CN102453097A - 抑制血管新生的融合蛋白vf及药物组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗肿瘤的融合蛋白。该融合蛋白由血管内皮细胞生长抑制因子(Vascular Endothelial Growth Inhibitor，VEGI)及其变体与其他多肽连接构成。VEGI及其变体可以与其他多肽直接连接，也可以通过连接肽连接。融合蛋白VF可作用血管内皮细胞，诱导处于生长期的血管内皮细胞凋亡和维持停滞期的血管内皮细胞的停滞状态，从而抑制血管新生。本发明提供的融合蛋白VF能够在抗肿瘤的治疗中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白制备的生物技术，更具体地涉及用于抑制血管新生的融合蛋白及其药物组合物和应用。
背景技术
血管内皮细胞抑制因子(Vascular Endothelial Growth Inhibitor，VEGI)，特异性作用于血管内皮细胞，可以诱导处于生长期的血管内皮细胞凋亡和维持静止期的血管内皮细胞的静止状态。目前，已经报道了4种VEGI异构体，174个氨基酸的VEGI174，两个不同形式的192个氨基酸的VEGI192A和VEGI192B，后来发现的251个氨基酸的VEGI251。这些VEGI的氨基端不同，但是含有相同的151的氨基酸构成的核心序列。所有异构体都来源同一基因，通过不同的拼接而来。以人VEGI cDNA为探针，对人不同细胞与组织来源的mRNA进行了RNA杂交，结果表明，VEGI仅在脐静脉、主动脉、皮肤微血管等内皮细胞中表达。VEGI的表达与内皮细胞的生长状态密切相关，增殖状态内皮细胞的VEGI表达相对较低，而生长达到接触抑制的内皮细胞VEGI表达量显著提高，是生长状态细胞的表达几倍。目前关于VEGI的功能研究主要来自于VEGI174。
VEGI174是一个典型的II型跨膜蛋白，29-174氨基酸残基构成胞外链，表达在癌症细胞表面的全长VEGI 174对肿瘤的生长没有影响。在内皮细胞中表达时，对内皮细胞的生长也没有抑制作用。在TNF家族的其他几个成员(如：TNF和FAS配体)的研究中，科学家们曾发现，TNF和FAS配体可以从膜上切割下来，以游离的形式存在，并发挥作用。类似地，人工的重组的可容性VEGI174(S VEGI，含有VEGI174的胞外链和来自另一分泌蛋白的信号肽)，在肿瘤细胞过表达时，可抑制肿瘤的生长。这表明，全长的VEGI174对肿瘤的生长没有作用，而可溶性的VEGI对可抑制肿瘤的生长。可溶性的VEGI174也抑制牛主动脉与人静脉内皮细胞的增殖，IC50值分别为6ng/ml和60ng/ml.但100ng/ml的VEGI对人T细胞和骨髓基质细胞的增殖无影响。VEGI192A对内皮细胞的抑制能力更强，对牛主动脉内皮细胞生长抑制的IC50值只有0.272，而VEGI192B，以及VEG 251I，VEGI 251II，VEGI 251IV对牛主动脉内皮细胞的生长没有抑制作用，VEG 251III与VEGI 174相当，IC50值都是10ng/ml.VEGI251，是最丰富的VEGI异构体，含有一个推测的分泌信号肽。VEGI251的过表达导致内皮细胞的凋亡和生长的抑制。类似地，含有151氨基酸的核心序列的分泌形式的VEGI也已经证明可以启动肿瘤细胞的凋亡和生长抑制，但是能力较低。总体上，VEGI不仅是内皮细胞特异性表达的，也特异性地抑制内皮细胞的增殖，但是变体间的活性存在差异，导致这种差异的原因尚不清楚。
在体外血管生成模型中，重组人VEGI可显著抑制牛主动脉内皮细胞在胶原纤维中形成管样结构，IC50值约为30ng/ml。在体内鸡胚尿囊膜新生血管实验中，VEGI也可以剂量依赖地抑制FGF或VEGF诱导的毛细血管的生成。由此可见，不论为何种刺激血管生成的因素，VEGI均可抑制新生血管的生成。
VEGI的抗肿瘤作用也得到了实验证实。将可溶性人VEGI转染鼠源性结肠癌MC-38细胞，并将转染的肿瘤细胞皮下注射入同系的C57BL/6小鼠，结果发现注射表达可溶性VEGI MC-38细胞形成的肿瘤体积明显小于对照组，并未发现不良反应，也无体重下降。有趣的是，表达VEGI并不抑制结肠癌细胞的增殖，说明VEGI对肿瘤细胞无直接的细胞毒作用。免疫组化分析表明，肿瘤内的微血管大大减少。但未发现VEGI聚集中性粒细胞与巨噬细胞浸润肿瘤细胞。将表达可溶性VEGI的CHO细胞与人乳腺癌细胞MADAMB231混和注入裸鼠体内，发现异种移植的肿瘤生长也明显地被抑制。这些研究表明，可溶性VEGI转染人肿瘤细胞，可抑制肿瘤新生血管的生成，VEGI的抗肿瘤作用也主要来自于对新生血管生成的抑制。
较多的研究表明，可溶性VEGI只选择性抑制血管内皮细胞的生长，而对其他细胞如T细胞、B细胞、肿瘤细胞均无直接的毒害作用。但是也有研究表明，可溶性的VEGI可直接抑制U-937，MCF-7，Hela，ML-1a等四种肿瘤细胞的生长，尤其是加入蛋白质合成抑制剂环己酮时，细胞毒作用更加明显。在免疫细胞方面，最近发现，VEGI192A可以诱导树突状细胞的成熟，表明VEGI抗癌作用，除了来自于对血管新生的抑制外，刺激树突状细胞的适应性免疫可能在抗肿瘤中发挥作用。这些研究说明了VEGI可能是一个多功能的细胞因子，除了阻断血管生成抗肿瘤外，可能还存在其他作用机理。无论如何，大量的细胞和动物实验均清楚地证明了，VEGI的抗肿瘤作用显著，临床应用的前景好。在这些VEGI的变体中，VEGI 192A的作用最强。
