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CN102459298A - 化学可编程免疫 - Google Patents

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CN102459298A
CN102459298A CN2010800273634A CN201080027363A CN102459298A CN 102459298 A CN102459298 A CN 102459298A CN 2010800273634 A CN2010800273634 A CN 2010800273634A CN 201080027363 A CN201080027363 A CN 201080027363A CN 102459298 A CN102459298 A CN 102459298A
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Abstract

提供了针对任何分子或化合物的立即免疫个体的方法和组合物。本发明涉及具有至少两个位点的免疫接头；(1)与个体中的免疫反应组分结合的至少一个第一结合位点，以及(2)与期望化合物或者分子——靶标特异结合的至少一个第二结合位点。优选地，第二结合位点是巯化适配体，其具有增加的稳定性、抗降解和更长的循环半寿期的优点。也提供了制备和使用包括免疫接头分子的药物组合物的方法，该免疫接头分子具有巯化适配体。

Description

化学可编程免疫
对相关申请的交叉参考
本申请要求在2009年5月5日提交的美国临时专利申请61/175602的权益，所述临时申请的公开完整并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及为任何期望抗原提供立即免疫的组合物和方法。本文用到的“免疫”表示免疫组分功能性的结合特定靶标。特定靶标不同于首先产生免疫的物质或者结构上与其无关，并且事实上，通过本文公开的方法，靶标的性质不仅由免疫原决定，还由称作“接头”的药物实体决定。“接头”通过接头上的两个结构识别位点连接由一个实体——通用免疫原引起的免疫反应与另一个实体——靶标。这些位点的第一个与免疫反应的识别组分结合。这些位点中的第二个与靶标结合。靶标结合位点可以是适配体，并且在一些实施方案中适配体在磷酸酯骨架上可包括一些或者全部修饰的磷酸酯如硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯。
发明背景
免疫已经用于保护人体和动物抵抗疾病超过了一百年。传统免疫的前提是针对抗原或者包含抗原的病原体最有效的免疫反应，在相同抗原攻击个体两次或者多次后发生。这种现象称为免疫记忆或者第二次免疫反应。当免疫成功，个体得到了保护从而免受抗原来源的病原体的影响。
例如，一旦个体成功的免疫了来源于细菌生物的抗原，该个体中的免疫反应是已接触抗原的并且当遇到细菌时就准备对该细菌应答。成功的免疫需要抗原位于细菌中位于接近个体免疫系统的区域。当免疫成功，免疫系统应答，细菌被杀死、包含、中和或者从体内清除，同时细菌生物的感染导致很少或者没有疾病。这种保护的关键是抗原免疫必须发生在暴露于抗原来源的细菌生物之前。
因此，传统免疫方法通常包括注射抗原至个体内，等待适量的时间，并且允许个体形成免疫反应。对于大多数抗原，形成免疫反应需要的时间是约两个周至几个月之间。大多数情况下，需要抗原的加强施用以维持免疫反应。这种加强一般在抗原起始施用的几周或者几个月后提供。
因此，如果暴露于抗原或者病原体之前的几个月就提供常规免疫，其在提供保护上是高度成功的，但是当个体暴露于个体以前没有暴露过的新抗原并且需要立即有效的免疫反应时，常规免疫是没有用的。此种情况一个好的实例是军队需要针对生物恐怖主义试剂的保护。尽管个体群体可以在任何潜在暴露于生物恐怖主义试剂之前接种针对此试剂的疫苗，但是常规的接种疫苗不是一个简单的答案。群体的常规接种疫苗在一些人中产生有害的反应，并且有可能群体永远不会暴露于该试剂，于是产生了风险。另外，政府在逻辑上不可能开发、生产和对重要的人员接种针对每一种可能的生物恐怖主义试剂的疫苗。需要在个体与病原体接触或者疑似接触之前或者之后立即施用的组合物，所述组合物的施用允许个体中产生立即保护性或者有效免疫反应。
