CN102634487A - Gpc3单克隆抗体杂交瘤细胞株8g6及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6及其制备方法和应用，属于细胞工程技术领域。本发明的GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6，保藏编号为CGMCC No.5427。该杂交瘤细胞株8G6的制备方法为：以GPC3蛋白为免疫原免疫小鼠，取血清效价在1:10⁴以上的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HATRPMI-1640培养基筛选融合细胞，经过ELISA和多次有限稀释法筛选，最后获得杂交瘤细胞株8G6。本发明的GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌抗体产量高，且易存活，所分泌的单克隆抗体效价高，反应灵敏，易于检测，生产成本低，可广泛应用于GPC3蛋白表达的检测。

Description

GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6及其制备方法和应用。

背景技术

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类生命健康，有报道显示，在所有疾病中，肝细胞性肝癌发病率居第五而病死率高居第三。据估计，全世界每年有超过100万新发现的HCC患者，约100万人病死。由于HCC早期症状和体征不明显或缺乏特异性，导致HCC的早期诊断率较低，患者就医时常为中晚期，丧失治疗机会（研究显示，早中期HCC可手术治疗，小肝癌手术切除术后5年生存率大约有62.9%，大肝癌术后5年生存率则仅为34.6%）。同时，由于HCC对放疗和化疗均不大敏感，预后总体较差，外科手术包括肝移植仍是治疗痊愈肝癌的唯一方法。然而，高复发与高转移率导致手术后长期生存率较低，治疗效果不理想。在目前治疗尚无更好治疗策略之际，对高危人群的有效筛选和HCC的早期诊断，是提高生存率、降低病死率的有效途径。而对小肝癌的早期发现和诊断，生物标志物最具优势。目前在肝癌诊断中最为经典和被公认的是甲胎蛋白AFP，但其阳性检测率也仅为30~60%，而且特异性不够，不能满足临床对AFP 阴性肝癌的早期诊断。肝癌的致病机理是一个多因素、多步骤的复杂过程，所以至今仍无一个特异指标能在临床上应用，通过联合检测多种指标可早期发现肝癌的发生、复发和转移，从而进行早期治疗。因此，寻找有效诊断和治疗靶标，已成为HCC研究的重点、难点及方向。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3，GPC3) 是膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胎儿肝脏表达丰富，在成人肝脏不表达，于肝癌发生时常常再激活，是HCC发生发展中的一个重要物质，李慎菁等用Northern 杂交结果显示GPC3 基因在正常肝脏组织中不表达，而在肝癌组织中为高表达，并同肿瘤大小及肝癌病理分级呈正相关，提示GPC3 基因在肝癌发生发展中起重要作用，与肝癌的病变程度有关。这说明该基因有可能是肝癌组织特异性的标志基因，可作为肝癌的临床早期诊断、治疗和判断恶性程度的参考指标，具有一定的临床应用前景。GPC3不但在肿瘤组织中特异性高表达，同时也可在外周血中被检测，Capurro等用ELISA法测得53%肝癌患者血清中存在GPC3的C端片段。而在样本量为53的健康对照组中无一阳性,在样本量为20的肝硬化患者对照组中仅一例阳性,提示GPC3较高的特异性。Nakatsura等用不同的C2端抗体亦取得相似的结果。其量的变化又与HCC病灶的存在与否、病情的严重程度密切关联（可反映手术前后的状态及治疗效果，较AFP敏感）。尤其是GPC3在AFP阴性肝癌中特异性表达，联合检测AFP和GPC3，可显著提高HCC的诊断检测率和准确性，因此被认为是一种极具潜能的新颖肝癌标志物。同时，研究还表明GPC3具有较高的免疫原性，在HCC的发生发展中起着非常重要的作用，有可能成为肝癌靶向治疗的新靶点。

目前可以检测GPG3的抗体产品均为国外一些公司如BioMosaics的产品，价格昂贵，限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能研究方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供GPC3（人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3）单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6。

本发明的另一目的是提供上述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6，分类命名为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6，于2011年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5427，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该细胞株本发明简称为GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6。

由上述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体。

上述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的制备方法，步骤如下：以GPC3蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，取血清效价在1:10⁴以上的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用含20wt%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用GPC3蛋白包被ELISA板，间接ELISA法筛选融合细胞培养上清液，选择效价最高的杂交瘤细胞株进行亚克隆化，用有限稀释法反复克隆至100%细胞阳性率，最后获得GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6。

上述方法中，所述的GPC3蛋白优选为重组蛋白，具体制备方法为：以SEQ ID NO:1~2所示序列为上下游引物，以Huh7(可购于中科院上海细胞库)细胞总RNA反转录的cDNA为模板，PCR法扩增GPC3基因，扩增产物用EcoRⅠ和 SalⅠ进行双酶切，酶切产物与经过同样双酶切的载体PET-11b(可购于Merck Chemicals公司)连接，得到重组载体GPC3/PET-11b，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，表达产物经纯化得到GPC3重组蛋白。

