CN102703363B

CN102703363B - 一株甲基营养性芽孢杆菌utm401及其应用

Info

Publication number: CN102703363B
Application number: CN 201210226954
Authority: CN
Inventors: 刘永跃; 周顺桂; 许宜北; 汪涌
Original assignee: DADI LVYUAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY (BEIJING) CO LTD
Current assignee: DADI LVYUAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY (BEIJING) CO LTD
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN102703363A

Abstract

本发明提供了一株甲基营养性芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）UTM401及其应用，该菌生物保藏编号为CGMCC No.5927。将本发明菌株UTM401的发酵种子液接种于有机废物物料堆中，进行发酵处理，能够制备生物肥料。使用菌株UTM401制备生物肥料，成本低，质量稳定，能够缩短发酵周期，且在固态物料中再次迅速增菌，与发酵物料载体形成稳定的菌落系统，能够高密度地在植物根际定殖，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物、以及促进植物生长并提高作物产量的作用。本发明菌株UTM401及其发酵有机废物制备的生物肥料绿色环保，无污染，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一株甲基营养性芽孢杆菌UTM401及其应用

技术领域

本发明涉及生物肥料领域，具体地，涉及一种甲基营养性芽孢杆菌菌株UTM401及其制备生物肥料的用途。

背景技术

生物肥料是利用微生物的有关性质，来提供作物生长所需要的氮素养分或提高土壤中难利用矿物态养分的有效性，从而促进作物对养分的吸收和生长，提高其产量和品质。生物肥料在发展生态农业中具有不可替代性。利用有机废物制备生物肥料不仅可以处理有机废物，解决环境问题，还可实现有机废物的资源化利用，是一种公认的、低成本的、资源高效再生利用的有效途径。

目前，市场上的生物肥料要么是由于生产菌种退化、要么是因为生产工艺、载体问题导致有效活菌数不足，致使产品功能无法充分显现，质量得不到保证。而利用有机废物制备生物肥料也存在发酵周期长、受场地限制的问题。生产生物肥料使用的菌种主要是圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌及根际促生细菌芽孢杆菌和假孢菌，基本上没有发酵废物的功能，限制了其作为发酵促进接种剂的应用。

甲基营养性芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）是韩国人Madhaiyan等在2010年新报道的一种可以代谢甲醇、具有ACC脱氨酶活性的植物根际促生菌。专利（申请号201010561580.3）报道了该微生物对植物病原真菌具有拮抗作用的特性，并将其应用于制备可吸性粉剂生物菌剂。但此微生物具有降解淀粉的特性及应用于有机废物发酵处理，并制备作物促生性功能生物肥料至今未见公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有作物促生作用的微生物及其利用有机废物制备生物肥料的方法。

本发明从污泥腐熟堆肥中分离到具有工业化应用前景的菌株，为利用有机废物制备生物肥料提供了一种兼具农作物促生效果及降解有机废物特性的微生物。

本发明从采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间的污泥腐熟堆肥中，利用驯化培养基（牛肉膏3-5g，酵母提取物3-5g，蛋白胨8-10g，氯化钠3-5g，可溶性淀粉8-15g，蒸馏水1000ml）在40℃下，经多代富集驯化、功能筛选后得作物促生菌UTM401菌株。菌株UTM401已于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为Bacillusmethylotrophicus，保藏号为CGMCC No.5927。

本发明提供的UTM401在NA培养基（牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.2）上菌落特征是：形态为圆形，表面干燥，乳白色，脐突状，生长迅速，30-40℃培养36小时菌落直径约3mm，生长温度20-45℃。利用引物引物为（27f）：5′-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3′和（1492r）：5′-GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3′经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM401菌株的该基因与Bacillusmethylotrophicus的相似性最高，为99.72%，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。其次是以上所述菌株的生长特性为鉴别该菌株的次要特征。

本发明提供了一种甲基营养性芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌株UTM401，其保藏编号为CGMCC No.5927。

