CN102762196A - 冻干方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

提供用于冻干的方法，特别是用于冻干包含AT III的制剂的方法。还提供由此制备的组合物。还提供包含所述组合物和/或冻干产品的试剂盒。

Description

冻干方法、组合物和试剂盒

相关申请的交叉引用

本申请请求申请日为2009年11月24日、申请号为61/264,014的美国申请的权益，其以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于冻干组合物、特别是包含至少一种活性成分的水性医药制剂的方法，和由所述方法制备的组合物，特别涉及用于冻干抗凝血酶-III(AT III)的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

冻干法是将活性成分制备成固态程度更高形式的药物的常用方法。举例来说，已经表明例如AT III等活性成分在溶液中的稳定性相对较低，AT III是血浆中通常存在的α₂-糖蛋白并且是凝血酶的血浆抑制剂。因此，AT III已经被加工成冻干制剂。

已经提出了冻干法通过将制剂中的溶剂组分去除至不再支持化学反应或生物生长的程度来降低或抑制活性成分的降解。此外，认为去除溶剂降低了分子运动性，从而降低降解反应的潜在。另外，对于冻干产品中常用的结晶赋形剂(例如氨基酸和盐)，希望在冷冻过程中尽可能完全地结晶，以提供固体基质从而支持饼状结构。然而，冻干水性药用制剂的许多先前尝试都不能实现令人满意的结晶度。举例来说，典型冻干方案本身的各种冷冻和/或退火步骤已被证明无法促进结晶。此外，已经暗示某些结晶赋形剂(例如丙氨酸和氯化钠)的存在可抑制或降低其它赋形剂的结晶，从而限制结晶度。

虽然针对冻干水性药用制剂已经进行了一些尝试，但仍然需要有效的冻干方法和由其制备的组合物。

发明内容

在一方面，本发明提供一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法。所述方法包含：将组合物暴露于第一温度，持续第一时间段，所述第一时间段足以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物。

在另一方面，本发明提供一种冻干包含血浆衍生的AT III、NaCl和丙氨酸的液体组合物的方法。所述方法包含：

(a)将组合物暴露于约54℃或以下，使得组合物的温度为约48℃或以下并持续约5小时或以上，以便提供其中含有完全或几乎完全结晶的一种或多种组分的第一组合物；和

(b)干燥第一组合物以获得冻干饼状物。

在一些方面，本发明提供包含根据本文公开的方法制备的冻干饼状物的组合物。

在其它方面，本发明提供一种试剂盒，其包含一种或多种根据本文公开的方法制备的组合物和/或冻干饼状物。

附图说明

图1.NaCl溶液(0.15M)在冷冻和升温期间的DSC温谱图。

图2.丙氨酸溶液(0.1M)在冷冻(A)和升温(B)期间的DSC温谱图。

图3.重构AT III在冷冻(A)和升温(B)期间的DSC温谱图。

图4.DOE分析给出的最佳结晶条件。

图5.A.利用ETP-5807循环在冷冻和退火期间的热容量(Cp)变化。B.第一次冷冻期间的Cp变化。C.退火期间的Cp变化。D.第二次冷冻期间的Cp变化。

图6.利用ETP-5807循环的热流随温度的变化。熔融峰的熔化热被确定为5.5J/g。

图7.A.通过将冷冻保持时间延长到5小时，在冷冻和退火期间的Cp变化。B.第一次冷冻期间的Cp变化。C.从-52℃到-30℃的升温斜坡(warming ramp)期间的Cp变化。D.退火期间的Cp变化。E.第二次冷冻期间的Cp变化。

图8.通过将冷冻保持时间从2小时延长到5小时，热流随温度的变化。熔融峰的熔化热被确定为6.4J/g。

图9.在lyostar II FTS装置中执行的利用ETP-5807循环的AT III冻干曲线图。

图10.在FTS装置中利用ETP-5807循环的冷冻期间的产物温度数据。

图11.在-54℃下冷冻2小时时的AT III冻干曲线图。

图12.在-54℃下冷冻2小时时的产物温度数据。

图13.在FTS装置中在-54℃下冷冻6小时时的AT III冻干曲线图。

图14.在FTS装置中在-54℃下冷冻6小时时的产物温度数据。

图15.在FTS装置中在-50℃下冷冻6小时时的AT III冻干曲线图。

图16.在FTS装置中在-50℃下冷冻6小时时的产物温度数据。

图17.在Usifroid中在-60℃下冷冻6小时时的AT III冻干曲线图。

图18.ATIII在Usifroid中在-60℃下冷冻6小时时的产物温度数据。

图19.在-52℃下冷冻15小时时的AT III冻干曲线图。

图20.在-52℃下冷冻15小时时的产物温度数据。

图21.饼状物的扫描电子显微照片(200倍放大倍率)。比例尺等于100μm。A：松垮的饼状物。B：固体饼状物。

图22.NaCl的扫描电子显微照片。左侧放大倍率是200倍，右侧放大倍率是1500倍。比例尺等于100μm(A)和10μm(B)。

图23.丙氨酸的扫描电子显微照片。左侧放大倍率是50倍，右侧放大倍率是200倍。比例尺等于500μm(A)和100μm(B)。

图24.使用衍射仪对于NaCl、丙氨酸、ETP 5807(松垮的饼状物)和来自ETP 5807第二轮的材料(固体饼状物)获得的粉末X射线衍射(XRD)图。

具体实施方式

本发明出人意料地发现在干燥之前的单一低温冷冻步骤足以诱导在包含活性成分的制剂中的可结晶赋形剂发生结晶，因此本发明方法提供稳健的赋形剂结晶，同时还提供更有效、实用和/或稳健的冻干方案。本发明的方法允许结晶填充剂相比先前方法程度提高，同时保持制剂中存在的活性成分的稳定性和活性。

在一方面，本发明提供一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法。所述方法包括将组合物暴露于第一温度，持续第一时间段，所述第一时间段足以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物。

组合物可以是液体或半液体组合物。举例来说，组合物可以是包含所述至少一种活性成分和所述至少一种结晶赋形剂的水性药用溶液或悬浮液。

在一个实施方案中，组合物是液体制剂，优选水溶液。在另一个实施方案中，组合物适合于药用用途，例如包含药学上可接受的载体或稀释剂的药用组合物。

在一个实施方案中，组合物是包含所述至少一种活性成分、所述至少一种结晶赋形剂和药学上可接受的载体的药用组合物。“药学上可接受的载体”如在此所用包括在生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣等。载体的类型可基于期望施用途径来选择。在一些实施方案中，载体适合于通过(但不限于)静脉内、吸入、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、丸剂、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式施用。药学上可接受的载体包括(但不限于)无菌水性溶液或分散液，用于制备无菌注射溶液或分散液。