上述方法中，小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合优选用50 wt % PEG-4000。

本发明的GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体在检测GPC3蛋白表达中的应用。如能用于ELISA、时间分辨荧光免疫、化学发光、western-blot、免疫荧光以及组织的免疫组织化学检测等技术领域。

作为一种应用方法，本发明的杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体可以制备成一种GPC3免疫检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌抗体产量高，且易存活，所分泌的单克隆抗体效价高，反应灵敏易于检测，可广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，在肝细胞性肝癌早期检测中具有突出的优势，并且降低了GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3的临床靶标验证及其功能研究。

附图说明

图1. GPC3 N端基因即GPC3 72-369 bp片段扩增产物电泳结果及重组载体GPC3/PET-11b双酶切鉴定结果，其中1为GPC3基因片段的PCR结果，2为marker, DL2000，3为GPC3/PET-11b双酶切结果，4为GPC3/PET-11b重组质粒。

图2.GPC3重组蛋白IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳（12%）结果，其中m: marker，1和3：GPC3/PET-11b/Rosetta诱导前；2和4：GPC3/PET-11b/Rosetta1诱导后。

图3. GPC3重组蛋白菌体超声后的SDS-PAGE电泳（12%）结果。1，3：GPC3/PET-11b/Rosetta超声上清；2，4：GPC3/PET-11b/Rosetta1超声沉淀。

图4. GPC3重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳（12%）结果。其中M：marker；1，2：纯化蛋白。

图5. 本发明单抗8G6对肝癌细胞Huh7免疫荧光染色的结果以及普通光镜下的对照结果（显微镜放大倍数200倍）。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步解释本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不对本发明的保护范围进行任何形式的限制，在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1 制备GPC3重组蛋白

1. GPC3/PET-11b重组载体的构建

根据GenBank中提供的人GPC3mRNA（NM_001164619）序列，去除 N 末端信号肽，针对序列的第72-369碱基设计一对引物，上游引物：5' TAATGAATTCATGCAGCCCCCGCCGCC 3'（SEQ ID NO:1）下游引物：5' AGCGGTCGACTCACTTGGCATGGCGAACAACAA 3'（SEQ ID NO:2）。在两个引物的5'端分别引入 EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，用常规 PCR 方法以Huh7（购自中科院上海细胞库）细胞总RNA反转录的cDNA为模板调取GPC3 N端基因，琼脂糖凝胶电泳显示，成功获得了GPC3 N端基因，片段长度与预期一致（图1）。

原核表达载体PET-11b（购自Merck Chemicals公司）以及经琼脂糖凝胶纯化后的GPC3基因片段，用 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切处理，酶切产物经纯化后连接，得到重组质粒 GPC3/PET-11b，重组质粒经双酶切鉴定（图1），同时将重组质粒送公司测序，测序结果表明重组的GPC3片段与设计序列完全一致。

2. GPC3重组蛋白的表达 

将重组质粒GPC3/PET-11b转化大肠杆菌，GPC3/PET-11b的重组表达菌在含100 μg/mL氨节青霉素的LB培养基中培养，A600达到0.6 左右时，加入终浓度 1 mmol/L的IPTG，于37℃诱导3 h，诱导后的菌液于4℃、8000 rpm离心10 min，收集菌体，结合缓冲液（Binding Buffer）洗涤一次，湿菌沉淀用结合缓冲液重悬，置于冰浴中，超声破菌后12000 rpm 离心20 min，上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE电泳，结果显示，表达的融合蛋白分子量约为25 KDa（见图2的2和4），为包涵体表达（图3），该融合蛋白即为GPC3重组蛋白。

3. GPC3重组蛋白的纯化和定量

收集诱导后的细菌，PBS洗涤一次，湿菌沉淀用8mol/L尿素的结合缓冲液振荡洗涤，12000 rpm离心20 min，上清为待纯化的蛋白样品。

将His6-Ni Superflow Resin 填料（购自 clonetech 公司）装于纯化柱中，将纯化柱与 Akta 纯化仪连接，用平衡缓冲液（按照产品说明书提供的方法配制）平衡5个柱体积，待纯化的蛋白样品以1. 5 mL/min 的速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用蛋白洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白峰，洗脱液在含 6 mol、4 mol、2 mol、1 mol、0 mol尿素的 结合缓冲液中4 ℃梯度透析。SDS-PAGE 电泳分析显示，GPC3重组蛋白经 His 亲和纯化后，在分子量 25 kDa 左右有单一条带（见图4），与预期值相符，Bradford 法测定蛋白浓度为 0.12 mg/mL。

实施例2 鼠抗人GPC3单克隆抗体的制备

1. 杂交瘤细胞株的建立

（1）小鼠免疫

取纯化的GPC3重组蛋白与250 μL Bentonite佐剂混合，以100 μg /500 μL的量腹部皮下多点注射 BALB/c小鼠，间隔三周以100 μg /500μL的量腹部皮下多点注射 BALB/c小鼠，从第三次免疫开始，每次免疫后的第二周尾静脉采集小鼠血，间接 ELISA 方法检测血清效价达到1:50000以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强免疫一次，抗原剂量100 μg。

