CN102578402B - 一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法，涉及一种鲍的养殖活菌制剂。肠道益生菌粉由益生菌干粉、琼脂粉和饲料组成。分别将鲍肠道中分离的海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440，经培养基活化后接种于发酵培养基中振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×10⁹cfu/ml；将各菌种发酵液混合后离心弃上清，菌体沉淀洗涤离心灭菌得菌泥；配制干粉保护剂；将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后，将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉；将益生菌干粉、琼脂粉和饲料混合，制成用于鲍养殖的肠道益生菌粉。

Description

一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鲍的养殖活菌制剂，尤其是涉及一种主要用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法。

背景技术

我国鲍养殖始于20世纪70年代后期，目前已成为世界第一鲍鱼养殖大国，年产值达40多亿元，成为我国海水养殖产业的重要组成部分。然而，伴随着养殖业的快速发展，集约化程度的提高以及沿海水质的日益恶化，鲍暴发性病害日益增多，特别是2000年以来，以养成阶段的季节转换期暴发性死亡最为严重，在养鲍场密集的区域发病率高达90％以上，造成了惨重的经济损失。同时抗生素滥用造成生物的抗药性，并引发了一系列环境和社会问题，使一度蓬勃发展的鲍养殖业陷入低谷，已成为制约养殖业发展的重要因素之一。鲍肠道益生菌可以针对养殖鲍过程中常见的肠胃病、细菌滋扰、不明原因产生的死亡及零星死亡，替代因抗生素引起的应激反应，在促进鲍鱼生长，防治病害方面发挥重要作用。且由于益生菌具有无毒、无残留、不产生抗药性等特点，对促进鲍健康养殖具有重要意义。

益生菌是一类活菌制剂，通过与病原菌竞争化学物质和黏附位点，产生拈抗物质或提供宿主必要营养物质或酶，或调节并激活宿主免疫防御体系，或改善宿主肠道营养与菌群平衡从而对宿主产生有益的生理作用(Verschuere L et al，Microbiol Mol Biol Rev.2000，64：655-671)。目前，利用益生菌来调节动物肠道微生态平衡，恢复机体正常生理功能、防治病害、促进生长，已逐渐成为世界范围内的热潮。

1986年，Kozasa等(Microbial Aliment Nutr，1986，164：351-358)首次利用芽抱杆菌(Bacillustoyoi)处理日本鳗鲡降低了由于感染爱德华氏菌而引起的死亡后，益生菌在水产研究方面得到迅速发展。但纵观水产生物益生菌方面的研究报道，仍主要集中在鱼类、甲壳类和双壳类，而针对腹足类鲍的益生菌相对较少。

目前，针对鲍养殖的益生菌及其制备存在以下几个问题：

(1)多利用其它水生动物或水体中分离得到的益生菌应用于鲍养殖中，而微生物具有宿主特异性及环境易感性，因此缺乏针对性和稳定性而无法产生良好的效果。

(2)筛选范围有限，如集中在养殖环境，或直接应用已报道的海洋细菌等，使益生菌菌种较为单一，它们在完全替代抗生素的过程中抗菌抗病毒效果并不理想。

(3)由于宿主消化道酸性环境的灭活及消化酶的降解作用，大部分益生菌不能以活菌状态到达肠道，或在肠道粘膜上定植，发挥有效的益生作用。

(4)目前，水产生物养殖用的活菌制剂多为胶囊或液体或菌体干粉形式，应用方式多直接投喂，或与饲料混合进行投喂。但存在鲍鱼拒食、益生菌无法与饲料粘合不能进入宿主体内发挥作用、益生菌外流至水体，使微生物数量激增造成养殖环境污染等问题。

发明内容

本发明目的在于针对现有养殖鲍益生菌应用中存在的问题及不足，提供一种能够有效、直接进入鲍肠道并发挥益生作用的用于鲍养殖的肠道益生菌粉。

本发明的另一目的在于提供一种具有操作简单、效果稳定、针对性强、不污染养殖环境等优点的用于鲍养殖的肠道益生菌粉的制备方法。

所述用于鲍养殖的肠道益生菌粉按质量比的组成如下：益生菌干粉∶琼脂粉∶饲料为(0.1～1)∶(1～20)∶(5～150)。

所述饲料可选自鲍饲料，所述饲料可选自大统牌、金牌、洪峰牌等鲍用饲料。

所述用于鲍养殖的肠道益生菌粉的制备方法包括以下步骤：

1)分别将鲍肠道中分离的海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillusstratosphericus A3440，经培养基活化后，接种于发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×10⁹cfu/ml；