活性成分

在一些实施方案中，所述至少一种活性成分可以是任何活性成分，包括(但不限于)蛋白质、核酸和其组合。蛋白质可包括(但不限于)糖蛋白(例如ATIII)、凝血因子、生长因子、细胞因子、抗体和嵌合构建体。本文中的术语“蛋白质”旨在以广义使用，且是指单独或集合的天然的人类或其它哺乳动物蛋白质；和/或从单一或多个基因产物产生的多肽的同质或异质分布；和/或展现特定活性的蛋白质片段；和/或通过包括转基因技术的重组技术生产的所述蛋白质和/或其活性片段。

在一些实施方案中，所述至少一种活性成分是蛋白质。在一个实施方案中，所述蛋白质是AT III。在其它实施方案中，组合物仅包含一种活性成分，其中活性成分是AT III。在另一个实施方案中，AT III是组合物中唯一的活性成分，然而，组合物还包含其它蛋白质，包括非AT III蛋白质和/或AT III的非活性形式。举例来说，功能性AT III可以在组合物的总蛋白质含量中占一定百分比。

除非另外明确说明，否则术语“AT III”如本文所用为广义。举例来说，所述术语是指AT III的所有自然发生的多形体。所述术语还包括AT III的功能片段，包含AT III或其功能片段的嵌合蛋白质，通过对AT III的一个或多个氨基酸进行同功取代(analogous substitution)获得的同系物、和物种同系物。所述术语也指所有作为重组DNA技术产物的AT III多肽，包括作为转基因技术产物的AT III。举例来说，编码AT III的基因可插入编码乳清蛋白的哺乳动物基因中，使得DNA序列如专利号为5,322,775的美国专利中所述在乳腺中表达，该专利以引用其产生蛋白质化合物方法的教导的方式并入本文。所述术语还可以指通过所属领域中已知的方法(例如固相肽合成法)化学合成的所有AT III蛋白质。所述术语还指从血浆制备的AT III。所述术语还指可从商业获得的ATIII。AT III可对应于人或非人AT III。

在一个实施方案中，AT III是血浆衍生的AT III。在另一个实施方案中，ATIII是从血浆级分浆料(plasma fraction paste)制备。在其它实施方案中，AT III是从白蛋白被清除的血浆级分或预纯化的AT III制剂级分制备。以引用其从血清或血浆制备AT III方法的教导的方式，将授予Tenold的专利号为5,561,115的美国专利并入本文。

在其它实施方案中，AT III是重组AT III。包括重组AT III的重组蛋白质的生产描述于例如以下文献中：专利号为4,517,294、4,632,981、4,873,316、5,420,252、5,618,713、5,700,663、5,843,705、6,441,145、6,878,813、7,019,193的美国专利；Fan等人，JBC，268：17588(1993)；Garone等人，Biochemistry，35：8881(1996)；公开号为WO02/02793的国际公开；公开号为US2003/096974和US2006/0024793的美国公开；和Gillespie等人，JBC，266：3995(1991)，各自以引用其包括重组AT III的重组蛋白质生产的教导的方式并入本文。

在一个实施方案中，组合物的特征在于包含纯度大于90％的AT III。在其它实施方案中，AT III的纯度大于95％，优选至少约99％。在一些实施方案中，组合物中所有AT III的至少约50％，例如约50％至约100％、约60％至约90％、约70％至约80％是活性AT III。

在其它实施方案中，欲冻干的组合物包含至少约0.1mg/ml AT III，举例而言，约0.1至约100mg/ml、约0.5至约50mg/ml、约1至约30mg/ml和约5至约15mg/ml AT III，其中AT III是组合物中存在的总蛋白质的一部分或全部。

在一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的AT III。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段下可实现期望治疗效果的有效量，所述效果例如和遗传性抗凝血酶缺乏症相关的抗凝血。AT III的治疗有效量可根据例如个体受试对象的疾病状态、年龄、性别和体重以及AT III在受试对象体内引发期望反应的能力等因素变化。治疗有效量也可以是其中AT III的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。

在其它实施方案中，组合物包含预防有效量的AT III。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下可实现期望预防结果的有效量，所述结果例如在经历过多次血栓栓塞发作的受试对象或有进一步发作风险的患者中预防或抑制血栓栓塞发作。预防有效量可按照以上对于治疗有效量的描述来确定。

结晶赋形剂

在一个实施方案中，所述至少一种结晶赋形剂选自由丙氨酸、甘露醇、甘氨酸和NaCl组成的群组。

在一些实施方案中，所述至少一种结晶赋形剂在组合物中以至少约0.01％(w/v)，例如约0.01％至约10％、约0.1％至约5％和约0.7％至约1.8％(w/v)的总结晶赋形剂含量存在。

在其它实施方案中，冻干产物包含至少约20％(w/v)的总结晶赋形剂，例如约20％至约80％、约30％至约70％和约36％至约60％(w/v)的总结晶赋形剂。

在一些实施方案中，所述至少一种结晶赋形剂是丙氨酸和NaCl。在一个实施方案中，NaCl以约50mM至约300mM，优选约100mM至约250mM的含量存在。在一个实施方案中，可使用氯化钠本身，不存在任何前述结晶赋形剂，在这种情况下氯化钠可以约300mM或以上的含量包含在制剂中。在其它实施方案中，组合物(例如水性药用制剂)是高渗溶液。

除了所述至少一种活性成分和所述至少一种结晶赋形剂之外，组合物还可另外包含一种或多种其它赋形剂，即与所述活性成分组合使用以构成组合物的一或多种其它物质。所述一种或多种其它赋形剂的一些非限制性实例包括稳定剂、缓冲剂、二价阳离子(例如钙盐)、粘合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂、着色剂、调味剂、助流剂、表面活性剂、吸收剂和甜味剂。

根据本发明的活性成分和赋形剂的组合可提供活性成分在冻干制剂中的稳定性，然而，本发明的组合物也可在液态或半液态下呈现一定程度的稳定性。

在其它实施方案中，组合物另外包含稳定剂。举例来说，稳定剂可选自由蔗糖、甘露醇和海藻糖组成的群组。在冻干之前，稳定剂可以至少约1％，例如约1％至约4％和约2％至约3％的总稳定剂含量存在于组合物中。在一些实施方案中，稳定剂以约2％的含量存在于组合物中。

