CN102747002B - 一种具有自生固氮能力的土壤杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有自生固氮能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)Ymu6-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5007。本发明提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能够抗较高浓度的Cd生长，能够分泌吲哚乙酸产生铁原子；制备得到的微生物菌剂可以明显促进超累积植物的生长，增加超累集植物的生物量，极大地提高超累积植物的重金属富集系数和转运系数，又能改善土壤生态环境，环境友好且成本低廉。

Description

一种具有自生固氮能力的土壤杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有自生固氮能力的土壤杆菌，该土壤杆菌用紫外线-等离子体复合诱变获得，具有抗重金属生长的能力，可用于土壤重金属污染环境治理，属于微生物应用技术领域。 

背景技术

重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染，主要由采矿、废气排放、污水灌溉等人为因素所致。近年来，随着人口的增长、工业的快速发展、化肥与农药等的大量使用，使得土壤重金属污染日益加剧。 

Cd是一种毒性很大的重金属，震惊世界的日本“痛痛病”就是因镉污染而致。镉会取代骨中的钙，使骨骼软化，骨头寸断；镉还会引起胃肠功能失调，干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压。镉对人体组织和器官的毒害是多方面的，且治疗极为困难。因此，各国对工业排放“三废”中的镉都作了极严格的规定。日本规定大米含镉超过1毫克/公斤即为“镉米”，禁止食用。日本环境厅规定0.3ppm为大米中镉浓度的最高正常含量。 

目前，用于土壤重金属污染修复的技术主要有：物理修复、化学修复和生物修复法。物理修复法处理效果较好，但是工程量大，成本高。化学修复法主要包括化学改良、表面活性剂清洗和有机质改良等方法。其优点是操作简单，成本较低，缺点是没有从根本上除掉重金属，而且加入的改良剂具有二次污染的风险。生物修复包括动物修复、植物修复、微生物修复和微生物与植物联合修复等。植物提取是目前研究最多的修复方法，该法是利用超累积重金属的植物吸收土壤中的重金属离子，将重金属离子大量富集在植物的地上部分，通过收割或拔除植物的地上部分减少和去除土壤重金属。已报导的超累积植物有遏蓝菜属、燕麦草、印度芥菜、油菜、紫花苜蓿、紫穗槐等，目前主要用于去除污染土壤中的Pb、Cd等。该法的优点是修复彻底，没有二次污染，缺点是大部分超累积植物存在生长缓慢、生物量小、重金属累积量不高，修复时间较长等缺点。植物-微生物联合修复法是近几年来国内外研究较多的一种新的修复方法，该方法是利用微生物强化超累积植物修复的效率，彻底去除污染土壤中的重金属。在土壤-微生物-植物共生环境中，微生物能够将土壤中有机质和植物根系的分泌物转化为小分子供自身利用，同时，微生物在自身代谢过程中产生的铁载体、吲哚乙酸（IAA）、草酸等有机酸能够活化土壤中的重金属，使重金属的有效态增加，而且微生物还有很强的氧化还原能力，可对铁、锰氧化物进行还原，释放出重金属，从而提高超累积植物对重金属的富集和转运。 除此之外，微生物还可合成IAA、铁载体，ACC脱氨酶以及固氮、解磷和解钾等作用促进植物生长，增加植物生长量，从而加速重金属的去除。如Whiting等人将表面消毒的遏兰菜种子接入灭菌的含重金属Zn的土壤中，再接入具有Zn抗性的细菌，结果接入细菌的植物地上部分累积重金属Zn的量是不接细菌的植物的2倍，地上部分和根中累积的总的Zn量，接入细菌的为不接入细菌植物累积量的4倍。 

氮素是作物生长发育过程中必需的大量元素之一，对作物最终产量的贡献为40%-50%。高浓度的重金属可使植物丧失根瘤结节能力，从而完全抑制土壤中的共生固氮过程，易造成植物缺氮。如果单纯依靠施氮肥，不仅不经济，而且容易造成土壤板结，氮肥的过量施用会造成地下水亚硝酸盐的污染和江河湖泊的富营养化。自生固氮菌剂可以固定空气中的氮气，将氮气转变成铵态氮，与根瘤菌相比使用范围较广，生产和使用都较为方便。但是，大部分野生的固氮菌都存在生长缓慢、抗重金属生长和固氮能力较低的缺点，不能满足污染土壤修复的需要。为此，采用种种方法来打破菌种的正常代谢，使之产生所需要的目标代谢产物（如蛋白酶）、提高其抗性能力等，要达到此目的，主要措施就是需要进行菌种的选育，如进行物理和化学诱变等。 

