CN102453720B - 一种在猪肌肉组织高效表达的融合启动子 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程应用领域。从大白猪中克隆了MSTN基因上游6个不同启动子缺失片段，它们分别为MSTN-P1、MSTN-P2、MSTN-P3、MSTN-P4、MSTN-P5、MSTN-P6。将这些片段构建至pGL3-Basic载体中后确定它们的活性，MSTN-P2活性相对较强，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。通过在该片段中加入SV40增强子片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，构建融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。通过转染肌源性细胞及非肌源性细胞发现该启动子片段的活性大大增强。本发明公开了该融合启动子的构建过程，从而为构建肌肉特异的转基因动物或诱导外源基因在肌肉组织中高效表达提供了新的遗传资源。

Description

一种在猪肌肉组织高效表达的融合启动子

技术领域

本发明属于动物基因工程应用和分子生物学技术领域，具体涉及一个猪MSTN基因启动子的区域的扩增和对其活性的鉴定，并对该序列进行改造从而提供它的转录活性，但又不破坏它的肌肉特异性。 

背景技术

动物的生长发育是各种功能性基因在不同时间和空间有序表达并发挥功能的结果。基因的表达调控受到内外因素的调节，如外源物质对生长发育的影响、动物生长发育本身等。这些因素都可对个体的基因表达产生调节作用。而对于基因调控又可分为转录前调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控及蛋白水平调控等。转录水平调控是基因表达调控中比较重要的一个调控环节，它是受多种顺式和反式作用元件的相互协调起作用的。 

启动子是重要的顺式作用元件，是一段位于基因的5端的DNA序列，该序列可被RNA酶识别并结合启动基因转录。在该段序列中存在一些特定的转录因子结合序列，这些序列可决定基因的表达频率和表达特异性。启动子一般可分为三类：1、组成型启动子，该类启动子的表达不受时空的限制；2、诱导型启动子，即基因的表达受到某些诱导剂的作用才表达；3、组织特异性启动子，即该类启动子调控的基因表达具有一定的组织特异性。真核生物基因启动子具有一些典型的核心结构(Core promoter)，大约在转录起始位点-40-+50之间，在该区域一般有一些特定的元件如TATA box，该元件可与TBP(TATA-box-binding protein)结合调控下游基因的转录。随着研究的深入，人们发现在基因启动子上游区域还存在另一类重要的序列-增强子。该序列可增强基因的转录，提高转录效率。增强子可在基因的上游区、下游区或基因内起作用。该序列首先发现于SV40(猴空泡病毒40)中，由两个正向重复序列组成，每个长72bp，该序列可有效的提高基因启动子活性，增强基因的表达。 

利用组织特异性启动子和诱导型启动子，可以诱导某些蛋白在特定的部位和在特定的诱导条件下调控蛋白的表达。在植物中，人们将组织和时期特异的启动子利用到生产中取得了可喜的成果。如转基因果树、番茄等(McGranahan GH et al.，1998；Penarrubia L et al.，1992)。相对于植物而言，通过分离动物组织和时空特异启动子并将其利用到转基因动物中则相对滞后一些，这主要是由于现有的转基因效率低下且动物成本昂贵等因素的影响，但其应用具有较大的诱惑力和广阔的前景。如利用乳腺特异的启动子指导药用蛋白在乳腺中超表达，可使基因工程药物产业化。一些学者也在进行积极的尝试，如黄赞等成功利用山羊的β-酪蛋白基因的启动子指导人凝血因子IX在转基因小鼠乳汁中高效表达(黄赞等，2002)。 

肌肉生长抑制因子(Myostatin，MSTN)是TGF-β超家族中的一员，主要在骨骼肌中表达，可抑制肌肉生长(McPherron，1997；Thomas，Langley et al.2000)。MSTN基因的启动子在其它物种中研究比较透彻，该基因的启动子可被Myod等肌肉特异的转录因子调节(Spiller et al.，2002)。猪的MSTN部分启动子序列在1998年已提交至NCBI，该序列上有大量的E-box，而E-box可结合肌肉特异的转录因子如MyoD、Myf5、myogenin、MRF4等，这些转录因子可增强它的表达，但作者并未对其生物活性进行验证(Stinckens etal.，2008)。因此有必要对该基因的启动子功能进行进一步的验证。 

养猪历史悠久，长期的驯化过程中形成了许多适合本地的地方品种，如梅山猪、藏猪、通城猪、清平猪。中国本地猪产仔数多、肉质优良但同时存在生长速度慢的特点，不适宜大规模的生产。国外品种如大 白、长白猪、杜洛克等则具有生长速度快等优点。这些品种的引进极大地提高了养猪业的集约化水平，但生产出的肉质较差。随着生活水平的提高，人们对肉质的要求越来越高，传统的育种方式已不能满足人们的需求。随着分子生物学的发展，人们通过转基因技术利用组织或肌肉特异的启动子诱导特定基因的表达，可以将一些提高肉品质的风味物质等让其在肌肉部位高表达，从而提高肉品质以解决传统育种方式的不足。但如今可用于转基因的启动子数量和种类非常有限，主要有巨细胞病毒(CMV)、SV40、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人单纯疱疹病毒(HSV)和乙型肝炎病毒(HBV)等组成型启动子，它们并没有时空或组织特异性，利用它们作为转基因动物中指导蛋白表达的启动子，容易导致某些蛋白过量表达。在哺乳动物中报道的组织特异性启动子主要集中在动物乳腺组织中，如β-乳球蛋白(BLG)、酪蛋白基因和乳清酸蛋白(WAP)等(樊宝良等，2005；崔奎青等，2005；Hennighausen等，1992；Whitelaw等，2000)，但肌肉组织特异的启动子报道较少，能用于转基因猪制备且拥有自主知识产权的高效表达的肌肉组织特异启动子也比较少，大大限制了转基因动物的发展，因此，获得组织特异性且表达效率较高的启动子成为急需解决的问题。因此本发明旨在构建获得适合在肌肉组织中高效表达的启动子。在鼠中研究表明Myostatin(MSTN)基因主要在肌肉组织中表达(McPherron，1997)，申请人初步将MSTN启动子作为候选基因的启动子进行改造，以获得适合肌肉组织且高效表达的启动子，以期以后对该启动子进行有效应用。 