但是，VEGI分子的稳定下差，表达困难，很难开发成药物应用于临床的抗血管新生的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有VEGI分子的稳定下差，表达困难，很难开发成药物应用于临床的抗血管新生的治疗等技术问题而提供一种抑制血管新生的融合蛋白。该融合蛋白将VEGI与另一多肽分子融合在一起，可以增加蛋白的稳定性，延长体内的作用时间，改善VEGI的生产和制备。
本发明的抑制血管新生的融合蛋白由血管内皮细胞抑制因子及其变体P1与其他任意多肽P2融合而成。该融合蛋白的结构形式为P1-P2或者P2-P1。
更进一步的，本发明的抑制血管新生的融合蛋白还包括连接肽。包括连接肽的融合蛋白的结构形式为P1-L-P2或者P2-L-P1或者P1-L-P1-L-P1。
本发明的血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI192A或其突变体，该VEGI192A或其突变体与序列表中SEQ ID NO：1的序列具有80％以上的同源性。或者是VEGI192B或其突变体，该VEGI192B或其突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。或者是VEGI251或其片断以及它们的突变体，该VEGI251或其片断以及它们的突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。
本发明的其他任意多肽P2是人IgG 1 Fc，或其突变体，该人IgG 1 Fc，或其突变体与序列表中SEQ ID NO：4的序列具有80％以上的同源性。
本发明的连接肽L是(Gly4Ser)3。
本发明所要解决的技术问题之二是提供以本发明的抑制血管新生的融合蛋白为活性成分的抑制血管新生药物。特别是抗肿瘤药物。
本发明所要解决的技术问题之三是提供本发明的抑制血管新生的融合蛋白在制备抑制血管新生药物方面的用途。
本发明的药物以本发明的抑制血管新生的融合蛋白为活性成分，该药物用于抑制血管新生。尤其是用于治疗肿瘤。
在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂，片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液，膏剂，霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明药物的药用量可根据患者的年龄、体重、疾病的严重程度进行调整，日剂量一般为2-1000g/kg。
本发明融合蛋白将VEGI与另一多肽分子融合在一起，可以增加蛋白的稳定性，延长体内的作用时间，改善VEGI的生产和制备。本发明的融合蛋白VF组成成份全部来源于人源(human)性蛋白，因此，该蛋白作为一种药物进入人体，没有任何异体蛋白的免疫源性。融合蛋白的VEFI部分可以发挥VEGI抗血管新生的功能，与之融合多肽则起到稳定其作用，促进其次表达的作用。本发明的融合蛋白VF通过阻断肿瘤内的血管新生，达到治疗肿瘤的目的。
附图说明
图1是本发明实施例1的融合蛋白VF1的结构示意图。
图2是本发明实施例1分离纯化得到的融合蛋白VF1的SDS-PAGE电泳图。
图3是本发明实施例1融合蛋白VF1抑制牛主动脉内皮细胞的生长效果示意图。
图4是本发明实施例1融合蛋白VF1对肿瘤的抑制作用示意图。
具体实施方式
下面用实施例对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1 融合蛋白VF1及表达
该实施例的融合蛋白VF1的结构如图1所示。其结构形式为ASP-P1-P2，ASP为分泌信号肽经过切割余留下来的单一氨基酸天冬氨酸；P1为VEGI192A，与序列表中SEQ ID NO：1的序列具有80％以上的同源性；P2为人IgG1 Fc，与序列表中SEQ ID NO：4的序列具有80％以上的同源性；融合蛋白VF1为序列表中SEQ ID NO：5的完整氨基酸序列。
本实施例应用哺乳动物细胞(CHO细胞)表达融合蛋白VF1。所用的编码基因序列为序列表中SEQ ID NO：6的蛋白质的氨基酸序列。
其表达过程具体包括以下步骤：委托技术服务公司合成VF1编码基因(SEQID NO：6)，并插入到表达载体pIRES上。利用大肠杆菌扩增该表达载体，并抽提得到VF1的表达载体。利用电转的方法，将VF1的表达载体，转染进入CHO细胞。利用G418，筛选出阳性克隆。然后，大规模培养重组CHO细胞，收获细胞培养上清，经过Protein A的分离纯化，获得融合蛋白VF1，如图2所示。
实施例2融合蛋白VF1抑制血管内皮细胞生长
将实施例1中所得到的融合蛋白VF1以不同的浓度加入到的牛主动脉内皮细胞，以临床缓冲液作为对照。培养三天后，消化细胞，计数细胞密度。以细胞密度与对照组的细胞密度的百分比做纵坐标，以融合蛋白VF的浓度作为横坐标，结果如图3所示。