本发明的组合物中也可存在缓冲液，特别是在活性成分容易受冻干期间的pH变化不利地影响的情况下。冻干期间，pH优选应当维持在约6至8的范围内，更优选约7的pH。缓冲剂可以是能够充当缓冲液的任何生理学上可接受的化学实体或化学实体组合，包括(但不限于)磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸/磷酸盐缓冲液、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)、1，3-双-[三-(羟甲基)甲基氨基]-丙烷(BIS-Tris Propane)、哌嗪-N，N′-双-(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)和N-2-乙酰胺基-2-氨基乙磺酸(ACES)。

在一个实施方案中，缓冲剂以约10至约50mM的浓度包含在组合物中。当组氨酸单独或与其它缓冲液如Tris组合加入到组合物中时，可使用至少约20mM，优选约25mM的浓度。

在其它实施方案中，组合物另外包含二价阳离子，例如钙盐。在一个实施方案中，钙盐以约1mM至约5mM的含量存在。

在一个实施方案中，组合物另外包含表面活性剂。表面活性剂可以约0.1％或以下的含量存在。表面活性剂的非限制性实例包括POLYSORBATE 20(例如)、POLYSORBATE 80(例如

)、聚氧乙烯(80)山梨醇酐脂肪酸酯、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyols)(例如F-38、F-68)和聚氧乙烯二醇十二烷基醚(polyoxyethyleneglycol dodecyl ethers)(例如Brij-35)。

根据本发明，组合物还可另外包含抗氧化剂。抗氧化剂可以至少0.05mg/ml，例如约0.05至约50mg/ml、约0.1至约10mg/ml和约1至约5mg/ml的总含量存在于组合物中。抗氧化剂的非限制性实例包括N-乙酰基-L-半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)、硫辛酸、甲硫氨酸、硫代硫酸钠、铂、甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)和丁基羟基甲苯(BHT)。在一些实施方案中，组合物另外包含约0.05mg/ml至约5mg/ml含量的谷胱甘肽。

本发明的组合物还可包含钙或另一种二价阳离子，特别是在阳离子与活性成分相互作用以维持其活性的情况下。在一个实施方案中，组合物另外包含二价阳离子。在另一个实施方案中，二价阳离子以钙盐形式提供，例如氯化钙，但也可以是其它钙盐，例如葡萄糖酸钙、葡乳醛酸钙或葡庚糖酸钙。在一些实施方案中，钙盐以约1mM至约5mM的含量存在。在其它实施方案中，钙盐以约3mM至约4mM，优选约4mM的含量存在。

在一些实施方案中，组氨酸和谷胱甘肽的组合可对组合物中存在的特定活性成分的稳定性产生协同性有利影响。举例来说，组氨酸在用作缓冲液的同时还可用作金属螯合剂。在认为活性成分的活性水平受金属诱发的氧化作用影响方面，举例来说，组氨酸因此可通过氧化金属离子使结合稳定。认为通过结合这些金属，谷胱甘肽(或存在的任何其它抗氧化剂)因此能提供额外的抗氧化保护，因为组氨酸结合的金属离子的氧化作用已被抑制。本发明的组合物/制剂中也可包含其它螯合剂。所述螯合剂优选以比钙高的亲和力结合例如铜和铁等金属，例如在组合物中使用钙盐的情况下。所述螯合剂的一个实例为去铁胺，它是有助于去除Al⁺⁺和铁的螯合剂。

冻干法

除非另外指出，否则冻干方法的具体温度和/或温度范围一般是指冻干机设备的搁板温度。搁板温度是指流经冻干机搁板的冷却剂的控制温度，其典型地在冻干期间在温度方面被控制。样品温度(即产物温度)取决于搁板温度、腔室压力和/或初次干燥期间的蒸发/升华速率(蒸发冷却使产物温度低于搁板温度)。

A.冷冻

在一个实施方案中，第一温度为约-48℃或以下。在另一个实施方案中，第一温度为约-54℃或以下。在其它实施方案中，时间段为至少约30分钟，例如约30分钟至约20小时、约1至约18小时、约2至约16小时、约3至约14小时、约4至约10小时、约5至约8小时和约6至约7小时。在一个实施方案中，时间段为约6小时。

温度和时间段可取决于例如每瓶的溶液体积等因素，与欲冻干的组合物无关。

本发明有时候涉及完全或100％赋形剂结晶的目标，且所属领域技术人员了解“完全结晶”可能难以核实，特别是在技术灵敏度无法绝对肯定地告知赋形剂完全或100％结晶的情况下。因此，实际上，本发明提供相比先前方法至少改进赋形剂结晶的冻干方法。因此，如本文所用，“完全结晶”产物可例如通过差示扫描量热法(DSC)评估，其中所属领域技术人员认识到第一次扫描时的不可逆放热事件代表结晶事件，表明结晶赋形剂在冻干期间没有完全结晶。在一些实施方案中，所述至少一种结晶赋形剂部分结晶，其中部分结晶的特征在于结晶度为约50％或以上，例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.8％和小于100％。

B.退火

在其它实施方案中，所述方法另外包括将第一组合物暴露于第二温度持续第二时间段以获得第二组合物，其中第二温度高于第一温度。

在一个实施方案中，第二温度比第一温度高至少约5℃，例如比第一温度高约5℃至约30℃和约10℃至约20℃。举例来说，当第一温度为约-50℃时，在一些实施方案中第二温度为约-30℃。

在一些实施方案中，第二时间周期为至少10分钟，例如约10分钟至约10小时、约30分钟至约8小时、约1小时至约6小时和约2小时至约4小时。在其它实施方案中，第二时间段小于、大于或约等于第一时间段。

不希望受任何特定理论约束，认为，取决于条件和特定组合物，所述退火步骤可有助于提高升华速率和/或降低批次内不均匀性。

在一些实施方案中，退火步骤是任选的。

在其它实施方案中，在第二时间段之后，将第二组合物暴露于第三温度持续第三时间段，其中第三温度低于第二温度。举例来说，在一些实施方案中，第三温度与第一温度大致相同。在其它实施方案中，第三温度比第二温度低至少5℃，例如比第二温度低约5℃至约30℃和约10℃至约20℃。举例来说，当第二温度为约-30℃时，在一些实施方案中第二温度为约-50℃。

在一些实施方案中，本发明提供一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法。所述方法包括：

(a)将组合物暴露于第一温度，持续第一时间段，所述时间段足以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；