2)将各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，灭菌，得菌泥；

3)配制干粉保护剂；

4)将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后，将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉；

5)将益生菌干粉、琼脂粉和饲料混合，制成用于鲍养殖的肠道益生菌粉。

在步骤1)中，所述海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5254；所述芽孢杆菌Bacillusstratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述培养基可采用2216E固体培养基等；所述发酵培养基可采用2216E液体发酵培养基等；所述振荡培养的条件可为在28℃下振荡培养1～3天。

在步骤2)中，所述洗涤可用生理盐水洗涤2～3遍。

在步骤3)中，所述干粉保护剂的组成按质量百分比可为：蔗糖1.0％～10.0％，褐藻酸钠0.1％～5.0％，加水定容至100ml；所述灭菌的条件可为115℃，30min灭菌后，冷却至30～35℃。

在步骤4)中，所述干粉保护剂和菌泥的配比可为干粉保护剂∶菌泥＝(1～10)ml∶1g，其中干粉保护剂按体积计算，菌泥按质量计算；所述成膜反应可将干粉保护剂和菌泥混合放置10～30min后再进行成膜反应；所述预冻的条件可为预冻于-70℃，3～4h。

在步骤5)中，所述用于鲍养殖的肠道益生菌粉按质量比的组成如下：益生菌干粉、琼脂粉、饲料的质量比为(0.1～1)∶(1～20)∶(5～150)；所述饲料可选自鲍饲料，所述饲料可选自大统牌、金牌、洪峰牌等鲍用饲料。

使用时，将用于鲍养殖的肠道益生菌粉用水溶解，益生菌粉与水的比例可为5～30g∶100ml，冷却后凝固成胶体，即可。

本发明的突出优点是：

1)选自鲍消化道分离的微生物作为肠道益生菌的来源，具有较高的针对性和稳定性，并能有效促进鲍的生长，与投喂常规饲料比较，鲍的生长率可提高19.92％～25.55％。

2)与现有保护剂比较，本发明中的干粉保护剂(蔗糖与褐藻酸钠)的添加能有效减少菌株在制备、运输过程中数量减少，菌体流失等问题，与多种菌体保护剂相比的实验结果见表1。

表1不同保护剂下益生菌24h后活菌浓度

3)本发明所制备的用于鲍养殖的肠道益生菌粉的投喂不会因菌体的流失造成对养殖环境二次污染，同时也保证鲍进食过程中，益生菌能以饲料为媒介有效进入宿主肠道发挥作用。实验中不同含量的益生菌干粉与饲料及粘合剂琼脂粉结合，充气水体中浸泡24h，结果表明，水体中未检测出海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440，说明益生菌的包埋、粘合有效。

4)本发明使用方法简单，对操作者的经验要求不高，便于鲍水产养殖中的应用。

5)本发明采用鲍肠道微生物作为益生菌来源，克服了针对性不强，易被肠道内容物降解的问题。

6)添加粘合剂，有利于益生菌干粉与饲料能有效结合，使益生菌能顺利进入宿主肠道。同时，进一步防止菌体外流至水体造成养殖环境污染。

本发明针对水产养殖鲍，利用其肠道益生菌，添加保护剂后制成干粉，与适口性好的饲料混合，并添加粘合剂，复合出含有高浓度肠道益生菌的饲料，真正摆脱菌种结构单一，针对性不强，稳定性差，应用效果不明显，易造成养殖环境二次污染的困境。具有方便快捷、效果稳定、经济实用的特点。

具体实施方式

实施例1

以2m²养殖池，养殖500个成鲍(壳长4～5cm)，需添加约100g益生菌粉/天为例。

1)将海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440，经2216E固体培养基活化后，分别接种于100ml 2216E液体发酵培养基中，在28℃下振荡培养1～3天，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×10⁹cfu/ml；