发明内容

本发明的目的在于构建在猪肌肉组织中高效表达的启动子，并对获得的启动子进行功能性验证，弄清它的表达调控，克服目前在肌肉组织中特异高效表达启动子数量较少的不足。 

本发明的技术方案如下所示： 

申请人通过克隆方法，从大白猪基因组中克隆得到一个猪肌肉组织特异性表达的融合启动子MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 

该启动子MSTNp2-EnhancerNX，通过如下步骤获得： 

1)根据猪MSTN基因AY208121序列数据，设计引物MSTNPF和MSTNPR，扩增获得1709bp的启动子片段MSTNp，然后重新设计7条引物：MSTNPF1、MSTNPF2、MSTNPF3、MSTNPF4、MSTNPF5、MSTNPF6和MSTNPR1，将所述的引物的前6条引物分别与第7条引物配对，得到6个引物对；以启动子片段MSTNp为模板，扩增获得6段带有Kpn I和Nhe I酶切位点的DNA片段：MSTNp1、MSTNp2、MSTNp3、MSTNp4、MSTNp5和MSTNp6，将上述扩增的6个DNA片段连接至pGEM-Teasy载体中； 

2)以pGL3-Basic载体为材料，切除该载体中的Kpn I和Nhe I酶切位点之间的序列，同时切割步骤1)所述的6个带有Kpn I和Nhe I酶切位点的DNA片段连接至pGEM-Teasy载体中的Kpn I和Nhe I酶切位点之间的序列，将被切割的6个片段定向插入pGL3-Basic载体的Kpn I和Nhe I酶切后的片段中，构建得到如下载体：pGL3-MSTNP1，pGL3-MSTNP2，pGL3-MSTNP3，pGL3-MSTNP4，pGL3-MSTNP5和pGL3-MSTNP6； 

3)将步骤2)的6个载体分别转染C2C12细胞及肌管中，验证其活性，得到中间载体pGL3-MSTNp2； 

4)以载体pEGFP-N1为模板扩增获得带Nhe I和Xho I酶切位点的SV40的DNA片段EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，将所述的DNA片段EnhancerNX连接至载体pGEM-Teasy中，得到载体pGEM-Teasy-EnhancerNX； 

5)用Nhe I和Xho I内切酶酶切中间载体pGL3-MSTNP2Nhe I和Xho I之间的序列和载体 pGEM-Teasy-EnhancerNX，将DNA片段EnhancerNX定向插入到中间载体pGL3-MSTNP2的Nhe I和Xho I之间，得到融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，该载体的KpnI和Xho I酶切位点之间的序列即为融合启动子MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示； 

其中：步骤1)所述的引物及DNA片段的核苷酸序列如下所示： 

MSTNPF：TTCAGGGCATCTGGTTTGTGTCT； 

MSTNPR：GGGACCAGCAACAATCAGCA； 

MSTNPF1：GGGGTACCCAGGGCATCTGGTTTGTG； 

MSTNPF2：GGGGTACCTTCCCCAAAAGGAGTAGG； 

MSTNPF3：GGGGTACCTGCAACTTTAGGATAGGA； 

MSTNPF4：GGGGTACCTTTAGTCAGGAAAACAAG； 

MSTNPF5：GGGGTACCTTAAGTATGAAGTGTAAAAG； 

MSTNPF6：GGGGTACCTGGAGCAAGAGCCAATCA； 

MSTNP： 

TTCAGGGCATCTGGTTTGTGTCTGTTTTTCCTTAATCTTTAATGATGAGCAAGTCTAATGCATTATGTAAGGCCATTTTTCTCAAGTGATGTAGATACCTCCTAAGAATTTGATGAAAATGCATTAACTTTTCAGGCTACTGAGTTGCATTTTAGTGCACTGAGGCAGTAAATGAGTGTACAATGTGCAAAAGTAGTGACCTAAAAAATAAATATTTGATATGAACCACTGCATTCTCTTGGAAAAAAAAAAAGTAATGGATTAACTCTCTTAGGAGTCCTTAGCTTCCCCAAAAGGAGTAGGAAGAATAAATCTCCTGTGGCCTGGAAACAGCTTCTGTTTCTCACTGGCTATGTTTGTTTAGCTCTTTAATAGTTCATTTGATTAGATCTTGTGGCTCCTAAAGCTAAGGTTGAGAGTTTGAGCTCTACAGAGGCCACTTAAATTTAGAGAACAAAAAGCTCTATTCTCTGCTCCCAGACCTTACCCCAAATCCCTGCCAGGTGTCTGCCCTCTGGTCAAATGAGAAACTGGCAAAGGGGTGCAAACCTAGCACAGAATTGGGAAACAGAAAAATGGGCACCCTTTATTATGGTGCTCCTTCTCTTTTATGTGTTTACAATACTTGGGCATAATTTACAGAGAATAGATACTACATTTTTTACTTTCACCACTGGAAATCTGAGGCAAACTGCATTATCAGTCATAAAATTCATTATCTTTCTATTCTAAGTTATTCTAAGCTTATTCTAAGCTCAGATAGCTGACATTATCCTCTTGGTAATAAACAATGAAAAAACACATCTTCTGAGCAATATTAATCTGCAACTTTAGGATAGGAGAAAATCAGTTGAAAACTGAGCACGATTTTCACGTGAATAAAAGATATTATTTAAAAATAATTCCATGTGTAATATAACAGAATAAGTATGATTTTCATTATGTACTAGAAATTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAA GCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTCCC 