(b)将第一组合物暴露于第二温度持续第二时间段以获得第二组合物，其中第二温度高于第一温度；和

(c)将第二组合物暴露于第三温度持续第三时间段以获得第三组合物，其中第三温度低于第二温度。

在一个实施方案中，时间段为至少约30分钟，例如约30分钟至约20小时、约1至约18小时、约2至约16小时、约3至约14小时、约4至约10小时、约5至约8小时和约6至约7小时。在另一个实施方案中，时间段为约6小时。在其它实施方案中，时间周期为约3小时。在其它实施方案中，第三时间段小于、大于或约等于第一时间段。在其它实施方案中，步骤(a)和(b)中的条件(例如温度和时间)是相同的或基本相同。

C.干燥

在其它实施方案中，本发明的方法另外包括干燥阶段。干燥阶段可包括初次干燥阶段和二次干燥阶段。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法。所述方法包括：

(a)将组合物暴露于第一温度，持续第一时间段，所述时间段足以以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；和

(b)干燥第一组合物以形成冻干饼状物。

在其它实施方案中，本发明提供一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法，所述方法包括：

(a)将组合物暴露于第一温度，持续第一时间段，所述时间段足以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；

(b)将第一组合物暴露于第二温度持续第二时间段以获得第二组合物，其中第二温度高于第一温度；

(c)将第二组合物暴露于第三温度持续第三时间段以获得第三组合物，其中第三温度低于第二温度；和

(d)干燥第三组合物以形成冻干饼状物。

在一个实施方案中，干燥包括初次干燥步骤。初次干燥可去除冷冻水(冰的升华)。优选地，通过初次干燥从样品去除未结合的或可轻易去除的冰。未结合的水在初次干燥步骤开始时可优选地是自由冰的形式，它可通过升华作用去除，即从固体直接转换为蒸气。

在一些实施方案中，初次干燥步骤可在约-35℃至约20℃，或约-25℃至约10℃，或约-20℃至约0℃的温度下执行。在一个实施方案中，初次干燥步骤在约0℃下执行。在其它实施方案中，初次干燥步骤可执行至少约1小时的总时间，例如约1小时至约1周、约10小时至约4天和约20小时至约40小时。在另一个实施方案中，初次干燥步骤包括在约0至约200mTorr(毫托)、优选约100mTorr的压力下，将第一或第三组合物在约-50℃的温度下干燥约1小时，随后在0℃下干燥约35小时。

任选的“初次干燥斜坡(primary drying ramp)”步骤(即从初次干燥之前的步骤到初次干燥温度的温度增加)可根据本发明的方法以每分钟约0.1℃至约10℃的速率执行。

初次干燥步骤可执行足够长的时间，以确保样品中的冷冻水被基本上完全去除。所属领域技术人员了解初次干燥时间可随配置改变，因为初次干燥的持续时间可取决于填充体积和几何学(饼状物的表面积--阻力/通量)。在一个实施方案中，初次干燥的持续时间为至少约5小时，例如约5小时至约100小时、约10小时至约80小时、约30小时至约60小时和约40小时至约50小时。

初次干燥可通过多种方法监视，包括观察冷冻干燥期间产物温度的变化。另一种方法是观察腔室压力的变化，在这种情况下当升华结束时，在腔室中不再存在水分子，从而不再造成压力变化。初次干燥步骤的结束可确定为当产物(样品)温度接近搁板温度时，例如通过因为升华速率下降导致的产物温度迹线斜率的显著变化所证明；当升华结束时，蒸发冷却结束。为了防止过早结束，在一些实施方案中，持续时间可增加额外的2到3小时的初次干燥。监视初次干燥完成的另一种方法是压力升高测试，在这种情况下通过断开真空源，腔室压力应当以取决于产物中水分含量的速率升高。在一个实施方案中，初次干燥过程的结束可设定成当压力升高速率低于规定值时。确定初次干燥步骤结束的另一种方法是测量传热速率。

在其它实施方案中，在即将开始初次干燥之前，组合物可放置在即将开始初次干燥之前的步骤的温度下置于真空。一旦启动，真空就可在冻干过程的剩余部分内存在，虽然真空水平可以改变。

关于冻干期间的干燥的其它信息可见于Carpenter，J.F.和Chang，B.S.，Lyophilization of Protein Pharmaceuticals，Biotechnology and BiopharmaceuticalManufacturing，Processing and Preservation，K.E.Avis和V.L.Wu编.(BuffaloGrove，IL Interpharm Press，Inc.)(1996)，其以引用其干燥教导的方式而并入本文。

在一个实施方案中，干燥另外包括一个或多个二次干燥步骤以降低水分含量，优选降到提供最终产物的期望生物和/或结构特征的水平。

在一些实施方案中，一个或多个二次干燥步骤中的每个步骤都在约0℃或以上，例如约0℃至约100℃、约10℃至约90℃、约20℃至约80℃、约30℃至约70℃、约40℃至约60℃和约45℃至约50℃的温度下执行。在一个实施方案中，二次干燥步骤包括分别在约40℃、约45℃和约50℃下执行的第一、第二和第三二次干燥步骤。在一个实施方案中，二次干燥步骤包括在约35℃的温度下干燥约16小时的时间段。

将温度升高到一个或多个二次干燥步骤的步骤在本文中被称作“二次干燥斜坡”，它是任选的。二次干燥斜坡可以每分钟约0.1℃至约10℃的温度增速执行。

一个或多个二次干燥步骤中的每个步骤可执行足够长的时间，以便使冻干产物中的残余水分水平降到最终水平。在一些实施方案中，最终残余水分水平为约10％或以下，例如约9％或以下、约8％或以下、约7％或以下、约6％或以下、约5％或以下、约4％或以下、约3％或以下、约2％或以下、约1％或以下、约0.8％或以下、约0.6％或以下、约0.5％或以下、约0.2％或以下和约0.1％或以下。

在一个实施方案中，二次干燥步骤在约35℃下执行。在其它实施方案中，二次干燥步骤可执行至少约1小时，例如约1小时至约1周、约10小时至约4天和约16小时至约40小时的总时间。在另一个实施方案中，二次干燥步骤包括在约0至约200mTorr，优选约100mTorr的压力和约35℃的温度下干燥约16小时。

为了确定样品中的残余水分水平，例如可使用卡尔-费歇尔法(Karl Fischermethod)。此外，也可使用压力升高测试或传热速率测量来确定一个或多个二次干燥步骤中的每个步骤的结束。或者，也可使用电子湿度计或残余气体分析仪。此外，可使用搁板温度(其中一个或多个二次干燥步骤的搁板温度等于或小于高温步骤中所用的温度)和持续时间的不同组合来确定一个或多个二次干燥步骤的最短持续时间。可通过若干方法确定残余水分含量，包括干燥失重法、卡尔-费歇尔滴定法、热重分析法(TGA)、气相色谱法(GC)或红外光谱学。