2)将菌种发酵液混合后，离心，弃上清，菌体沉淀用生理盐水洗涤2～3遍，离心，得菌泥1～2g；

3)配制干粉保护剂，需蔗糖5.0g，褐藻酸钠2.0g，用水定容至100ml，混匀，115℃，30min灭菌，冷却至30～35℃备用；

4)在菌泥中添加2ml干粉保护剂，搅拌均匀后，放置10～30min进行成膜反应。然后，混合物预冻于-70℃，3～4hr，采用冷冻干燥技术进行冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉，约0.6g干粉；

5)将鲍肠道益生菌干粉0.6g，琼脂粉6g，人工饲料93.4g按比例配制，混合均匀后，制成益生菌粉，益生菌总数达到1.0×10¹⁰～1.0×10¹¹cfu；

6)将上述配制的益生菌粉用500ml温热的(35～40℃)池水或天然海水或经过细沙过滤处理的海水溶解，完全混匀搅拌，待其冷却凝固后，投喂鲍鱼。

7)与未添加益生菌粉的鲍饲料比较，益生菌粉的添加能促进成鲍生长，90天后生长率提高达19.92％，实验结果见表2。

表2鲍肠道益生菌粉对杂色鲍成鲍的促生效果

实施例2

以2m²养殖池，养殖2000个幼鲍(1.5～3cm)，需添加50g益生菌粉/天为例。

1)将海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440，经2216E固体培养基活化后，分别接种于100ml液体发酵培养基中，在28℃下振荡培养1～3天，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×10⁹cfu/ml；

2)将菌种发酵液混合后，离心，弃上清，菌体沉淀用生理盐水洗涤2～3遍，离心，得菌泥1～2g；

3)配制干粉保护剂，需蔗糖5.0g，褐藻酸钠2.0g，用水定容至100ml，混匀，115℃，30min灭菌，冷却至30～35℃备用；

4)在菌泥中添加2ml干粉保护剂，搅拌均匀后，放置10～30min进行成膜反应。然后，混合物预冻于-70℃，3～4hr，采用冷冻干燥技术进行冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉，约0.6g干粉；

5)将鲍肠道益生菌干粉0.3g，琼脂粉5g，人工饲料44.7g按比例配制，混合均匀后，制成益生菌粉，益生菌总数达到1.0×10¹⁰～1.0×10¹¹cfu；

6)将上述配制的益生菌粉用350ml温热的(35～40℃)池水或天然海水或经过细沙过滤处理的海水溶解，完全混匀搅拌，待其冷却凝固后，投喂幼鲍。

7)与未添加益生菌粉的鲍饲料比较，益生菌粉的添加能促进幼鲍生长，90天后生长率提高达25.55％，实验结果见表3。

表3鲍肠道益生菌对杂色鲍幼鲍的促生效果

Claims (6)

1.一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于按质量比的组成如下：益生菌干粉∶琼脂粉∶饲料为（0.1～1）∶（1～20）∶（5～150）；

所述一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉的制备方法包括以下步骤：

1）分别将鲍肠道中分离的海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢杆菌Bacillusstratosphericus A3440，经培养基活化后，接种于等体积的发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×10⁹cfu/ml；所述海洋细菌Phaeobacter sp.AP1220已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5254；所述芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述培养基采用2216E固体培养基；所述发酵培养基采用2216E液体发酵培养基；

2）将各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，得菌泥；

3）配制干粉保护剂；所述干粉保护剂的组成按质量百分比为：蔗糖1.0%～10.0%，褐藻酸钠0.1%～5.0%，加水定容至100ml；灭菌的条件为115℃，30min灭菌后，冷却至30～35℃；

4）将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后，将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉；所述干粉保护剂和菌泥的配比为干粉保护剂∶菌泥=（1～10）ml∶1g，其中干粉保护剂按体积计算，菌泥按质量计算；

5）将益生菌干粉、琼脂粉和饲料混合，制成用于鲍养殖的肠道益生菌粉。

2.如权利要求1所述的一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于所述饲料选自鲍饲料。

3.如权利要求1所述的一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于在步骤1）中，所述振荡培养的条件为在28℃下振荡培养1～3天。

4.如权利要求1所述的一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于在步骤2）中，所述洗涤是用生理盐水洗涤2～3遍。

5.如权利要求1所述的一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于在步骤4）中，所述成膜反应是将干粉保护剂和菌泥混合放置10～30min后再进行成膜反应。

6.如权利要求1所述的一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉，其特征在于在步骤4）中，所述预冻的条件为预冻于-70℃，3～4h。