本发明提供了含有甲基营养性芽孢杆菌UTM401的菌剂。

本发明提供了甲基营养性芽孢杆菌UTM401或其发酵产物或上述菌剂在植物促生中的应用。

本发明提供了甲基营养性芽孢杆菌UTM401或其发酵产物或上述菌剂在制备生物肥料中的应用。

本发明提供应用甲基营养性芽孢杆菌UTM401制备生物肥料的方法，包括以下步骤：

1）制备发酵液：取本发明的甲基营养性芽孢杆菌菌株UTM401的活化菌种接种于液体培养基中，进行三级发酵；

2）将发酵液接种于物料堆混合均匀进行发酵，所述物料堆为畜禽粪便与木薯加工废弃物的混合物；

3）堆温下降至45-50℃时，再次接种发酵液；当堆温降至环境温度后，进行翻堆，控制堆温在环境温度，出料风干后，筛分得到生物肥料。

其中，步骤1）所述的三级发酵为：

a）将甲基营养性芽孢杆菌菌株UTM401接种于液体培养基中，30-40℃，120-180r/min培养，当OD₆₀₀≥1.8时停止培养，得到一级发酵种子液；

b）将一级发酵种子液按体积比5-15%接种于液体培养基中，发酵温度30-40℃，间歇搅拌通风，间隔1h搅拌1次，每次搅拌5-15min，搅拌速度120-160r/min，间隔0.5h通风1次，每次通风5-10min，通气量1:（0.4-0.8），当OD₆₀₀≥2时停止培养，得到二级发酵种子液；

c）将二级发酵种子液按体积比5-10%接种于液体培养基中，发酵温度28-40℃，间歇搅拌通风，间隔1h搅拌1次，每次搅拌10-20min，搅拌速度140-200r/min，间隔0.5h通风1次，每次通风5-15min，通气量1:（0.8-1.2），当OD₆₀₀≥2时停止培养，得到发酵液。

其中，步骤2）所述的发酵液接种至物料堆的方法是：取相当于总物料湿重1%-5%的玉米面或麦麸吸附相当于总物料湿重0.1%-0.5%的发酵液，然后接种至物料堆，混合均匀。

其中，步骤2）所述的畜禽粪便与木薯加工废弃物的混合物的碳氮比为20~30，含水率为50%~60%。

所述的木薯加工废弃物为木薯渣和/或木薯皮。

其中，步骤2）所述发酵液接种物料堆之后保持氧气含量为8%~15%，间隔3~5天翻堆1次。

本发明实施例中使用的培养基为LB培养基。

本发明还提供了上述方法制备得到的生物肥料。

本发明菌株UTM401利用有机物进行代谢制备生物肥料，促进升温，具有起温效果好，生产成本低，质量稳定，缩短发酵周期的优点；当堆肥过程温度下降至45-50℃，再次接种该微生物种子液，继续发酵，制得生物肥料。本发明菌株UTM401能在固态物料中再次迅速增菌，与发酵物料载体形成稳定的菌落系统，能够高密度地在植物根际定殖，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并提高作物产量的作用。本发明菌株UTM401及其发酵有机废物制备的生物肥料绿色环保，无污染，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明菌株UTM401发酵物料堆过程中温度变化图。

图2为本发明菌株UTM401发酵物料堆过程中发芽指数变化图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1甲基营养性芽孢杆菌UTM401的分离与鉴定

称取10g污泥腐熟堆肥样品（采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间）置于装有10粒小玻璃珠的100ml无菌水250ml三角瓶中，于40℃置于恒温摇床上震荡1小时，然后静置30分钟，在超净台中，吸取上清液1ml，转接至装有100ml已灭菌的驯化培养基（牛肉膏3g，酵母提取物3g，蛋白胨8g，氯化钠3g，可溶性淀粉10g，1000ml蒸馏水）中，在恒温摇床上40℃下振荡富集驯化培养3天，转速160r/min。同样方式，再次吸取1ml富集液，在相同条件下，再传代培养3代。

