:D至少95%一致的氨基酸序列，该HIV Vpu包含与SEQ ID NO:E的氨基酸序列至少95%一致的氨基酸序列，并且HIV Env包含与SEQ ID NO:E的氨基酸序列至少95%一致的氨基酸序列。

22.如权利要求1所述的载体，包含GEO-D03的序列（SEQ ID NO:7）。

23.如权利要求1所述的载体，包含GEO-D06的序列（SEQ ID NO:8）。

24.如权利要求1所述的载体，包含GEO-D07的序列（SEQ ID NO:9）。

25.一种引出受试者体内的免疫应答的方法，包括向受试者施用一个或多个剂量的包含如权利要求1至24的任一项所述的载体的组合物。

26.如权利要求25所述的方法，其中将至少两个剂量的包含该载体的组合物施用至受试者。

27.如权利要求26所述的方法，其中将至少两个剂量的包含该载体的组合物相隔至少两个月施用。

28.如权利要求25所述的方法，进一步包括施用一个或多个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物的步骤。

29.如权利要求25所述的方法，其中由该MVA表达的HIV Gag、HIVPol和HIV Env来自与由该DNA载体编码的HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIV Vpu、和HIV Env相同的分化体。

30.如权利要求25所述的方法，其中在向受试者施用至少一个剂量的包含根据权利要求1至24的任一项所述的载体的组合物之后，向该受试者施用至少一个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物。

31.如权利要求25所述的方法，其中所述施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加、免疫原特异性抗体滴度增加、免疫原特异性IgA水平增加、或对HIV感染的抵抗力增加。

32.一种治疗被HIV感染的受试者的方法，包括向受试者施用一个或多个剂量的包含根据权利要求1至24的任一项所述的载体的组合物。

33.如权利要求32所述的方法，其中该载体包含GEO-D03的序列（SEQID NO:7）。

34.如权利要求32所述的方法，其中该载体包含GEO-D06的序列（SEQID NO:8）。

35.如权利要求32所述的方法，其中该载体包含GEO-D07的序列（SEQID NO:9）。

36.如权利要求32所述的方法，进一步包括施用一个或多个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物的步骤。

37.如权利要求32所述的方法，其中由该MVA表达的HIV Gag、HIVPol和HIV Env来自与由该DNA载体编码的HIV Gag、缺乏整合酶结构域的HIV Pol、HIV Tat、HIV Rev、HIVVpu、和HIV Env相同的分化体。

38.如权利要求32所述的方法，其中在向受试者施用至少一个剂量的包含根据权利要求1至24的任一项所述的载体的组合物之后，向该受试者施用至少一个剂量的包含表达HIV Gag、HIV Pol和HIV Env的重组MVA病毒的组合物。

39.如权利要求32所述的方法，其中所述施用导致免疫原特异性抗体的亲合力增加、免疫原特异性抗体滴度增加、免疫原特异性IgA水平增加、或对HIV感染的抵抗力增加。

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