不希望受任何特定理论约束，认为在冻干期间，活性成分从处于水相转变为处于非晶固相，非晶固相被认为保护活性成分以防止化学和/或构象不稳定。冻干制剂不仅含有非晶相，而且还包含在冻干期间结晶的组分。这可实现活性成分的冻干和更精致饼状物(例如在其被冻干的容器的侧面具有最小收缩率的饼状物)的形成。

在一个实施方案中，冻干饼状物的特征为小于50％的松垮率。在另一个实施方案中，冻干饼状物的特征为约0％至约24％的松垮率。

在另一方面，本发明提供一种冻干包含AT III的水性药用制剂的方法，所述方法包括：

(a)将制剂暴露于约-45℃以下的温度持续足够长的时间段，以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；和

(b)干燥第一组合物以形成冻干饼状物。

在其它方面，本发明提供一种冻干包含AT III的水性药用制剂的方法，所述方法包括：

(a)将制剂暴露于约-50℃以下的冷冻温度持续足够长的时间段，以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；和

(b)干燥第一组合物以形成冻干饼状物。在一些实施方案中，所述方法任选地另外包括退火步骤，其中制剂暴露于高于冷冻温度的退火温度。

在另一方面，本发明提供一种冻干包含AT III的水性药用制剂的方法，所述方法包括：

(a)将制剂暴露于约-60℃以下的温度持续足够长的时间段，以获得含有部分或完全结晶的至少一种结晶赋形剂的第一组合物；和

(b)干燥第一组合物以形成冻干饼状物。

还提供了根据本发明的方法制备的组合物(例如结晶和/或冻干的药用组合物和饼状物)。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种根据本发明制备的冻干AT III组合物或饼状物。

在其它实施方案中，本发明的方法提供在冻干产物储存之后至少保持或基本上保持活性成分的效力的产物。在一个实施方案中，冻干产物在约5℃、约25℃或约40℃下储存约1个月、约2个月、约3个月或约6个月或以上之后，活性成分的效力仍得到保持或基本上保持。在另一个实施方案中，在冻干产物储存之后，活性成分的效力为相对于其冻干前效力的至少约：70％、80％、90％、95％、99％和100％。

试剂盒

在其它方面，还提供了包含本发明的药用组合物的试剂盒，其中试剂盒另外包含无水和液体组分，其中无水和液体组分可存在于试剂盒的单独容器中，或所述组分的一些可组合于一个容器中，例如其中无水组分存在于第一容器中且液体组分存在于第二容器中的试剂盒，其中这些容器可以或可以不以组合配置存在。任选地，试剂盒可另外包含多种其它试剂。任选地，试剂盒可另外包含使用试剂盒的组分的说明书，例如用适当稀释剂重构冻干组合物的说明书。说明书可以包装插页(package insert)的形式存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签上。

本发明将通过实施例得到更详细的说明，但应注意本发明不限于这些实施例。

实施例

实施例1

为了确定促进AT III溶液中的组分结晶并改善成品物理外观的冷冻条件，对含有人类血浆来源的AT III(6.88mg/ml)、丙氨酸(100mM)和NaCl(150mM)的AT III制剂执行冻干。丙氨酸和NaCl二者都是结晶赋形剂。对于此制剂来说，物理外观可与赋形剂的结晶度直接相关。希望在冷冻期间使NaCl和丙氨酸尽可能完全地结晶以便提供支持饼状物结构的固体基质。

差示扫描量热法：利用差示扫描量热仪(型号2920，TA instruments，Inc.，New Castle，DE)研究AT III制剂的冷冻-解冻热事件。DSC的温度和电池常数是使用高纯度铟根据标准程序来校准的。使用调制DSC研究最大程度冷冻浓缩的溶质的热流和热容量(Cp)改变。试验以0.5℃的幅度以80sec的时间进行。将20微升样品密封在铝制密封盘(aluminum hermetic pan)中并在零下温度范围内扫描。

NaCl、丙氨酸和AT III重构溶液中的热事件：研究NaCl、丙氨酸和AT III重构溶液中的结晶和熔融事件。

利用E-CHIP的DSC实验设计：执行利用Echip设计的DOE以评估冷冻温度、冷冻保持时间和退火保持时间对赋形剂结晶的影响。冷冻(从5℃到冷冻温度)斜坡率(ramp rate)被设定为2℃/min。退火之后，产物以5℃/min的速率从-30℃冷冻至冷冻温度。升温斜坡率被固定为1℃/min。

斜坡率对于结晶作用的影响：比较不同的冷却速率(2℃/min对比0.2℃/min)以研究斜坡率对于结晶作用的影响。也评估了退火期间的各种斜坡率(5℃/min对比0.2℃/min，1℃/min对比0.2℃/min)。

凝聚相的形成：在过度冷却过程中，在液相中可以获得但在结晶固相中无法获得的分子构象和构型发生冻结。这种在冷却期间‘捕获’构象和构型的过程发生在当粘度增长速率超过分子重取向速率时。构象状态的‘冻结’产生凝聚相，其将具有一定程度的短程分子有序性，但类似于液体，缺乏结晶固体PI的长程分子有序性特征。

通过调制DSC观察凝聚相的形成，其中被冷冻浓缩的非晶相的热容量(Cp)持续降低直到达到平衡。Cp是固有性质且与分子运动性直接相关。较大的Cp意味着较大的运动性，较小的Cp则表示较小的运动性。液态物质的Cp大于其在固态下的Cp。Cp的降低是因为从较流态(more fluid state)到固态的物质的物理转化。

使用表1所示的冷冻和退火方案监控Cp。

表1：用于第一轮的AT III冻干循环

溶液从0℃冷冻到-52℃并保持120分钟。然后升温到-30℃并保持1小时。最后，将产物再次冷冻到-52℃保持另外2小时，然后升温到0℃。第一冷冻速率为0.2℃/min。也评估了冷冻保持时间(2小时、5小时和10小时)和温度(-46℃、-48℃和-52℃)对Cp的影响。

冷冻干燥：大部分实验在Lyostar II FTS系统(SP Industries)中执行。一些实验在Minilyo冷冻干燥机(Usifroid)中执行。冷冻技术列在表2中。