MSTNP1： 

CAGGGCATCTGGTTTGTGTCTGTTTTTCCTTAATCTTTAATGATGAGCAAGTCTAATGCATTATGTAAGGCCATTTTTCTCAAGTGATGTAGATACCTCCTAAGAATTTGATGAAAATGCATTAACTTTTCAGGCTACTGAGTTGCATTTTAGTGCACTGAGGCAGTAAATGAGTGTACAATGTGCAAAAGTAGTGACCTAAAAAATAAATATTTGATATGAACCACTGCATTCTCTTGGAAAAAAAAAAAGTAATGGATTAACTCTCTTAGGAGTCCTTAGCTTCCCCAAAAGGAGTAGGAAGAATAAATCTCCTGTGGCCTGGAAACAGCTTCTGTTTCTCACTGGCTATGTTTGTTTAGCTCTTTAATAGTTCATTTGATTAGATCTTGTGGCTCCTAAAGCTAAGGTTGAGAGTTTGAGCTCTACAGAGGCCACTTAAATTTAGAGAACAAAAAGCTCTATTCTCTGCTCCCAGACCTTACCCCAAATCCCTGCCAGGTGTCTGCCCTCTGGTCAAATGAGAAACTGGCAAAGGGGTGCAAACCTAGCACAGAATTGGGAAACAGAAAAATGGGCACCCTTTATTATGGTGCTCCTTCTCTTTTATGTGTTTACAATACTTGGGCATAATTTACAGAGAATAGATACTACATTTTTTACTTTCACCACTGGAAATCTGAGGCAAACTGCATTATCAGTCATAAAATTCATTATCTTTCTATTCTAAGTTATTCTAAGCTTATTCTAAGCTCAGATAGCTGACATTATCCTCTTGGTAATAAACAATGAAAAAACACATCTTCTGAGCAATATTAATCTGCAACTTTAGGATAGGAGAAAATCAGTTGAAAACTGAGCACGATTTTCACGTGAATAAAAGATATTATTTAAAAATAATTCCATGTGTAATATAACAGAATAAGTATGATTTTCATTATGTACTAGAAATTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC 

MSTNP2： 

TTCCCCAAAAGGAGTAGGAAGAATAAATCTCCTGTGGCCTGGAAACAGCTTCTGTTTCTCACTGGCTATGTTTGTTTAGCTCTTTAATAGTTCATTTGATTAGATCTTGTGGCTCCTAAAGCTAAGGTTGAGAGTTTGAGCTCTACAGAGGCCACTTAAATTTAGAGAACAAAAAGCTCTATTCTCTGCTCCCAGACCTTACCCCAAATCCCTGCCAGGTGTCTGCCCTCTGGTCAAATGAGAAACTGGCAAAGGGGTGCAAACCTAGCACAGAATTGGGAAACAGAAAAATGGGCACCCTTTATTATGGTGCTCCTTCTCTTTTATGTGTTTACAATACTTGGGCATAATTTACAGAGAATAGATACTACATTTTTTACTTTCACCACTGGAAATCTGAGGCAAACTGCATTATCAGTCATAAAATTCATTATCTTTCTATTCTAAGTTATTCTAAGCTTATTCTAAGCTCAGATAGCTGA CATTATCCTCTTGGTAATAAACAATGAAAAAACACATCTTCTGAGCAATATTAATCTGCAACTTTAGGATAGGAGAAAATCAGTTGAAAACTGAGCACGATTTTCACGTGAATAAAAGATATTATTTAAAAATAATTCCATGTGTAATATAACAGAATAAGTATGATTTTCATTATGTACTAGAAATTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC 

MSTNP3： 

TGCAACTTTAGGATAGGAGAAAATCAGTTGAAAACTGAGCACGATTTTCACGTGAATAAAAGATATTATTTAAAAATAATTCCATGTGTAATATAACAGAATAAGTATGATTTTCATTATGTACTAGAAATTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC 

MSTNP4： 

TTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAG CAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC 

MSTNP5： 

TTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC 

MSTNP6： 

TGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTC。 

本发明的具体步骤如下： 

本发明的技术路线见图1所示。 

首先根据文献查阅确定MSTN为肌肉组织中表达的基因。然后在NCBI数据库检索，找到猪的MSTN全长序列，登陆号为AY208121。通过Genebank信息，找到其第一外显子序列，选取第一外显子上游2000bp左右的序列，在网站http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl分析发现具有转录起始位点，在http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html上分析发现该序列具有大量转录因子识别位点。通过设计引物扩增了1709bp序列，该序列通过克隆测序，并通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST(Basic Local Alignment Search Toll)工具比对，发现该序列与网站提交的序列具有99％相似性。接着申请人将上述扩增获得的序列克隆至pGEM-Teasy载体中，以它为模板重新设计了6对扩增不同长度缺失片段的启动子片段的引物并在引物两侧加入Kpn I和Nhe I酶切位点，扩增获得截短的6段启动子片段并将这6个片段连接至pGEM-Teasy载体中测序并保证序列的正确性。引物编号为MSTNpF1、MSTNpF2、MSTNpF3、MSTNpF4、MSTNpF5、MSTNpF6、MSTNpR。然后提取上述片段的质粒，利用Kpn I和Nhe I酶将上述片段酶切下来后连接至pGL3-Basic质粒中，转染真核细胞，通过检测上述片段驱动的Luc+报告基因的活性来确定活性最高的片段。然后选取活性最高的pGL3-MSTNp2做为连接增强子的中间载体。申请人又以pEGFP-N1载体为模板，设计引物并加入NheI和XhoI酶切位点，引物标记为EnhancerNX-F、R。扩增获得含SV40增强子的片段，标记为EnhancerNX，将该片段连接至pGEM-Teasy载体，测序验证序列的正确性。将上述片段连接至中间载体pGL3-MSTNp2质粒中，构建一个融合启动子载体，命名为pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，Kpn I和Nhe I酶切位点之间的序列即为构建好的融合启动子片段MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。申请人将中间载体pGL3-MSTNp2和融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX转染肌细胞C2C12和猪肾细胞PK-15细胞，通过测定上述片段驱动的Luc+报告基因的活性，比较它们是否存在较大的差异，确定构建的融合启动子是否在肌肉组织中高效表达。 