分别取驯化后的菌悬液1mL，加入到9mL无菌水中，以梯度稀释法制成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7的稀释度，取0.1mL平板涂布，每个稀释度涂布于3个淀粉降解鉴定培养基平板上。取1mL的无菌水做上述同样的操作，作为对照处理。在40℃下培养3天，选择菌落分散较好的平板（在一定的稀释度下的平板），挑取降解圈大的单菌落，在鉴定培养基上，反复划线分离纯化3次，通过观察降解圈的大小及有无情况，淘汰降解性能不稳定的菌株，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至LB斜面培养至丰厚，在4℃下保存，备用。

上述鉴定培养基的配方为：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH7.0，琼脂粉15g-20g，曲利苯蓝0.05~0.1g，1000ml蒸馏水；LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH7.2。

以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA序列，引物为（27f）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和（1492r）：5′-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。获得的16S rDNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对，与菌株Bacillus methylotrophicus的相似性最高，同源性为99.72%，结合菌株的生长特征，把该菌株鉴定为Bacillus methylotrophicus，命名为UTM401，并于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为Bacillus methylotrophicus，保藏号为CGMCC No.5927。

实施例2菌株UTM401发酵种子液的制备(1)

将4℃保存的本发明生产菌株UTM401斜面转接至NA培养基平板上，在30℃下培养至丰厚，然后用无菌玻璃刮刀将其全部转接至装有1000ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上37℃，转速160r/min下震荡培养2天，此时OD₆₀₀为2.202，停止培养，此为一级发酵种子液。

将一级发酵种子液按液体培养基体积比的5%，接种至含有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度37℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌5分钟，搅拌速度150r/min，间隔半小时通风1次，每次通风5分钟，通气量1:0.6。培养5天后，检测OD₆₀₀为3.051，停止培养，此为二级发酵种子液。

将二级发酵种子液按液体培养基体积比的10%，接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度37℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌15分钟，搅拌速度180r/min，间隔半小时通风1次，每次通风10分钟，通气量1:1.2。培养6天后，检测OD₆₀₀为3.112，停止培养，此为发酵种子液。

实施例3菌株UTM401发酵种子液的制备(2)

将4℃保存的本发明生产菌株UTM401斜面转接至NA培养基平板上，在30℃下培养至丰厚，然后用无菌玻璃刮刀将其全部转接至装有2000ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上30℃，转速150r/min下震荡培养3天，此时OD₆₀₀为2.084，停止培养，此为一级发酵种子液。

将一级发酵种子液按液体培养基体积比的10%，接种至含有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度30℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌10分钟，搅拌速度120r/min，间隔半小时通风1次，每次通风5分钟，通气量1:0.5。培养5天后，检测OD₆₀₀为3.257，停止培养，此为二级发酵种子液。

将二级发酵种子液按液体培养基体积比的5%，接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度28℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌10分钟，搅拌速度200r/min，间隔半小时通风1次，每次通风5分钟，通气量1:1。培养7天后，检测OD₆₀₀为3.257，停止培养，此为发酵种子液。

实施例4菌株UTM401发酵种子液的制备(3)

将4℃保存的本发明生产菌株UTM401斜面转接至NA培养基平板上，在30℃下培养至丰厚，然后用无菌玻璃刮刀将其全部转接至装有1500ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上40℃，转速150r/min下震荡培养2天，此时OD₆₀₀为1.984，停止培养，此为一级发酵种子液。

将一级发酵种子液按液体培养基体积比的15%，接种至装有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度40℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌5分钟，搅拌速度160r/min，间隔半小时通风1次，每次通风8分钟，通气量1:0.8。培养5天后，检测OD₆₀₀为3.007，停止培养，此为二级发酵种子液。

将二级发酵种子液按液体培养基体积比的10%，接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度40℃，间歇搅拌通风，间隔1小时搅拌1次，每次搅拌20分钟，搅拌速度140r/min，间隔半小时通风1次，每次通风15分钟，通气量1:0.8。培养6天后，检测OD₆₀₀为2.305，停止培养，此为发酵种子液。