表2：冷冻技术

技术1到5对于第一次冷冻阶段在搁板温度和保持时间上不同。第二次冷冻温度被设定为和第一次冷冻温度相同。第二次冷冻的保持时间为2小时。技术6规定条件为产物在-52℃下冷冻2小时，在-30℃下退火1小时并在-52℃下再次冷冻额外的15小时。对于列于表1中的所有循环，退火、初次和二次干燥是相同的。

扫描电子显微镜(SEM)：使用SEM(Hitachi，型号S-3200，NCSU)检查被冷冻干燥的饼状物的形态。样品表面或表面以下的图像以50到5000倍的放大倍率被显示出来。因为被冷冻干燥的饼状物是良好的电绝缘体，所以在暴露于电子束时带电。这导致了分辨率的损失。为了降低对样品暴露于电子束的充电作用，使用桌面型丹顿真空(bench top Denton Vacuum)通过溅镀法在所有样品上涂布薄的金层。获取松垮的饼状物、固体饼状物、NaCl晶体和丙氨酸晶体的图像。

粉末X射线衍射：应用粉末X射线衍射(XRD)以表征松垮的饼状物(ETP5807)和固体饼状物(ETP 5807 26N9540)的结晶度。使用衍射仪(Rigaku，型号Multiflex)，利用40kV和40mA下的铜Ka辐射来记录XRD图。扫描在10°到90°的2θ范围内执行。对于NaCl样品的扫描速度为1°/min，对于丙氨酸、ETP 5807为0.125°/min。

结果和讨论：

DSC研究的目的是表征控制AT III制剂中的赋形剂结晶性质的关键因子，并确定了结晶温度(Tx)、共晶熔融温度(Te)和结晶百分比。

NaCl、丙氨酸和AT III溶液的结晶和熔融：对于NaCl纯溶液来说，冷冻期间的放热结晶峰出现在约-38℃，升温期间的吸热熔融峰出现在-19℃(图1)。熔融峰的熔化热被确定为7.4J/g。丙氨酸溶液的温谱图显示在冷冻期间于-45℃的放热峰，这指示结晶作用。然而，在升温期间，在大约-44℃有一组小的峰出现。这些峰的来源难以确定(图2)。

当分析重构的AT III溶液时，在冷冻期间没有观察到放热活动的证据。然而，在-22℃发现共晶熔融峰，这最有可能是因为NaCl(图3)。熔化热(2.0J/g)小于NaCl纯溶液。熔化热的降低可能是因为AT III制剂中的NaCl部分结晶。基于这种关联性，通过将从制剂获得的熔化热除以NaCl纯溶液的熔化热常数7.4J/g来计算结晶百分比。

DOE结果：执行由ECHIP使用中心复合立方体模型设计的DOE以评估冷冻温度、冷冻保持时间和退火保持时间对AT III溶液结晶的影响(表3)。

表3：结晶特征

DOE的结果表明评估的所有可变条件都对溶液的结晶具有显著影响。与-44℃和-60℃的温度下的冷冻相比，在-52℃下冷冻产生较大百分比的结晶NaCl。在较低温度(-60℃)下的结晶减少可通过结晶度和结晶速率之间的折衷来解释。较低温度下的结晶度较大。然而，溶液如此粘稠，以至于结晶速率显著下降。DOE数据分析得出最佳的冷冻温度是-54℃(图4)。

对保持时间的评估表明延长冷冻保持时间和退火保持时间可导致结晶百分比增加。DOE结果表明冷冻和退火二者的最佳保持时间都是10小时(图4)。

数据分析也得出不吻合的信息(out-of-fit message)，表明通过E-CHIP产生的模型可能无法完全地反映结晶过程。因此，执行其它DSC研究以便更好地理解在冷冻和退火期间伴随结晶过程的物理性质改变。

斜坡率对于结晶作用的影响：冷却速率：作为塑化剂，水可以充当物理稀释剂以增加自由体积和分子运动性。水增加分子运动性的能力可以促进受扩散控制的过程，如结晶作用。快速冷却可捕获非晶相内更多的水，而缓慢冷却则会使水流出系统。因此，快速冷却促进晶体形成。当冷冻速率从2℃/min降到0.2℃/min时，NaCl结晶百分比降低82％(从17％降到3％)。

退火期间的斜坡率：当从冷冻升温到较高温度时，分子运动性增加以至于发生成核和结晶作用。此阶段的斜坡率应当足够低，以便产生足量晶体。斜坡率从1℃/min到0.2℃/min的下降会使结晶百分比从38％增加到95％。斜坡率进一步降到0.1℃/min并没有显示太大差异。

随着从-30℃降温到-52℃，速率从5℃/min到0.2℃/min的下降会使结晶作用增加1.35倍(从17％增加到39％)。这些结果提示0.2℃/min的斜坡率对于结晶的发生是适当的。

凝聚相和结晶作用：其它的研究集中于凝聚相和结晶作用。图5A显示依据ETP-5807循环的Cp随时间的变化(表1)。Cp在第一次冷冻(图5B)、退火(图5C)和第二次冷冻(图5D)期间变化很小。Cp下降证实了凝聚相的形成。Cp的变化很小表明在冷冻和退火期间几乎没有相变发生。使用这些参数，仅获得了75％的结晶作用。结晶百分比是通过将5.5J/g的熔化热(图6)除以NaCl纯溶液的熔化热常数7.4J/g来计算。

随着冷冻保持时间的延长，观察到凝聚相的形成。图7A显示冷冻和退火期间Cp变化的完整图片。当第一次冷冻保持时间从2小时延长到5小时时，Cp降到最小平衡值，表明从较液相到较凝聚相的变化(图7B)。保持时间从5小时进一步增加到10小时没有引起Cp的进一步下降(未显示数据)。在升温斜坡期间观察到结晶峰(图7C)。当冷冻保持时间仅为2小时时，这个独特的峰并不存在。如果溶液在第一次冷冻和升温斜坡期间完全结晶，那么推测另外的退火或冷冻将对Cp很小或没有影响。这通过在退火和第二次冷冻期间没有观察到Cp变化得到证实(图7D和7E)。当冷冻时间从2小时延长到5小时时，结晶百分比增加到87％。同样地，结晶百分比也是通过将6.4J/g的熔化热(图8)除以常数7.4J/g来计算的。

这些结果表明AT III非晶相在-52℃下需要5小时来完成物理转变。如果仅冷冻2小时，那么凝聚相恰好开始形成。足够的冷冻保持时间是结晶作用的一个先决条件。

在高于-52℃的温度下执行了类似的研究。这些结果表明当产物温度为-46℃时，没有结晶活动。在-48℃的温度下，当保持时间从4小时增加到5小时时，结晶百分比从36％增加到84％。因此，优选AT III溶液在-48℃以下冷冻至少5小时，以诱导充分的结晶作用。