本发明的优点在于： 

(1)本发明首次分析了MSTN启动子不同长度的片段的活性，找到活性较高的片段MSTNp2，并且申请人在该序列后加入SV40增强子，构建融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，该融合启动子活性大大提高。 

(2)本发明同时将该融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX转染肌源性细胞及非肌源性细胞验证了它的活性，确定融合启动子活性在两种细胞中均高于MSTNp2，且在肌源性细胞中的活性远远高于非肌源性细胞。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1为本发明所克隆的猪MSTN基因启动子MSTNp2-EnhancerNX的核苷酸序列，长度为1539bp。 

序列表SEQ ID NO：2为本发明所克隆的猪MSTN基因启动子MSTNP2的核苷酸序列，长度为1422bp。 

序列表SEQ ID NO：3为本发明所克隆的SV40增强子EnhancerNX的核苷酸序列，长度为117bp。 

图2为本发明扩增的MSTN启动子片段电泳图，长度为1709bp，即1000-2000bp之间较亮的条带。 

图3为本发明构建的不同长度缺失片段双酶切鉴定的电泳图谱，从左到右分别为DL2000 marker、pGL3-MSTNp6、pGL3-MSTNp7、pGL3-MSTNp4、pGL3-MSTNp3、pGL3-MSTNp2、pGL3-MSTNp1。 

图4为不同缺失片段转染C2C12及C2C12分化的肌管后，双荧光素酶活性。 

图5为扩增获得了SV40增强子EnhancerNX片段。 

图6为pGL-3MSTNp2-EnhancerNX利用不同酶酶切鉴定图谱。从左到右分别为DL2000 marker、NheI和XhoI酶切片段、KpnI和NheI酶切片段、KpnI和XhoI酶切片段。 

图7为pGL3-MSTNp2和pGL3-MSTNp2-EnhancerNX转染C2C12后的双荧光素酶活性。 

图8为pGL3-MSTNp2和pGL3-MSTNp2-EnhancerNX转染PK-15后的双荧光素酶活性。 

图9为pGL3-MSTNp2和pGL3-MSTNp2-EnhancerNX的双荧光素酶活性在PK-15和C2C12细胞中的比较结果。 

图10为本发明所用的pGL3-Basic载体信息。 

图11为本发明所用的pGL3-Control载体信息。 

图12为本发明所用的pGL3-TK载体信息。 

图13为本发明所用的pGEM-Teasy载体信息。 

具体实施方式

实施例1：猪肌肉组织特异表达启动子MSTNP片段及不同缺失片段的获得 

1、主要试剂： 

苯酚(国药集团化学试剂有限公司)、氯仿(国药集团化学试剂有限公司)、异戊醇(国药集团化学试剂有限公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、pGEM-Teasy载体(普洛麦格(北京)生物技术有限公 司，即美国Promega公司)、2×GC Buffer(宝生物工程大连有限公司)、LA Taq聚合酶(宝生物工程大连有限公司)、dNTP(购自Fermentas公司)、DL-2000 Marker(购自Fermentas公司)、AC柱式琼脂糖DNA回收试剂盒(购自Bio Teke公司) 

2、猪血液基因组DNA提取 

本发明所用的大白猪DNA样为常规的酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，具体操作步骤如下： 

(1)配制pH8.0的0.5mol/LEDTA作为抗凝剂，灭菌后吸取1mL左右加入50mL离心管中。 

(2)从大白猪(湖北省武汉市洪山区狮子山街华中农业大学动物科技学院精品猪场，中国公开使用的商品猪品种)前腔静脉采取20mL左右的血样，加入抗凝剂的50mL离心管中，带回实验室用于分离白细胞。 

(3)取10mL左右血样，以3000rpm、4℃离心10min，小心丢弃上层血清。 

(4)向管中加1.5倍体积的双蒸水，轻轻摇动以破碎红细胞，时间控制在10min以内，避免裂解时间过长，白细胞破裂。 

(5)5000rpm、4℃离心10min，小心丢弃上层红细胞浆，避免下层白细胞倒出。 

(6)向管中加入10mL 0.9％NaCl溶液洗涤，5000rpm、4℃离心10min，弃上清，获得白细胞沉淀。 

(7)向白细胞中加入1×SET缓冲液悬浮细胞，加入蛋白酶K(10mg/L)至浓度100μg/mL，10％SDS至终浓度0.5％，55℃消化过夜。 

(8)待细胞消化好后加入等体积饱和酚，轻轻上下颠倒混匀20min，5000rpm、4℃离心10min。 

(9)用剪掉尖嘴的大口径吸头小心吸取上清，避免吸入中间蛋白质层，将上清移入一个新的50mL离心管，弃下层苯酚。 

(10)配苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液，向上一步的上清中加入等体积的混合液，轻轻倒转离心管，混匀15min，10000rpm、4℃离心15min，吸上清至另一干净管中。 

(11)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，混匀15min，10000rpm、4℃离心15min，吸上清至另一干净管中。 

(12)向管中加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀离心管，可见DNA析出。 

(13)用枪头吸出絮状的DNA于一1.5mL的离心管中，用70％乙醇洗涤一次，10000rpm离心5min，弃上层乙醇。 

(14)将离心管于通风橱中干燥DNA，向管底加入300μLTE溶解DNA，保存于-20℃备用。 

3、猪基因MSTN启动子片段的获得 

在NCBI数据库检索猪基因MSTN全长序列(登录号AY208121)。通过Genebank的注释信息，找到其第一外显子序列，选取第一外显子上游2000bp左右的序列，在网站 http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq tools/promoter.pl分析发现具有转录起始位点，在 http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html上分析发现该序列具有大量转录因子识别位点。通过设计了一对特异引物(引物命名为MSTNPF和MSTNPR，其序列见表1)，扩增了1709bp序列，该序列包含1521bp5’上游序列及188bp外显子序列。扩增的序列命名为MSTNP。扩增片段检测结果如图2。 