发明内容

本发明的目的之一是通过紫外线-等离子体复合诱变获得一株可用于土壤重金属污染环境治理的具有自生固氮能力和抗重金属生长能力的土壤杆菌。 

本发明的目的之二是提供含有上述土壤杆菌的微生物菌剂及其制备方法； 

本发明的目的之三是提供上述土壤杆菌在土壤重金属污染环境治理和土壤生态修复中的应用。

本发明实现过程如下： 

一种具有自生固氮能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌(Agrobacterium sp.) Ymu6-2，已于2011年6月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.5007。

Ymu 6-2在固体培养基A上菌落呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐，菌落周围有透明圈，G^-，好氧或兼性厌氧，扫描电镜显示呈粗短杆状，最适的生长温度28~32℃，最适的pH值为6.0~8.0，其固氮能力在0.56~0.73nmol·10⁷cfu^-1·h^-1，解无机磷能力为264.5mg/l，其产吲哚乙酸（IAA）的能力为15.25~30.6μg/ml，产铁载体的能力（A/Ar）为0.806~0.402；所述培养基A组成为：酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2。 

本发明提供的高效固氮微生物菌株的诱变选育方法，包括以下步骤： 

1）以实验室从植物根际筛选的土壤杆菌YSGD06作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株YSGD06的单细胞悬液

将出发菌株YSGD06接种于液体培养基A中，28-32℃，120-150rpm培养12-16hrs，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述的培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2。

(2)紫外线诱变 

将步骤（1）所得的菌悬液分别调节浓度至10⁵-10⁷个/ml，取0.1ml分别涂布于含400-800mg/L Cd²⁺无氮固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；28-32℃静置培养5-7days，各挑选20-30个较大的单菌落，进行摇瓶复筛，用乙炔还原法测定各菌株的固氮酶活性，选择5株固氮酶活性最高的菌株，再分别作摇瓶复筛，选出一株固氮酶活性高且稳定性好的菌株YSGD06-Z，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的无氮固体培养基B组分为：葡萄糖 10-20g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g, NaCl 0.2g, CaSO₄·2H₂O 0.2g, CaCO₃ 5g, CdCl₂ 0.080-0.32g,琼脂 15-18g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2；

所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到的20-30个接种到100ml 上述的液体培养基A中，培养8-12hrs。各取5ml 菌液接种到装有100ml液体培养基C的250ml的锥形瓶中，28℃，150rpm摇床振荡培养48h后，将棉塞换成橡胶塞，封口膜滴蜡密封，注射器抽取10-15%的空气，注入10-15%的乙炔气体，继续反应，用乙炔还原法测定固氮酶活性；

所述的液体培养基C所含组分为：葡萄糖 10-20 g， KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g,  MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g ，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g, 蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2。

（3）等离子体诱变 

将步骤（2）所得的YSGD06-Z菌株，制成10⁵-10⁷个/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml分别均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3-8mm左右，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，分别涂布于含400-800mg/L Cd²⁺无氮固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株固氮酶活性最高的一株菌YSGD06-Z2，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤（2）。

（4）将步骤（3）所得的YSGD06-Z2菌悬液活菌数调至10⁵-10⁷个/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株耐受重金属Cd且固氮酶活性最高的菌株Ymu6-2。 

诱变株Ymu 6-2与土壤杆菌具有高度的同源性，菌种鉴定的结果如下： 

CCGGGGGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGAGTGATGGTGCTTGCACTATCACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAAGTTAATACCTTCAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCCTTACCTGGGCCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCATTTTCCTTATTTGCCAGCGAGTTATGTCGGGACTTTAAGATACTGCAGTGAAAAACTGGAGGAGCGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCTACGCAAGGCTAACAACACGTGCTACATGGTCGGTACAATGTGCTACTAAGGAATGGAAGCCTAACCTCCAAAAAAGGGCG

本发明还提供一种高效固氮菌剂，根据营养物载体不同可以为液体菌剂或固体菌剂。

菌剂的制备包括以下步骤： 

1)菌种发酵

①一级三角瓶液体培养

将冻存的Ymu6-2在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有液体培养A的三角瓶中，28-32℃,振荡培养15-20hrs；

②二级发酵罐发酵

将Ymu6-2的一级培养液按照5-10%的接种量接入装有培养基E的发酵罐中，进行发酵培养,罐温28-32℃，培养pH7-8，通气培养20-30 hrs；

所述的培养基E组成为：蔗糖10-15g，淀粉2-3g，豆粕20-30g，KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g, MgSO₄7H₂O 0.1-0.2 g ，Na₂MoO₄2H₂O 0.0025-0.005 g, 水1000ml，p H 7.0~7.2。