冻干过程发展：为了在宏观规模上证实DSC研究的结果，在实验室冷冻干燥机中评估了四个冷冻温度(-50℃、-52℃、-54℃和-60℃)和两个保持时间(2小时和6小时)。

在-52℃下冷冻2小时：使用Lyostar II FTS装置对执行期间所用的表1的当前循环参数进行初步评估。图9展示温度和腔室压力曲线图。冷冻过程中用热电偶测量的最高产物温度是大约-49℃(图10)。在处理之后，物理检查揭示只有2％的饼状物是可接受的，17％具有小孔，57％部分松垮且23％是破碎的。基于DSC结果，产物温度(-49℃)足以诱导结晶作用，然而，冷冻保持时间需要至少为5小时以在结晶之前形成凝聚相。2小时的冷冻持续时间太短而不能产生足够的晶体。

在-54℃下冷冻2小时：在这个循环中，AT III溶液在-54℃下冷冻2小时，在-30℃下退火1小时并再次在-54℃下冷冻2小时。冷冻是在Lyostar II FTS装置中执行。初次和二次干燥是在CS10-0.5(Serail 14L03)中执行。图11和12中的图表显示冷冻期间产物温度被保持在-50℃以下。物理检查揭示74％的饼状物是可接受的，26％具有小孔。尽管我们看到产物温度从-49℃降到-50℃改进了饼状物外观，但结果仍然不令人满意。这些结果表明仅在低温下冷冻不足以诱导完全结晶。

在-54℃下冷冻6小时：在这个循环中，AT III溶液在-54℃下冷冻6小时，在-30℃下退火1小时并再次在-54℃下冷冻2小时。循环在FTS冷冻干燥装置中执行。冷冻期间产物温度被维持在-50℃以下(图13和14)。物理检查表明所有的饼状物都可接受。这些结果表明产物温度和冷冻保持时间对于确保最佳结晶同等地重要。所述结果和DSC观察结果一致。

在-50℃下冷冻6小时：在这个循环中，AT III溶液在-50℃下冷冻6小时，在-30℃下退火1小时并再次在-50℃下冷冻2小时。循环在Lyostar II FTS装置中执行。使用这些参数，冷冻期间产物温度被维持在-47℃以下和-48℃以上(图15和16)。物理检查表明只有18％是可接受的，23％具有小孔，59％展现松垮性。这项研究证实了先前的DSC发现，也就是为了启动结晶作用产物温度需要低于-48℃。它也证明了单独延长冷冻保持时间不足以形成充分的晶体。

在-60℃下冷冻6小时：在这个循环中，AT III溶液在-60℃下冷冻6小时，在-30℃下退火1小时并再次在-60℃下冷冻2小时。循环在Minilyo冷冻干燥机(Usifroid)中执行。在冷冻期间，顶部搁板上的产物温度为-51.6℃，底部搁板上的产物温度为-52.7℃(图17和18)。物理检查表明所有的饼状物都可接受。这项实验进一步证明了降低搁板温度和延长冷冻保持时间都是生产药学上可接受的饼状物的重要策略。

在-52℃下冷冻15小时：在这个循环中，AT III溶液在-52℃下冷冻2小时，在-30℃下退火1小时并再次在-52℃下冷冻15小时。冷冻是在Lyostar II FTS装置中执行。初次和二次干燥是在Serail中执行，因为FTS中的隔离阀在初次干燥期间被堵塞。在冷冻期间用热电偶测量的最高产物温度低于-48℃(图19和20)。所有饼状物的物理外观都是可接受的。基于DSC结果，-48℃是诱导结晶作用所必需的最高产物温度。并且15小时的保持时间似乎足够长，以确保完全结晶。

总结：表4列出了对于不同搁板温度设定点的温度响应。

表4：对于不同搁板温度设定点的温度响应。

A＝干燥机；B＝搁板温度设定点(℃)；C＝搁板入口(℃)；D＝搁板出口(℃)；E＝顶部搁板入口(℃)；F＝顶部搁板出口(℃)；G＝底部搁板入口(℃)；H＝底部搁板出口(℃)；和I＝产物温度(℃)。

因为产物温度典型地比目标搁板温度设定点要高4℃到6℃，所以目标搁板温度优选被设定为-54℃以确保在整个冻干机中所有的产物温度都保持在-48℃以下。基于这些研究的结果(表5)，可选择冷冻期间的目标搁板温度以确保产物温度远低于-48℃。

表5.冷冻温度和保持时间对饼状物外观的影响。

*小孔；**松垮的；***破碎的。

此外，可分配足够的时间来确保完全结晶。数据表明-54℃的搁板温度和6小时的浸泡可实现这些条件并促进充分结晶。因此，冷冻浸泡时间从2小时延长到6小时和目标搁板温度设定点从-52℃降到-54℃二者将会改善成品的物理外观。

冷冻干燥饼状物的形态：通过扫描电子显微镜观察冷冻干燥饼状物的形态。部分松垮的饼状物用作固体和坚固饼状物的对照物。松垮的饼状物含有很多碎片，这些碎片很薄并且多孔(图21A)。固体饼状物(图21B)主要由板状晶体构成，还有一些圆形晶体遍布在饼状物中。NaCl自身形成小的圆形晶体(图22)。丙氨酸单独(图23)形成连续平板，具有可能由冰升华引起的一些孔洞。可以推断图21B的板状晶体主要是来自丙氨酸，圆形晶体是来自NaCl。

粉末X射线衍射：基于DSC和冷冻研究所产生的数据，进行第二次ETP-5807最大负荷运行。这次运行包括在第一次冷冻步骤期间的较低冷冻温度以及延长的浸泡时间。改良的循环产生了具有可接受的物理外观的产物。

为了表征来自第一次运行的松垮饼状物和来自第二次运行的固体饼状物的结晶度，评估了NaCl、丙氨酸、ETP 5807(松垮饼状物)和来自ETP 5807的第二次运行的物质(固体饼状物)的XRD图(图24)。主要的NaCl结晶衍射峰出现在31.7°和45.5°2θ。主要的丙氨酸结晶衍射峰出现在20.5°2θ。丙氨酸样品中出现的宽峰被指派给非晶部分。ETP 5807(第一次运行)和ETP 5807(第二次运行)饼状物显示NaCl和丙氨酸的峰组合。对于这两个样品也观察到宽峰。