PCR反应体系为：2.5μl 10×LA Taq Buffer，2μl 2mM dNTP，0.5μl 10μM引物MSTNPF和MSTNPR，1U LA Taq酶，0.5μl DNA，加去离子水补至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，10个循环94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，每个循环退火降低0.5℃，然后30个循环94℃变性4min，58 ℃退火40s，72℃延伸2min，总共40个循环后，72℃延伸10min。引物如表1所示 

表1本发明设计的引物序列 

表1说明：下划线部分为酶切位点，MSTNPF1-6为Kpn I酶切位点，MSTNPR1为Nhe I酶切位点；加粗部分为保护性碱基。 

PCR产物回收纯化：将扩增的PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳20min后紫外灯下将目的条带(1709bp)切下，放入1.5ml离心管中，然后经PCR产物纯化试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，产品货号：DP1701)，按其说明书回收纯化PCR产物，将回收产物保存至-20℃备用。 

回收产物连接：将回收产物按如下体系与载体pGEM-Teasy(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)连接。连接体系为：2.5μl 2×Ligbuffer，0.5μl pGEM-Teasy vector，0.5μl T4 ligase，1.5μl回收产物，将混合体系放至4℃-过夜连接。 

连接产物转化：用灭菌的枪头将连接产物加入30μl感受态(全式金)中冰浴30min，然后42℃热激45s，然后迅速放至冰上2min，加入400μl未加氨苄的LB培养基，放入37℃恒温摇床中复苏45min。接着以4000rpm/min离心4min，去除300μl上清，将剩余的上清吹散细菌沉淀，并将它们涂抹于含有100μg/ml氨苄的LB固体培养基平板中，37℃正置培养30min后，倒置培养14-16小时，观察有无白色菌落长出。 

筛选阳性克隆并测序验证：用灭菌过的牙签从平板中蘸取单克隆接入500μl 100μg/ml的LB液体培养基中，并放入37℃摇床扩大培养6h。以菌液为模板，MSTNPF，MSTNPR为引物按扩增MSTNP片段的条件进行PCR扩增，PCR扩增结束后经电泳检测，有目的条带表明该克隆子可能为阳性克隆子，将阳性克隆子送至华大基因公司测序。测序后将序列拼接并经BLAST与AY208121序列比对，结果显示扩增的序列为大白猪MSTN基因的启动子序列。将测序正确的阳性克隆至经TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒，该质粒命名为pGEM-MSTNp质粒。 

4、猪MSTN基因启动子不同缺失片段的获得 

以pGEM-MSTNp质粒为模板，设计了6对扩增不同长度大小的启动子缺失片段，引物分别命名为MSTNPF1-6与MSTNPR1。上游引物加入Kpn I酶切位点，下游引物加入Nhe I酶切位点，并在引物两侧加入保护性碱基，引物序列及结合的位置如表1，扩增的片段长度分别为1705bp、1422bp、884bp、754bp、531bp、268bp。将扩增获得的不同长度启动子片段进行电泳，并纯化回收目的条带，连接至pGEM-Teasy 载体，然后转化、挑取阳性克隆并进行测序验证，具体操作步骤如猪MSTN基因启动子片段的获得。然后将含有上述6个片段的阳性克隆扩大培养，并提取质粒，质粒命名为：pGEM-T-MSTNp1、pGEM-T-MSTNp2、pGEM-T-MSTNp3、pGEM-T-MSTNp4、pGEM-T-MSTNp5和pGEM-T-MSTNp6。 

实施例2：猪MSTN启动子相应缺失片段载体的构建 

1、主要试剂 

Kpn I和Nhe I内切酶(购自Fermentas公司)、T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、pGL3-Basic载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)。 

2、含不同缺失片段的载体及pGL3-Basic载体双酶切 

用Kpn I和Nhe I内切酶双酶切质粒pGEM-T-MSTNp1、pGEM-T-MSTNp2、pGEM-T-MSTNp3、pGEM-T-MSTNp4、pGEM-T-MSTNp5和pGEM-T-MSTNp6及pGL3-Basic载体。双酶切体系为：2μl 10×Tango Buffer，1μl Kpn I，lμl Nhe I、4μl质粒及12μl灭菌水，37℃酶切6h。酶切后用纯化试剂盒回收6个不同-大小的启动子片段，及pGL3-Basic载体酶切后的条带。同收产物保存于-20℃备用。 

3、重组载体的构架 

将双酶切的6个不同长度大小的启动子片段分别于pGL3-Basic载体酶切后的条带连接构建成重组载体，分别命名为pGL3-MSTNp1、pGL3-MSTNp2、pGL3-MSTNp3、pGL3-MSTNp4、pGL3-MSTNp5、pGL3-MSTNp6。连接体系为：2μl pGL3-Basic载体酶切后的片段，6μl酶切后的不同长度大小的启动子片段，1μl T4连接酶，1μl 10×T4 DNA ligation Buffer，16℃连接12h。然后转化至DH5α感受态中，挑取阳性克隆并进行测序验证，具体操作步骤如猪MSTN基因启动子片段的获得。对于阳性克隆扩大培养，利用OMEGA公司的去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，并测质粒的浓度及OD260/OD280。所用质粒浓度测定仪器为：NanoDrop2000 Spectrophotometer。提取的质粒按步骤2进行双酶切进行酶切鉴定，确定提取质粒是否正确。酶切鉴定图谱如图3。 

实施例3：本发明的启动子缺失片段活性测定 

1、主要试剂： 

胎牛血清(FBS，购自GBICO公司)，DMEM高糖溶液(购自GBICO公司)，0.25％胰酶(购自GBICO公司)，Lipofectamin^TM 2000脂质体(购自Invitrogen公司)，Dual-LuciferaseReporter Assay System(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)、PBS粉(购自DECENT BIOTECH公司，货号：p100p)、pGL3-Control(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)、PRL-TK(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司) 