以前已经构建免疫接头和通用免疫原，如完整并入本文作为参考的美国专利公开20030017165和20040146515描述，该免疫接头和通用免疫原提供基本上立即免疫。这些以前描述的免疫接头可以掺入适配体核酸作为靶结合元件。使用适配体核酸作为靶结合位点的一个缺点是核酸分子易受核酸酶的降解。这减少了这些分子的半寿期，并且进而减少了它们提供的治疗益处的持续时间。
以前的研究已经表明修饰的多核苷酸在一定程度上可以抗核酸酶的降解。寡核苷酸的修饰如寡核苷酸磷酰氧的巯化可以赋予核酸酶抗性(Gorenstein(Farschtschi，N.and Gorenstein，D.G.，TetrahedronLett.(1988)29：6843，和Nielsen，等人，Tetrahedron Lett.(1988)29：291)。多种骨架修饰如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯使该试剂有更强的核酸酶抗性(Verma和Eckstein；Annu Rev Biochem，199867：99-134)。不幸的是，具有高硫代磷酸骨架替换的寡核苷酸看起来与一般的磷酸酯相比对蛋白质“更有粘性的”，归因于可能基于磺酸化核苷酸的电荷特征的非特异相互作用。因此，巯化的ODNs增加的粘性导致特异性的丧失，从而使得通过适配体技术提供特异靶定的期望失败。特异性的丧失在DNA结合蛋白质与DNA的相互作用中是关键的，因为在蛋白质和它们的DNA结合位点之间大部分的直接接触是磷酸基。作为进一步的复杂化，已经发现某种硫取代可以导致在双链体结构中的结构干扰(Cho，等人，J.Biomol.Struct.Dyn.(1993)11，685-702)。因此核苷酸限制的巯化可能增加核酸酶的抗性，然而这不能为治疗的应用如体内施用提供可观的循环半寿期而不牺牲结合特异性。
因此需要免疫接头，其具有适配体结合位点，所述结合位点通过在多核苷酸骨架上基本上包括所有的硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯稳定化而没有减少的结合特异性。
发明概述
本发明提供了用于可编程免疫的组合物和方法，其可以提供个体针对靶标如病原体或者其他不希望物质的基本上立即免疫反应，所述免疫反应具有体内治疗应用的稳定性和靶标特异性。因为实现了立即有效的免疫反应，这些组合物可以在个体接触病原体之前的任何时间或者甚至在个体接触病原体之后施用。在一个实施方案中，本发明解决了军队面对的在保护他们的人员免受生物恐怖主义试剂危害方面的许多问题。
相对于常规免疫技术，本发明的组合物和方法也提供了一个优点，因为此方法不需要将修饰的病原体或者病原体部分施用到个体中以得到针对该病原体的有效的免疫。此外，包含适配体靶标结合位点的本文描述的免疫接头可具有修饰的磷酸酯骨架，其为体内施用提供了增加的稳定性。这些修饰包括磷酸酯骨架修饰，其包括基本上所有的硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。发现这些修饰的适配体靶标结合位点具有对于治疗施用的明显的稳定性和循环半寿期以及靶结合特异性。相对于以前描述的免疫接头，这些修饰的适配体、更特别地硫代适配体、免疫接头提供了改进，包括明显的稳定性以及伴随的结合特异性，其中所述结合特异性以前认为是一种折衷。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括免疫接头，其包含结合免疫反应组分的至少一个第一结合位点；并且包含结合靶标的至少一个第二结合位点。这些接头组合物利用个体中现有的免疫反应并且将该现有的免疫反应与不同的靶标连接，该靶标与现有的免疫反应是不相关，通过免疫接头提供的它们之间的连接除外。现有的免疫反应针对包含免疫接头的第一结合位点的抗原，并且在个体中可以通过包含第一结合位点的通用病原体的施用来诱导。免疫反应与靶标的连接允许立即的连接的免疫反应而不需要针对靶标的初次免疫反应。