2)将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为50-70:20-30:10-20的比例均匀混合,该基质中还含有一定浓度的钼酸钠和硫酸亚铁，其中钼酸钠为0.2~0.5g/Kg，硫酸亚铁为0.05~0.08g/Kg； 

3）将步骤1）中得到的Ymu6-2发酵液直接打入储液罐，即得液态高效固氮菌剂，将得到的发酵液按照50-100ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28-32℃发酵5-7days，得到固态高效固氮菌剂。

本发明提供的菌剂的使用方法，其特征在于，液体菌剂可用于超累积植物浸种、移栽时浸根、育苗期或生长期灌根时按比例加入，在植物浸种时以50-100倍的稀释液浸泡种子或植物根部2-5hrs，育苗期或生长期灌根采用100-500倍的稀释液20-40ml/Kg土壤的剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-3次；固态菌剂可作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-20g/Kg土壤，土壤中Cd的去除率比对照组增加了31.6-92.5%。 

本发明的优点与有益效果： 

1）采用等离子体诱变和紫外诱变多次循环处理的方法，保证了突变菌株的稳定性；

2）提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能够抗较高浓度的Cd生长，能够分泌吲哚乙酸、产生铁原子，具有ACC脱胺酶活性等，传代14次遗传性状稳定。能够促进超累积植物的生长，提高超累积植物的富集系数和转运系数；

3）本发明的菌剂营养要求简单、易培养、生长周期短、能够进行规模化的大生产；

4）本发明的菌剂可以明显促进超累积植物的生长，增加超累集植物的生物量，极大地提高超累积植物的重金属富集系数和转运系数，又能改善土壤生态环境，环境友好且成本低廉；

5）为开发利用植物根际促生菌强化土壤中重金属的快速去除提供了新途径，对重金属污染环境的治理和生态修复具有重要的意义。

附图说明

图1为Ymu 6-2扫描电镜照片； 

图2为Ymu 6-2产生铁离子定性实验照片；

图3为Ymu 6-2传代稳定性；

图4为Ymu 6-2在含Cd²⁺液体培养基A中的生长情况；

图5为印度芥菜在含Cd土壤中的生物量（干重）；

图6为印度芥菜地上部分累积Cd的含量；

图7为印度芥菜对Cd的去除率；

图8为紫花苜蓿在含Cd土壤中的生物量；

图9为紫花苜蓿地上部分累积Cd的含量；

图10为紫花苜蓿对Cd的去除率；

图11为油菜在含Cd土壤中的生物量；

图12为油菜地上部分累积Cd的含量；

图13为油菜对Cd的去除率。

具体实施方式

实施例1

按照本发明提供的固氮菌株的筛选方法，选育能够耐受重金属镉的固氮酶活性高的固氮菌株，制备的步骤如下：

1）以实验室从植物根际筛选并保藏的土壤杆菌YSGD06作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株YSGD06的单细胞悬液

将出发菌株YSGD06接种于液体培养基A中，28℃，150rpm培养16hrs，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述的培养基A组成为：酵母粉10g， NaCl  5g，蛋白胨10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2。

(2)紫外线诱变 

将步骤（1）所得的菌悬液调节浓度至10⁵个/ml之间，取0.1ml涂布于含600mg/L Cd²⁺无氮固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为18W，照射距离为25cm，照射时间5min；28℃静置培养5days，各挑选25个较大的菌落，进行摇瓶复筛，用乙炔还原法测定各菌株的固氮酶活性，共选择出5株固氮酶活性高且稳定性好的菌株，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的无氮固体培养基B所含组分为：葡萄糖 20g，KH₂PO₄ 0.41g，MgSO₄·7H₂O 0.2g, NaCl 0.2g, CaSO₄·2H₂O 0.2g, CaCO₃ 5g, CdCl₂ 0.32g，琼脂 18g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2；

所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到的50株自生固氮菌接种到100ml 上述的液体培养基A中，培养12hrs。各取5ml 菌液接种到装有100ml液体培养基C的250ml的锥形瓶中，28℃，150rpm摇床振荡培养48hrs后，将棉塞换成橡胶塞，封口膜滴蜡密封，注射器抽取10的空气，注入10的乙炔气体，继续反应，用乙炔还原法测定固氮酶活性；