2、主要耗材： 

24孔细胞培养板(Costar)、细胞培养瓶、一次性无菌吸管、一次性注射器、酶标板(Costar)等 

3、细胞培养用溶液的配制 

PBS配制：以一包PBS粉兑1000ml超纯水，溶解后在121℃高压灭菌30min后备用。 

细胞培养基：用一次性注射器吸取九份DMEM高糖溶液兑一份FBS，混匀后备用，整个过程注意无菌操作。 

4、转染用细胞的准备 

在转染前一天以1.5×10⁵的密度接种C2C12细胞至24孔板中，18-24h后待细胞长至80％汇合，进行转染实验。 

5、细胞转染 

(1)在转染前将24孔板中细胞换成新鲜培养基，以便让细胞长至最好的生长状态。 

(2)按每孔0.8μg量溶于50μl Opti-MEM无血清培养基中。pGL3-MSTNp1、pGL3-MSTNp2、pGL3-MSTNp3、pGL3-MSTNp4、pGL3-MSTNp5、pGL3-MSTNp6质粒每个质粒三个重复。同时以pGL3-Basic质粒和pGL3-Control为阴性与阳性对照。同时以每孔0.04μg的内参(PRL-TK)质粒溶于50μlOpti-MEM无血清培养基中做阳性对照。质粒混匀与Opti-MEM无血清培养基中后室温静止5min。 

(3)按每孔2μl(质粒：Lipofectamin^TM 2000脂质体＝1∶2.5)Lipofectamin^TM 2000脂质体(Invitrogen)的量溶于50μl Opti-MEM无血清培养基中。对于内参则按每孔0.1μl Lipofectamin^TM 2000脂质体的量溶于50μl Opti-MEM无血清培养基中，室温静止5min。 

(4)5min后将溶解好的Lipofectamin^TM2000与溶解好的质粒混合，室温静止20min，对于内参也以相同的方式混匀。 

(5)静止20min后取100μl溶好的内参与脂质体复合物小心滴加至待转染的细胞中，边滴加边晃动培养板，以便使复合物均匀分布在细胞培养基中。加好后再小心将不同启动子缺失片段与脂质体复合物按分组小心滴加至细胞培养基中。 

(6)将细胞培养板小心放入CO₂培养箱中，培养6h后将培养基换成新鲜培养基继续培养，24h后收集细胞。 

6、荧光素酶活性测定 

(1)溶液配制 

细胞裂解液PLB的配制：以1份5×Passive Lysis Buffer(PLB)与4份体积的灭菌超纯水，轻轻混匀，用于细胞收集。 

LAR II荧光素酶分析底物配制：将试剂盒中10ml荧光素酶分析缓冲溶液II全部加入棕色瓶中的荧光苏酶分析底物中，待溶解后避光-70℃保存。 

1×Stop&Glo Reagent试剂配制：吸取1份50×Stop&Glo Substrate溶于Stop&Glo Buffer中稀释成1×Stop&Glo Reagent试剂，现配现用。 

(2)细胞的收集 

转染24h后收集细胞，首先将培养基吸出，然后用PBS清洗一遍，然后向每个孔中加入配制好的120μl细胞裂解液1×PLB，室温摇晃15min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中。 

(3)活性测定 

吸取裂解液加入酶标板底部，用PerkinElmer公司的VICTOR^TMX²Multilabel Plate Reader仪器来进行双荧光素酶活性测定。测定的具体过程如下： 

a、打开控制仪器的电脑后再打开测定用仪器。 

b、启动测定软件，并选择工具栏中的Tool下的Dispenser maintenance，弹出对话框。 

c、选择进样管道1和2，用灭菌超纯水对进样管道清洗2次。 

d、选择进样管道1，用灭菌超纯水继续清洗，单独检查管道进样是否正常，清洗完后排空管道1中的超纯 水。 

e、选择进样管道1，选择Fill，用LARII填满管道1，并将回收杯中的LARII回收重新利用。 

f、选择进样管道2，用灭菌超纯水单独对管道2清洗后排空。 

g、选择进样管道2，选择Fill，用Stop buffer填满管道1，并将回收杯中的Stop buffer回收重新利用。 

h、将加入细胞裂解液的酶标板放入Multilaber Reader中。 

i、进入软件界面，选择自动加样Auto-dual-luciferase，检查程序。 

j、选择要测定的样品，并选择保存设置结果的保存，选择测量按钮对样品进行测量。 

k、测定完后选择Tool下的Dispenser maintenance，弹出对话框，选择Empty对多余的溶液排出。 

l、按步骤c对进样管道进行清洗，清洗完后关闭仪器与电脑。 

(4)不同片段启动子活性分析 

申请人首先对数据进行初步处理(M1/M2)后，利用SPSS13.0对不同片段长度启动子活性进行统计分析。找出活性最高的片段，统计结果显示pGL3-MSTNp2相对于其它片段较高。结果如图4。 

实施例4：融合启动子MSTNp2-EnhancerNX的构建 

1、主要试剂： 

Nhe I内切酶、Xho I内切酶(购自NEB公司)、T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、载体pGEM-Teasy(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)、2×GC Buffer(购自宝生物工程大连有限公司)、LA Taq聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)、dNTP(购自Fermentas公司)、DL-2000 Marker(购自Fermentas公司)、AC柱式琼脂糖DNA回收试剂盒(购自Bio Teke公司)、载体pEGFP-N1(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司) 

2、增强子序列的获得 

申请人首先根据pEGFP-N1载体的序列信息，设计带NheI内切酶与XhoI内切酶酶切位点的引物，以pEGFP-N1为模板，扩增获得了增强子片段。引物命名为：EF和ER，扩增的片段命名为EnhancerNX，引物序列为：EF：CTAGCTAGCGGAATGTGTGT CAGTTAG，ER：CCGCTCGAGGAGTTAGGGGCGGGACTA(上述引物中的下划线为酶切位点，加粗部分为保护性碱基)，扩增片段电泳检测结果如图5， 