实施例5利用菌株UTM401发酵种子液制备生物肥料（1）

取鸡粪与木薯渣，检测其基本性质，结果见表1：

表1

经计算，当鸡粪与木薯渣的物料配比为2:3时，碳氮比为23.5，含水率为55%。取400公斤鸡粪与600公斤木薯渣混合均匀后，再取相当于物料总湿重3%的玉米面30公斤吸附相当于物料总湿重0.3%的实施例2制备的发酵液3升，然后接种至物料堆，混合均匀，于发酵池中进行发酵。

发酵过程中，进行曝气使氧气含量为8%之间，期间每隔3天翻抛一次。当堆温下降至45℃后，再次按上次方法接种发酵液，待温度下降至环境温度后，再次每隔1天翻堆至堆温不再上升后，出料风干后，经筛分得到生物肥料。同时，以等量无菌水代替发酵液进行对照实验。发酵周期为30天。

对发酵过程中，温度和发芽指数的变化如图1、图2所示。图1中接种UTM401处理在堆肥第2天即达到54℃，对照实验则在第4天达到53℃，与对照实验相比，接种UTM401发酵液后，物料起温快、效果好。图2中，接UTM401处理在发酵第20天的发芽指数已达86%，超过80%，已完全无植物毒性，达到腐熟；对照实验则在发酵第30天发芽指数已达85%，达到腐熟；发酵结束后，接UTM401处理比对照实验高13%。说明接种UTM401发酵液后，物料发酵周期缩短，发酵所得的生物肥料的腐熟度提高。

实施例6利用菌株UTM401发酵种子液制备生物肥料（2）

取猪粪与木薯皮，检测其基本性质，结果见表2：

表2

经计算，当猪粪与木薯皮的物料配比为2:1时，碳氮比为22.7，含水率为54%。取400公斤猪粪与200公斤木薯皮混合均匀后，再取相当于物料总湿重5%的麦麸30公斤吸附相当于物料总湿重0.5%的实施例2制备的发酵液3升，然后接种至物料堆，混合均匀，于发酵池中进行发酵。发酵周期为30天。

发酵过程中，进行曝气使氧气含量在12%，期间每隔4天翻抛一次。当堆温下降至45℃后，再次按上次方法接种发酵液，待温度下降至环境温度后，再次每隔1天翻堆至堆温不再上升后，出料风干后，经筛分得到生物肥料。同时，以等量无菌水代替发酵液进行对照实验。

本试验也得到了与实施例5的类似结果：接种UTM401发酵液后，物料发酵周期缩短，发酵所得的生物肥料的腐熟度提高。不同之处在于具体数值上的差别，试验结果见下表：

表3

实施例7利用菌株UTM401发酵种子液制备生物肥料（3）

取牛粪与木薯渣，检测其基本性质，结果见表4：

表4

经计算，当牛粪与木薯渣的物料配比为4:1时，碳氮比为24.1，含水率为56%。取200公斤牛粪与800公斤木薯渣混合均匀后，再取相当于物料总湿重1%的玉米面10公斤吸附相当于物料总湿重0.1%的实施例2制备的发酵液1升，然后接种至物料堆，混合均匀，于发酵池中进行发酵。发酵周期为30天。

发酵过程中，进行曝气使氧气含量为15%之间，期间每隔5天翻抛一次。当堆温下降至45℃后，再次按上次方法接种发酵液，待温度下降至环境温度后，再次每隔1天翻堆至堆温不再上升后，出料风干后，经筛分得到生物肥料。同时，以等量无菌水代替发酵液进行对照实验。

表5

实施例8菌株UTM401发酵种子液制备生物肥料的应用效果

下列以小白菜田间小区试验为例说明本发明生物肥料的应用效果

处理1(施肥1)：施用实施例5制得的生物肥料，于播种前作为基肥一次性施入，使用量200kg/亩，并配合常规70%的施肥量。

处理2(施肥2)：施用实施例6制得的生物肥料，于播种前作为基肥一次性施入，使用量200kg/亩，并配合常规70%的施肥量。

处理3(施肥3)：施用实施例7制得的生物肥料，于播种前作为基肥一次性施入，使用量200kg/亩，并配合常规70%的施肥量。

处理4(基质)：施用生物肥料基质，将生物肥料经高温灭活后得生物肥料基质，操作同处理1。

处理5(常规)：常规施肥，施用尿素（N≥46%）20kg/亩、钙镁磷肥（P₂O₅≥12%）15kg/亩、氯化钾（K₂O≥60%）10kg/亩，全部的钙镁磷肥和氯化钾、50%的尿素于播种前整地时作基肥施用，出苗后的15天和25天作追肥施用20%和30%的尿素，对水淋施。