免疫接头可以是化学或者生物材料的任何类型，其包括微生物、噬菌体、蛋白质、核酸、多糖、合成材料或者上述物质的组合。在一个实施方案中，至少一个第一结合位点物理的或者化学的连接或者缀合到包含至少一个第二结合位点的分子。在此实施方案中，在第一结合位点和第二结合位点之间可能存在间隔区分子。在另一个实施方案中，免疫接头是单一分子，其包含至少一个第一结合位点和至少一个第二结合位点。
在现有的免疫反应的起始或者产生之后，如果个体暴露或者疑似暴露于期望针对其的立即免疫的新的化合物或者病原体时，对个体施用本文描述的免疫接头，所述免疫接头包含相应于通用免疫原的第一结合位点以及结合新的化合物或者病原体的第二结合位点。免疫接头在一个第一结合位点结合在现有的免疫反应过程中产生的免疫反应组分，并且其也在至少一个第二结合位点处结合新的化合物或者病原体，因此提供了结合免疫接头的免疫反应组分的免疫复合体，所述免疫接头又与新的化合物或者病原体结合。个体的免疫系统识别这些免疫接头复合体并且将它们从体内除掉或者清除。
因此，通过施用包含本文描述的免疫接头的组合物，个体的现有的免疫反应从通用免疫原转向新的化合物或者病原体。如上所述，本发明的另一个优点是只需要一种起始免疫分子或者通用免疫原来引发个体免疫系统的后续抗原特异免疫反应。因此，本发明可降低为个体目前推荐或者需要的接种疫苗的数目(并且可能降低制剂的复杂性)。本发明的另一个优点是免疫接头和通用免疫原制备的容易性。本发明的免疫接头可容易装配并且提供给卫生保健专家用于对这些公共卫生需要如大范围传染、生物恐怖主义的威胁或者特异病原体的有限爆发的快速反应。本发明的另一个优点是个体可以免疫的化合物的广泛性。免疫接头可以制备成与任何化合物或者外源物质如抗原、病原体、化学物或者内源物质如病毒感染或者癌症中发现的改变的细胞结合。
本发明可以使用个体中存在的免疫反应并且将免疫反应转向至不同的靶标以提供稳定的和特异的立即免疫。因此，如果个体已经免疫了特定的抗原，可以制备免疫接头分子，其具有包含或者相应于个体免疫所针对抗原的第一结合位点并且具有针对不期望的病原体、化学物或者试剂的第二结合位点。
在阅读了公开的实施方案的以下详细描述后，本发明的这些和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。
附图简述
图1.在70％的胎牛血清存在下或者核酸酶存在下，提供未修饰(UN)和修饰的(硫代磷酸酯(PA)适配体混合物的图像。
图2.提供了条形图，其显示单独培养基(对照)、单独致死毒素(LeTx)或LeTx与非硫化修饰的保护抗原适配体组合(Thio Apt/LeTx)的细胞毒性效应。分别在鼠巨噬细胞(RAW 264.7细胞)上在温育过夜后，加入到细胞的单独的LeTx或者与非硫化修饰或者硫化修饰的适配体混合的LeTx(LeTx O/N，Reg Apt/LeTx O/N，Thio Apt/LeTx O/N)。攻击后24小使用XTT细胞增殖测定评估细胞存活力。
图3.提供了用和不用多西环素和巯化的抗致死因子免疫接头，暴露于炭疽芽孢杆菌的小鼠组的存活曲线图。
发明详述
本发明涉及用于立即免疫人或者动物的组合物和方法，所述免疫针对本文称作靶标的任何分子或者有机物。这称作化学可编程免疫或者可编程免疫。可编程免疫与经典免疫的不同在于可编程免疫允许针对一种抗原的现有的免疫转向针对靶标。使用本发明的免疫接头使免疫反应转向。
除非上下文清楚指出，本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“这个”包括复数指代。因此，例如参考“一个化合物”是针对一个或者多个这样的化合物的指代并且包括本领域技术人员已知的等同物等等。