该实施例说明，融合蛋白VF1可以明显的抑制牛主动脉内皮细胞的生长。
实施例3 融合蛋白VF1抑制肿瘤的生长
将Lewis肺癌细胞培养在含有10％胎牛血清的培养基中，单程长满后，用0.05％胰酶溶液消化细胞，并于磷酸盐缓冲液中，离心，洗涤一次，再重新悬浮于磷酸盐缓冲液中。取20只C57BL/6小鼠，每只小鼠腹部皮下注射2.5×105Lewis肺癌细胞。6天后，C57BL/6小鼠皮下形成肿瘤，肿瘤体积达到100-200mm3，占体重的0.5-1％。然后分成4组，一组皮下注射磷酸盐缓冲液，作为对照；第二组注射，融合蛋白VF1(溶解在磷酸盐缓冲液中)，注射剂量为2mg/Kg；第三组，注射剂量为4mg/Kg；第四组，注射剂为6mg/Kg。一周注射两次。半个月后，对照组的肿瘤大小达到2000mm3。将所有的小鼠处死，解剖，测定肿瘤体积大小，结果如图4所示。该实施例说明融合蛋白VF1对抑制肿瘤生长有作用。
Claims (21)
1.一种抑制血管新生的融合蛋白，其特征在于，由血管内皮细胞抑制因子及其变体P1与其他任意多肽P2融合而成。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构形式为P1-P2或者P2-P1。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括连接肽。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构形式为P1-L-P2或者P2-L-P1或者P1-L-P1-L-P1。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI192A或其突变体，该VEGI192A或其突变体与序列表中SEQ ID NO：1的序列具有80％以上的同源性。
6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI192A或其突变体，该VEGI192A或其突变体与序列表中SEQ ID NO：1的序列具有80％以上的同源性。
7.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI192B或其突变体，该VEGI192B或其突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。
8.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI192B或其突变体，该VEGI192B或其突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。
9.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI251或其片断以及它们的突变体，该VEGI251或其片断以及它们的突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。
10.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述血管内皮细胞抑制因子及其变体P1是VEGI251或其片断以及它们的突变体，该VEGI251或其片断以及它们的突变体与序列表中SEQ ID NO：2的序列具有80％以上的同源性。
11.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述其他任意多肽P2是人IgG 1 Fc，或其突变体，该人IgG 1 Fc，或其突变体与序列表中SEQ IDNO：4的序列具有80％以上的同源性。
12.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述其他任意多肽P2是人IgG 1 Fc，或其突变体，该人IgG 1 Fc，或其突变体与序列表中SEQ ID NO：4的序列具有80％以上的同源性。
13.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽L是(Gly4Ser)3。
14.一种以权利要求1所述的融合蛋白为活性成分的抑制血管新生药物。
15.如权利要求14所述的抑制血管新生药物为抗肿瘤药物。
16.一种以权利要求3所述的融合蛋白为活性成分的抑制血管新生药物。
17.如权利要求16所述的抑制血管新生药物为抗肿瘤药物。
18.权利要求1的融合蛋白在制备抑制血管新生药物中的应用。
19.权利要求1的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
20.权利要求3的融合蛋白在制备抑制血管新生药物中的应用。
21.权利要求3的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
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