（2）免疫血清效价测定

采用间接 ELISA法测定免疫血清效价。取30 μgGPC3重组蛋白溶解于10 mL 0.05 M pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μL/孔，4 ℃过夜。次日，使用PBS（含有0.1% (V/V) Tween-20）洗板三次，用10 mM PBS含10％新生牛血清封闭液200 μL/孔，37 ℃封闭1 h，使用PBS（含有0.1% (V/V) Tween-20）洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天尾静脉采血，鼠免疫血清用含2％新生牛血清 10 mM PBS以10^-1～10^-8倍稀释，加入96孔板，100 μL/孔 37 ℃ 1 h，PBS（含有0.1% (V/V) Tween-20）洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（Sigma,INC.），100 μL/孔37 ℃1 h，同上洗板后，TMB显色，100 μL/孔，室温避光20 min，加50 μL/孔2M H₂SO₂终止反应，测450 nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

（3）杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁴的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只100 μg/500 μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP20按10：1的比例混合，500×g室温离心5 min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37 ℃水浴中，将在37 ℃水浴保温的50%聚乙二醇（PEG，MW4000，Sigma公司）用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1 min内滴完，滴完后静置2 min，每隔1分钟加入37 ℃ 预热的无血清1640培养基1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和10 mL来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500×g室温离心5 min，弃上清，加入HAT培养液（次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）（HAT，Sigma公司））轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200 μL。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换HT培养液（次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）（HT，Sigma公司））培养三天，通过间接 ELISA 方法筛选出能与GPC3重组蛋白反应的杂交瘤细胞（以与阴性血清 A 450的比值大于 2.1 判为阳性），更换1640完全培养基。

（4）筛选分泌抗人GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2~3次，直至到100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗GPC3单克隆抗体细胞株13株。应用时间分辨的方法进行配对抗体筛选，杂交瘤细胞株8G6抗体反应荧光值最高，将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。

（5）腹水的制备和纯化

将杂交瘤细胞株8G6以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8~10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察6~7天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。7~10 天后采集小鼠腹水，12000 rpm，离心10 min 收集上清，用 ProteinGharose（购自GE公司）进行纯化：将 ProteinG 填料装于纯化柱中，将纯化柱与 Akta 纯化仪连接，用平衡缓冲液（按照说明书提供的方法配制）平衡5个柱体积，待纯化的腹水用平衡缓冲液稀释10 倍后以1.5 mL/min速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集抗体峰，洗脱的抗体立即用 Tris-HCl ( pH9.0）中和。Bradford 法测定抗体浓度。纯化抗体于-20℃ 保存。

（6）单克隆抗体的特性鉴定

抗体的免疫荧光鉴定：GPC3表达阳性的肝癌细胞Huh7(购自中科院上海细胞库)培养一段时间后，胰酶消化后收集细胞，铺于玻璃片上生长过夜，PBS洗涤细胞，使用预冷的多聚甲醛固定细胞，分别加入杂交瘤细胞株8G6制备的抗GPC3单克隆抗体8G6（1:10稀释），37℃孵育1h，以PBS为阴性对照。PBS洗片后1:1000加入荧光标记羊抗鼠二抗（Sigma公司），37℃孵育1h，PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗GPC3单克隆抗体8G6染色的细胞均观察到绿色荧光，如图5所示。结果证明杂交瘤细胞8G6制备的抗GPC3单克隆抗体8G6可识别天然的人GPC3蛋白。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南方医科大学

 

<120>  GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

taatgaattc atgcagcccc cgccgcc                                         27

 

 

<210>  2

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agcggtcgac tcacttggca tggcgaacaa caa                                  33

 

 

Claims (7)

1.GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6，于2011年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5427。

2.权利要求1所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的制备方法，其特征在于步骤如下：以GPC3蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，取血清效价在1:10⁴以上的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用含20wt%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用GPC3蛋白包被ELISA板，间接ELISA法筛选融合细胞培养上清液，选择效价最高的杂交瘤细胞株进行亚克隆化，有限稀释法反复克隆至100%细胞阳性率，最后获得GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6。

4.根据权利要求3所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的制备方法，其特征在于所述GPC3蛋白为重组蛋白，具体制备方法为：以SEQ ID NO:1~2所示序列为上下游引物，以Huh7细胞总RNA反转录的cDNA为模板，PCR法扩增GPC3基因，扩增产物用EcoRⅠ和 SalⅠ进行双酶切，酶切产物与经过同样双酶切的载体PET-11b连接，得到重组载体GPC3/PET-11b，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，表达产物经纯化得到GPC3重组蛋白。

5.根据权利要求3所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6的制备方法，其特征在于小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合用50 wt % PEG-4000。

6.权利要求2所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体在检测GPC3蛋白表达中的应用。

7.一种GPC3免疫检测试剂盒，其特征在于包括权利要求2所述GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株8G6分泌的单克隆抗体。

Images