PCR反应体系为：12.5μl 2×GC Buffer，2μl 2mM dNTP，0.5μl 10μM引物EF和ER，1U LA Taq酶，0.5μl DNA，加超纯水补至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；35个循环94℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸25s；72℃延伸10min。 

3、增强子连接至pGEM-Teasy载体 

PCR反应结束后进行电泳检测，PCR产物回收，连接，转化，挑菌，测序，确定扩增的片段正确且连接至pGEM-Teasy载体，命名为pGEM-T-EnhancerNX并提取质粒，保存于-20℃备用。具体过程同实施例一中的过程3 

4、增强子片段连接至中间载体pGL3-MSTNp2 

将pGEM-T-EnhancerNX与中间载体pGL3-MSTNp2同时以NheI内切酶和XhoI内切酶进行双酶切。酶切体系为：2μl 10X Buffer2，1μl Xho I，1μl Nhe I、4μl质粒、0.2μl BSA加灭菌水补齐至20μl，37℃酶切6h。酶切后用纯化试剂盒回收120bp左右的增强子片段，及中间载体pGL3-MSTNp2酶切后的条带。回收 产物保存于-20℃备用。 

5、融合启动子的构建 

将回收的增强子片段与中间载体pGL3-MSTNp2酶切后的条带用T4DNA连接酶连接，连接体系为：2μl pGL3-MSTNp2载体酶切后的片段，6μl酶切后的增强子片段，1μl T4连接酶，1μl 10×T4DNA ligationBuffer，16℃连接12h。然后转化至DH5α感受态中，挑取阳性克隆并进行测序验证，提取质粒并测定质粒浓度，保存于-20℃备用，质粒命名为pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，具体操作步骤如猪MSTN基因启动子不同缺失片段的获得。提取的质粒pGL3-MSTNp2-EnhancerNX进行双酶切进行酶切鉴定确定提取质粒是否正确。双酶切共分三种方式进行鉴定，利用Kpn I和Nhe I酶切确定该融合启动子载体中含有MSTNp2片段，利用Nhe I和Xho I酶切确定该融合启动子载体中含有EnhancerNX，利用Kpn I和Xho I酶切确定该融合启动子载体中含有MSTNp2-EnhancerNX片段，该片段包含MSTNp2和EnhancerNX。前两种酶切体系见前。利用Kpn I和Xho I酶切的体系为：2μl 10×BamH I Buffer，1μlXho I，1μl Kpn I、4μl质粒加灭菌水补齐至20μl，37℃酶切6h。酶切鉴定图谱如图6，双酶切鉴定及测序均显示融合启动子片段载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX构建成功，载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX的Kpn I和Xho I酶切位点之间的序列即为融合启动子MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

实施例5：融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX与中间载体pGL3-MSTNp2活性比较 

1、主要试剂耗材、细胞培养及脂质体转染细胞步骤均同实施例3 

2、两种启动子载体活性在不同细胞中的比较 

将本发明的启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX与中间载体pGL3-MSTNp2分别转染C2C12和PK-15细胞，转染方式同实施例3，转染后通过测定两个载体在不同细胞中的活性，比较pGL3-MSTNp2-EnhancerNX活性是否高于pGL3-MSTNp2。结果显示本发明构建的启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX的活性远远高于中间载体pGL3-MSTNp2的活性(见图7和图8所示)，本发明的启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX在肌细胞C2C12中的活性也明显高于非肌细胞PK-15(见图9)，推测其可在猪肌肉组织中调控相关基因的高效表达。 

参考文献： 

1、崔奎青等，水牛β-酪蛋白5′启动区的克隆和序列分析广西农业生物科学，2005，24(2)：94-98； 

2、樊宝良等，水牛α-乳清蛋白基因部分序列的测定与分析中国畜牧杂志，2005，41(7)：21-24； 

3、黄赞等，山羊β2酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX，遗传学报，2002，29(3)：206～211； 

4、Hennighausen，L.The prospects for domesticating milk protein genes.J Cell Biochem.1992，49(4)：325-32. 

5、McPherron et al.，Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-b superfamily member.Nature，1997，387：83e90； 

6、McGranahan et al.，Agrobacterium-mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration oftransgenic plants.Nature Biotechnology，1988，6，800-804； 

7、Penarrubia et al.，Production of the sweet protein monellin in transgenic plants.Nature Biotechnology，1992，10， 561-564； 

8、Spiller et al.，The myostatin gene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transc ription factorMyoD.Mol Cell Biol，2002，22：7066-7082. 

9、Stinckens et al.，Characterization of the complete porcine MSTN gene and expression levels in pig breedsdiffering in muscularity.Animal Genetics，2008，39，586-596. 

10、Thomas et al.，Myostatin，a negative regulator of muscle growth，functions by inhibiting myoblastproliferation.J Biol Chem.2000，275(51)：40235-43； 

11、Whitelaw，CB.Nucleosome organisation ofthe beta-lactoglobulin gene.Transcription complex formation.AdvExp Med Biol.2000，480：147-53。 

Claims (3)

1.一个猪肌肉组织特异性表达的融合启动子MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

2.一种猪肌肉组织特异性表达的融合启动子MSTNp2-EnhancerNX的制备方法，其步骤如下：

1)根据猪MSTN基因AY208121序列数据，设计引物MSTNPF和MSTNPR，扩增获得1709bp的启动子片段MSTNp，然后重新设计7条引物：MSTNPF1、MSTNPF2、MSTNPF3、MSTNPF4、MSTNPF5、MSTNPF6和MSTNPR1，将所述的引物的前6条引物分别与第7条引物配对，得到6个引物对；以启动子片段MSTNp为模板，扩增获得6段带有Kpn I和Nhe I酶切位点的DNA片段：MSTNp1、MSTNp2、MSTNp3、MSTNp4、MSTNp5和MSTNp6，将上述扩增的6个DNA片段连接至pGEM-Teasy载体中；