所述的液体培养基C所含组分为：葡萄糖 20 g， KH₂PO₄ 0.41 g, K₂HPO₄ 0.52g，CaCl₂ 0.2 g,  MgSO₄·7H₂O 0.1 g ，FeSO₄ ·7H₂O 0.005，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025 g, 蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2。

（3）等离子体诱变 

将上述选择的5株固氮酶活性高且稳定性好的菌株，分别制成10⁵个/ml的菌悬液，各取0.1ml均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上下电极之间的距离为3mm，电压为3V，电流为0.5A，利用空气放电，得到均匀的空气介质阻挡放电等离子体，放电时间为3min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于含600mg/L Cd²⁺无氮固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，得到 2株固氮酶活性高且稳定性好的菌株，制成菌悬液用于下一步的诱变。

（4）循环重复紫外线诱变和等离子体诱变1-2次，最后得到一株耐受重金属Cd且固氮酶活性高的菌株YMU6-2。 

图1为Ymu6-2扫描电镜照片，图2为Ymu6-2产生铁离子定性实验照片，图3为Ymu6-2传代稳定性，表1为野生自生固氮菌与诱变菌株固氮酶活性对比。 

实施例2

按照本发明提供的制备固氮菌剂的方法，制备能够耐受重金属镉的固氮酶活性高的固氮菌剂，制备的步骤如下：

菌剂的制备包括以下步骤：

1、菌种发酵

①一级三角瓶液体培养

将冻存的Ymu6-2在37℃条件下快速解冻，按照0.5%的接种量接入装有液体培养A的三角瓶中，28℃150rpm振荡培养18hrs；

培养基A组成为：酵母粉10g， NaCl 5g，蛋白胨10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005 g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2；

②二级发酵罐发酵

1）将Ymu6-2的一级培养液按照5%的接种量接入装有液体培养基E的发酵罐中，进行发酵培养,罐温28-32℃，pH7-8通气培养28 hrs；

所述的培养基E组成为：蔗糖15g，淀粉3g，豆粕30g，KH₂PO₄ 0.41 g, K₂HPO₄ 0.3 g, CaCl₂ 0.2 g, MgSO₄7H₂O 0.2 g ，Na₂MoO₄2H₂O 0.005 g, 水1000ml，p H 7.0~7.2；

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为50：30：20的比例均匀混合，将钼酸钠和硫酸亚铁按照钼酸钠为0.3g/Kg，硫酸亚铁为0.05g/Kg的剂量加入并充分混匀；

3）将步骤1）中得到的Ymu6-2发酵液直接打入储液罐即得液态微生物菌剂，将得到的发酵液按照100ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28℃发酵5days，平板计数法计数固态菌剂中Ymu6-2数量分别可以达到2.5×10⁹和1.2×10¹⁰CFU/g。

实施例3 

使用实施例2菌剂在强化印度芥菜修复镉污染土壤，其具体步骤为：

盆栽土壤采自陕西省长安县农田土壤，供试土壤总Cd含量为0.25mg/kg，土壤设4个投加Cd²⁺ 水平,分别为0，20，40，80mg/kg，把相应量的CdCl₂配成溶液,使得供试土壤与重金属反复混合均匀，静置平衡30d。实验分别设空白对照组、加尿素组和加菌剂组。出苗后,每盆保留3 株.，将上述制备的液体菌剂用水按照1：200的比例稀释，采用根灌的方法每盆浇20ml稀释的菌液，每隔3周浇一次，不加菌的组浇同等剂量的死菌体，加尿素组尿素的浓度是0.12g/L。植株生长50天后收获,分别测定地上部和根的干重, HNO₃-HClO₄ 消化,原子吸收光谱法测定各样品中Cd 浓度.计算不同处理的地上部和根的吸Cd量和各处理的土壤净化率。

如图4-7结果可见，加菌剂和加尿素均能够促进印度芥菜的生长，加菌剂组印度芥菜的干重比对照组增加了13.4-42.7%，而加尿素组比对照组增加了4.2-29.9%；加菌剂和加尿素均能够促进印度芥菜地上部分对Cd²⁺的富集，加菌剂组印度芥菜累积的Cd²⁺量比对照组增加了16.5-33.6%，而加尿素组比对照组仅增加了3.7-13.6%；加菌剂组印度芥菜对土壤中Cd²⁺的去除率比对照组增加了41.7-77.3%，而加尿素组仅比对照组增加了8.06-30.2%。因此，该菌剂能够明显的提高印度芥菜的生物量和对Cd²⁺的富集，加速土壤中Cd²⁺的去除。 