通过将结晶峰面积除以非晶峰面积和结晶峰面积的总和来计算结晶度。NaCl、丙氨酸、ETP 5807和ETP 5807(第二次运行)的结晶度分别拟合为99±20％、50±1％、66±2％和60±1％。对于松垮饼状物和固体饼状物的衍射图没有观察到差别。

结论：为了设计冻干法中的冷冻方案，以结晶百分比为重点表征了AT III制剂。结果表明冷冻温度和保持时间对于完全结晶是同等重要的先决条件。在一些实施方案中，冻干法可包括约-54℃的冷冻温度以及约6小时的延长浸泡时间。这些测试获得了药学上可接受的成品。

实施例2

用10ml包含AT III(～6.88mg/ml)、丙氨酸(100mM(～8.91mg/ml))和NaCl(150mM(～8.7mg/ml))的无菌过滤溶液填充30ml模制小瓶。AT III样品首先冷冻到-25℃并保持2小时，然后进一步冷冻到-54℃并保持6小时。搁板温度然后以0.2℃/min的速率缓慢升高到-30℃并在该温度下保持2小时，然后以0.2℃/min的速率缓慢降回-54℃。产物在-54℃下保持2小时，然后开始初次干燥。初次干燥在搁板温度0℃和受控腔室压力100mTorr下执行。初次干燥持续大约32小时，然后开始二次干燥。二次干燥在搁板温度35℃和腔室压力100mTorr下执行14小时。

干燥之后，得到约100％的药学上可接受的冻干饼状物。药学上可接受的饼状物的百分比是通过将可接受的饼状物的数量除以整个批次中饼状物的数量来计算的。此外，应用调制DSC，且观察到冷冻阶段中的凝聚相形成和升温斜坡期间的结晶过程。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法，所述方法包括将所述组合物暴露于第一温度持续第一时间段，所述第一时间段足以获得含有部分或完全结晶的所述至少一种结晶赋形剂的第一组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活性成分是AT III。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种结晶赋形剂选自由丙氨酸、甘露醇、甘氨酸和NaCl组成的群组。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度是足以提供约-48℃或以下的组合物温度的搁板温度。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度是约-54℃或以下。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段是至少约5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种结晶赋形剂是丙氨酸和NaCl。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述丙氨酸和所述NaCl在所述组合物中以各自约100mM存在。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度和所述第一时间段足够使所述至少一种结晶赋形剂完全或几乎完全结晶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物另外包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂选自由以下组成的群组：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂和二价阳离子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物另外包含选自由以下组成的群组的缓冲剂：磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和柠檬酸/磷酸盐缓冲剂、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷、1，3-双-[三-(羟甲基)甲基氨基]-丙烷、组氨酸、哌嗪-N，N′-双-(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)丙磺酸、N-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙磺酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸和N-2-乙酰胺基-2-氨基乙磺酸。

12.根据权利要求1所述的方法，另外包括干燥所述第一组合物以获得冻干饼状物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述冻干饼状物是至少50％固体的饼状物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物是包含药学上可接受的载体的液体药用组合物。

15.根据权利要求1所述的方法，另外包括将所述第一组合物暴露于第二温度持续第二时间段以获得第二组合物，其中所述第二温度高于所述第一温度。

16.根据权利要求15所述的方法，另外包括将所述第二组合物暴露于第三温度持续第三时间段以获得第三组合物，其中所述第三温度低于所述第二温度。

17.根据权利要求16所述的方法，另外包括干燥所述第三组合物以获得冻干饼状物。

18.一种试剂盒，包含根据权利要求12所述的冻干饼状物。

19.一种冻干包含血浆来源的AT III、NaCl和丙氨酸的液体组合物的方法，所述方法包括：

(a)将所述组合物暴露于约-54℃或以下，使得所述组合物的温度为约-48℃或以下并持续约5小时或以上，以提供其中含有完全或几乎完全结晶的一种或多种组分的第一组合物；和

(b)干燥所述第一组合物以获得冻干饼状物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述冻干饼状物在约25℃至约40℃下储存约1个月至约6个月之后，AT III的效力被保留或基本上被保留。

Claims (20)

1.一种冻干包含至少一种活性成分和至少一种结晶赋形剂的组合物的方法，所述方法包括将所述组合物暴露于第一温度持续第一时间段，所述第一时间段足以获得含有部分或完全结晶的所述至少一种结晶赋形剂的第一组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活性成分是AT III。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种结晶赋形剂选自由丙氨酸、甘露醇、甘氨酸和NaCl组成的群组。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度是足以提供约-48℃或以下的组合物温度的搁板温度。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度是约-54℃或以下。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段是至少约5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种结晶赋形剂是丙氨酸和NaCl。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述丙氨酸和所述NaCl在所述组合物中以各自约100mM存在。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度和所述第一时间段足够使所述至少一种结晶赋形剂完全或几乎完全结晶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物另外包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂选自由以下组成的群组：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂和二价阳离子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物另外包含选自由以下组成的群组的缓冲剂：磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和柠檬酸/磷酸盐缓冲剂、组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷、1，3-双-[三-(羟甲基)甲基氨基]-丙烷、组氨酸、哌嗪-N，N′-双-(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)丙磺酸、N-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙磺酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸和N-2-乙酰胺基-2-氨基乙磺酸。

12.根据权利要求1所述的方法，另外包括干燥所述第一组合物以获得冻干饼状物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述冻干饼状物是至少50％固体的饼状物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物是包含药学上可接受的载体的液体药用组合物。

15.根据权利要求1所述的方法，另外包括将所述第一组合物暴露于第二温度持续第二时间段以获得第二组合物，其中所述第二温度高于所述第一温度。

16.根据权利要求15所述的方法，另外包括将所述第二组合物暴露于第三温度持续第三时间段以获得第三组合物，其中所述第三温度低于所述第二温度。

17.根据权利要求16所述的方法，另外包括干燥所述第三组合物以获得冻干饼状物。

18.一种试剂盒，包含根据权利要求12所述的冻干饼状物。

19.一种冻干包含血浆来源的AT III、NaCl和丙氨酸的液体组合物的方法，所述方法包括：

(a)将所述组合物暴露于约54℃或以下，使得所述组合物的温度为约48℃或以下并持续约5小时或以上，以提供其中含有完全或几乎完全结晶的一种或多种组分的第一组合物；和

(b)干燥所述第一组合物以获得冻干饼状物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述冻干饼状物在约25℃至约40℃下储存约1个月至约6个月之后，AT III的效力被保留或基本上被保留。

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