2)以pGL3-Basic载体为材料，切除该载体中的Kpn I和Nhe I酶切位点之间的序列，同时切割步骤1)所述的6个带有Kpn I和Nhe I酶切位点的DNA片段连接至pGEM-Teasy载体中的Kpn I和Nhe I酶切位点之间的序列，将被切割的6个片段定向插入pGL3-Basic载体的Kpn I和Nhe I酶切后的片段中，构建得到如下载体：pGL3-MSTNP1，pGL3-MSTNP2，pGL3-MSTNP3，pGL3-MSTNP4，pGL3-MSTNP5和pGL3-MSTNP6；

3)将步骤2)的6个载体分别转染C2C12细胞及肌管中，验证其活性，得到中间载体pGL3-MSTNp2；

4)以载体pEGFP-N1为模板扩增获得带Nhe I和Xho I酶切位点的SV40的DNA片段EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，将所述的DNA片段EnhancerNX连接至载体pGEM-Teasy中，得到载体pGEM-Teasy-EnhancerNX；

5)用Nhe I和Xho I内切酶酶切中间载体pGL3-MSTNP2 Nhe I和Xho I之间的序列和载体pGEM-Teasy-EnhancerNX，将DNA片段EnhancerNX定向插入到中间载体pGL3-MSTNP2的Nhe I和Xho I之间，得到融合启动子载体pGL3-MSTNp2-EnhancerNX，该载体的Kpn I和Xho I酶切位点之间的序列即为融合启动子MSTNp2-EnhancerNX，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

其中：步骤1)所述的引物及DNA片段的核苷酸序列如下所示：

MSTNPF：TTCAGGGCATCTGGTTTGTGTCT；

MSTNPR：GGGACCAGCAACAATCAGCA；

MSTNPF1：GGGGTACCCAGGGCATCTGGTTTGTG；

MSTNPF2：GGGGTACCTTCCCCAAAAGGAGTAGG；

MSTNPF3：GGGGTACCTGCAACTTTAGGATAGGA；

MSTNPF4：GGGGTACCTTTAGTCAGGAAAACAAG；

MSTNPF5：GGGGTACCTTAAGTATGAAGTGTAAAAG；

MSTNPF6：GGGGTACCTGGAGCAAGAGCCAATCA；

MSTNP：

TTCAGGGCATCTGGTTTGTGTCTGTTTTTCCTTAATCTTTAATGATGAGCAAGTCTAATGCATTATGTAAGGCCATTTTTCTCAAGTGATGTAGATACCTCCTAAGAATTTGATGAAAATGCATTAACTTTTCAGGCTACTGAGTTGCATTTTAGTGCACTGAGGCAGTAAATGAGTGTACAATGTGCAAAAGTAGTGACCTAAAAAATAAATATTTGATATGAACCACTGCATTCTCTTGGAAAAAAAAAAAGTAATGGATTAACTCTCTTAGGAGTCCTTAGCTTCCCCAAAAGGAGTAGGAAGAATAAATCTCCTGTGGCCTGGAAACAGCTTCTGTTTCTCACTGGCTATGTTTGTTTAGCTCTTTAATAGTTCATTTGATTAGATCTTGTGGCTCCTAAAGCTAAGGTTGAGAGTTTGAGCTCTACAGAGGCCACTTAAATTTAGAGAACAAAAAGCTCTATTCTCTGCTCCCAGACCTTACCCCAAATCCCTGCCAGGTGTCTGCCCTCTGGTCAAATGAGAAACTGGCAAAGGGGTGCAAACCTAGCACAGAATTGGGAAACAGAAAAATGGGCACCCTTTATTATGGTGCTCCTTCTCTTTTATGTGTTTACAATACTTGGGCATAATTTACAGAGAATAGATACTACATTTTTTACTTTCACCACTGGAAATCTGAGGCAAACTGCATTATCAGTCATAAAATTCATTATCTTTCTATTCTAAGTTATTCTAAGCTTATTCTAAGCTCAGATAGCTGACATTATCCTCTTGGTAATAAACAATGAAAAAACACATCTTCTGAGCAATATTAATCTGCAACTTTAGGATAGGAGAAAATCAGTTGAAAACTGAGCACGATTTTCACGTGAATAAAAGATATTATTTAAAAATAATTCCATGTGTAATATAACAGAATAAGTATGATTTTCATTATGTACTAGAAATTTAGTCAGGAAAACAAGTTTCTCAAATTATAGCTGAATATATTTTACTAGTATCACAATCTTAAATTTTAATTCAGGTCTTCCTAATTTAAATCTGTATTTCTCTGATTACGCAGGACTAAAAATAATTTAAAACAGCAAATAAAATTCTTTTTTCCTCAAATGTTTGTCTAAATAATGTAAAATCATTTTATTTTTTTGAGGAAAAAGACATTTCAACTTTTTAAGTATGAAGTGTAAAAGAATTACTTATTTAAATTACAATTTTAAAGTTTCACTAATAAAGATTAATAATATTTAAGTGCAGTTTATATTATTGTTAACATAGATTTTAATTTTTCAAATGTCACATATATCTTTCATTATTTGTAGATTTATTTCTTTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTCACCCTTGACTGTAACAAAATACTGTTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAAGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCATCAAGTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACAGTGCAGGCATTAAAATTTTGCTTGGCGTTACTCAAAAGCAAAAGTAAAAGGAAGAAATAAGAACAAGGAGAAAGATTGTATTGATTTTAAAATCATGCAAAAACTGCAAATCTATGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTCCC

MSTNP1：

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3.权利要求1所述的融合启动子MSTNp2-EnhancerNX调控基因在猪肌肉组织表达中的应用。

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