实施例4 

使用本发明提供的固体菌剂用于强化紫花苜蓿修复镉污染土壤，其具体步骤为：

盆栽土壤与实施例3相同，土壤设3个投加Cd²⁺ 水平,分别为0，20，50mg/kg，实验分别设空白对照组和加菌剂组。将固体菌剂与土壤按照10g/kg土壤的用量加入土壤并充分混匀，种植紫花苜蓿，出苗后,每盆保留10 株，植株生长45天后收获,分别测定地上部干重, HNO₃-HClO₄ 消化,原子吸收光谱法测定各样品中Cd 浓度.计算不同处理的地上部的吸Cd量和各处理的土壤净化率。

如图8-10结果可见，加菌剂能够促进紫花苜蓿的生长，加菌剂组紫花苜蓿的干重比对照组增加了14.6-24.4%；菌剂能够促进印度芥菜地上部分对Cd²⁺的富集，加菌剂组紫花苜蓿累积的Cd²⁺量比对照组增加了26.4-51.9%；加菌剂组紫花苜蓿对土壤中Cd²⁺的净化率比对照组增加了54.3-74.2%。 

实施例5 

使用本发明提供的固体菌剂用于强化油菜修复镉污染土壤，其具体步骤为：

盆栽土壤与实施例3相同，土壤设3个投加Cd²⁺ 水平,分别为0、20、50mg/kg，实验分别设空白对照组和加菌剂组。将油菜先在无Cd²⁺土壤中育苗，挑选长势相同的油菜苗用上述1：50的液体菌剂稀释液浸根，对照组用相同剂量的死菌液浸根，在生长三周后再用1：200的液体菌剂稀释液灌根，对照组加入同剂量的死菌剂，其余条件与实施例3相同，植株生长45天后收获，分别测定地上部的干重和各样品中Cd 浓度。

图11-13结果可见，加菌剂能够明显促进油菜的生长，加菌剂油菜的干重比对照组增加了15.1-36.4%；加菌剂能够促进油菜地上部分对Cd²⁺的富集，加菌剂组油菜累积的Cd²⁺量比对照组增加了14.3-41.7%；加菌剂组油菜对土壤中Cd²⁺的净化率比对照组增加了31.6-92.5%。 

Claims (8)

1.一种具有自生固氮能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）Ymu6-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5007。

2.根据权利要求1所述的具有自生固氮能力的土壤杆菌，其特征在于该菌株具有以下特性：Ymu6-2在固体培养基A上菌落呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐，菌落周围有透明圈，G^-，好氧或兼性厌氧，扫描电镜显示呈粗短杆状，其最适的生长温度28~32℃，最适的pH值为6.0~8.0；在固体培养基A上能够耐受400-800mg/l的Cd²⁺生长，在液体培养基A中能够耐受224-448mg/l的Cd²⁺生长，其固氮能力在0.56~0.73nmol·10⁷cfu^-1·h^-1，解无机磷能力为264.5mg/l，产吲哚乙酸的能力为15.25.~30.6μg/ml，产铁载体的能力为0.806~0.402，无ACC脱氨酶活性；

所述的固体培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

3.含有权利要求1所述土壤杆菌的微生物菌剂。

4.权利要求3所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种发酵

①一级三角瓶液体培养

将冻存的Ymu6-2在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量分别接入装有液体培养A的三角瓶中，28-32℃,振荡培养15-20hrs；

培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，p H 7.0~7.2；

②二级发酵罐发酵

1）将Ymu6-2的一级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有液体培养基E的发酵罐中，进行发酵培养,罐温28-32℃，培养pH7-8，通气培养20-30 hrs；

所述的培养基E组成为：蔗糖10-15g，淀粉2-3g，豆粕20-30g，KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g ，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g, 水1000ml，p H 7.0~7.2；

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠粉碎过60目筛，按照质量百分比为50-70:20-30:10-20的比例均匀混合，再加入钼酸钠和硫酸亚铁，其中钼酸钠为0.2~0.5g/Kg，硫酸亚铁为0.05~0.08g/Kg；

3）将步骤1）中得到的Ymu6-2发酵液直接打入储液罐，即得液态高效固氮菌剂，将得到的液态高效固氮菌剂按照50-100ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天即可。

5.权利要求1所述土壤杆菌在土壤重金属污染环境治理中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于重金属为镉离子。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于使用方法为：在植物浸种时以50-100倍的液体菌剂稀释液浸泡种子或植物根部2-5hrs，育苗期或生长期灌根采用100-500倍的液体菌剂稀释液20-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-3次；固态菌剂作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-20g/Kg土壤。

8.权利要求1所述土壤杆菌在土壤生态修复中的应用。

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