处理6（空白）：空白对照，不施任何肥料。

3次重复，采用随机区组排列，小区面积20m²。产量数据采用SAS统计软件进行方差分析与LSD多重比较统计分析。

试验结果如表6，小白菜施用本发明实施例5、6、7制得的生物肥料后，平均株高、叶片数和单株重均优于基质、常规和空白处理。施肥1与其他三个处理相比，平均株高增加1.8-2.8cm，叶片数增加0.9-1.3片，单株重增加13.2-17.9g。施肥2与其他三个处理相比，平均株高增加2.9-3.9cm，叶片数增加1.1-1.5片，单株重增加14.0-18.7g。施肥3与其他三个处理相比，平均株高增加1.5-2.5cm，叶片数增加0.6-1.0片，单株重增加12.6-17.3g。

表6不同处理对小白菜综合性状的影响

如表7，小白菜施用本发明实施例5、6、7制得的生物肥料后平均产量分别为2132.7、2211.3、2036.4kg/亩。与另外三个处理相比，施肥1增产199.3～293.4kg/亩，增产率为10.3%～15.9%；施肥2增产277.9～372kg/亩，增产率为14.3%～20.2%；施肥3增产103～197.1kg/亩，增产率为5.3%～10.7%。LSD多重比较统计分析结果表明，施肥处理的生物学产量、净菜重及净菜率均极显著（p＜0.01）高于其他三个处理。

表7不同处理对小白菜产量的影响

以上结果分析表明：施用本发明实施例5、6、7制备的生物肥料能促进小白菜的生长发育，改善小白菜的经济性状，增产效果显著，进一步说明本发明提供的甲基营养性芽孢杆菌UTM401具有植物促生作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.甲基营养性芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌株UTM401，其保藏编号为CGMCC No.5927。

2.含有权利要求1所述甲基营养性芽孢杆菌UTM401的菌剂。

3.权利要求1所述的甲基营养性芽孢杆菌UTM401或权利要求2所述的菌剂在制备生物肥料中的应用。

4.一种制备生物肥料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备发酵液：取权利要求1所述甲基营养性芽孢杆菌菌株UTM401的活化菌种接种于液体培养基中，进行三级发酵；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的三级发酵为：

b）将一级发酵种子液按体积比5-15%接种于液体培养基中，发酵温度30-40℃，间歇搅拌通风，间隔1h搅拌1次，每次搅拌5-15min，搅拌速度120-160r/min，间隔0.5h通风1次，每次通风5-10min，通气量1:0.4-0.8，当OD₆₀₀≥2时停止培养，得到二级发酵种子液；

c）将二级发酵种子液按体积比5-10%接种于液体培养基中，发酵温度28-40℃，间歇搅拌通风，间隔1h搅拌1次，每次搅拌10-20min，搅拌速度140-200r/min，间隔0.5h通风1次，每次通风5-15min，通气量1:0.8-1.2，当OD₆₀₀≥2时停止培养，得到发酵液。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的发酵液接种至物料堆的方法是：取相当于总物料湿重1%-5%的玉米面或麦麸吸附相当于总物料湿重0.1%-0.5%的发酵液，然后接种至物料堆，混合均匀。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的畜禽粪便与木薯加工废弃物的混合物的碳氮比为20~30，含水率为50%~60%。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述发酵液接种物料堆之后保持氧气含量为8%~15%，间隔3~5天翻堆1次。

9.权利要求4~8任一所述方法制备得到的生物肥料。