本发明的免疫接头包含至少两个位点；(1)结合个体中的至少一种免疫反应组分的第一结合位点，以及(2)结合靶标的第二结合位点。在免疫接头施用于个体之前在个体中就存在免疫反应组分。例如，免疫反应组分可以是以前免疫反应的部分的抗体，所述以前免疫反应针对第一结合位点，或者一个分子，或者一大组分子，或者甚至是包含第一结合位点的微生物。因此，术语“现有的免疫反应”指的是针对第一结合位点或者与第一结合位点免疫学相似表位的免疫反应。也就是说，“现有的免疫反应”是这样的免疫反应，其中产生或者存在与第一结合位点结合的免疫反应组分。现有的免疫反应可以通过以前施用给个体相应于第一结合位点的通用免疫原产生或者不用这样施用就在个体中存在。
因此，本发明包括将个体中的现有的免疫反应从针对第一个抗原转向至针对靶标的方法，其包括向个体施用有效量的包含一种或多种免疫接头的组合物，其中所述接头包含至少一个第一结合位点和至少一个第二结合位点，并且其中所述第二结合位点结合靶标，并且其中所述第一抗原包含第一结合位点或者其免疫等同物。本发明也包含增强针对靶标的免疫反应的方法，其包括向个体施用有效量的包含一种或多种免疫接头的组合物，其中所述接头包含至少一个第一结合位点和至少一个第二结合位点，并且其中第二结合位点结合靶标，并且其中所述个体具有针对第一结合位点或者它的免疫等同物的现有的免疫反应。
通用免疫原
“相应于”第一结合位点的通用免疫原可以与第一结合位点相同、可以包含整个第一结合位点、可以包含第一结合位点的部分或者可以是第一结合位点的免疫等同物。当涉及两个或者多个分子时，术语“免疫等同物”此处指相同免疫反应组分结合的分子。本发明只需要由通用免疫原产生的免疫反应组分也结合第一结合位点。在一个实施方案中，通用免疫原以足够的亲和力结合免疫反应组分，导致能起始或者参与免疫反应的复合体的产生。在一个优选的实施方案中，免疫反应组分与非通用免疫原和非第一结合位点的分子的交叉反应最小。
通用免疫原可以是任何分子、生物或者化合物，个体形成针对该通用免疫原的免疫反应并且该通用免疫原可以通过任何途径施用。通用免疫原可以是但不限于分子、微生物、毒素或者来自其的类毒素、蛋白质或者多肽、多核苷酸、多糖、合成材料或者上述物质的组合。优选地，通用免疫原在个体中引起提供长期免疫记忆的免疫反应，所述通用免疫原可以以加强剂量再次施用于个体并且不会在个体中引起疾病、病理或者长期患病。包含病原体的部分或者病原体的修饰部分的免疫原可以是通用免疫原，然而除了通用免疫原引起的互补免疫反应，它不需要与任何事物有关。例如，人类通常用来自腮腺炎病毒、麻疹病毒、破伤风类毒素和脊髓灰质炎病毒的免疫原性抗原免疫。动物，如猫和狗通常用来自狂犬病病毒的免疫原性抗原来免疫。这些以及其他的常规免疫原可以用作通用免疫原，然而这将是方便性的问题而不是必要性的问题。
备选地，非常规免疫原可以用作通用免疫原。优选地，非常规免疫原不包含病原体的部分或者修饰部分。在一个实施方案中，通用免疫原是半抗原结合的蛋白质或者蛋白质的部分。“半抗原”此处定义为与特异抗体反应的分子，但是其在结合载体蛋白或者其他大的抗原分子之前不能诱导额外的抗体的形成或者产生。大部分半抗原是小分子，但是一些大分子也可以行使半抗原的功能。在一个实施方案中，用于证实目的进行并且如本文实施例1描述，半抗原是苯胂酸盐并且通用免疫原是苯胂酸化蛋白质。
在另一个实施方案中，通用免疫原包含噬菌体或者噬菌体表位。免疫反应组分可以结合噬菌体的任何部分，并且在一个实施方案中所述免疫反应组分结合噬菌体表面上表达的肽。噬菌体通用免疫原可以通过任何途径施用于个体，并且在一些实施方案中，噬菌体可以包含于细菌中作为方便的施用手段。
第一个和第二结合位点以及免疫接头间隔区
本发明能将针对通用免疫原的现有的免疫反应转向针对不同的抗原，部分是因为通用免疫原对应于免疫接头的第一结合位点。因为第一结合位点是通用免疫原和免疫接头分子的一部分，针对通用免疫原的现有的免疫反应或者现有的免疫系统组分也识别免疫接头。免疫接头的第一结合位点可以包含多肽、多核苷酸、多糖、有机化学品、微生物如噬菌体、细菌、病毒或者病毒颗粒、或原生动物、前述的任何片段或者部分、前述的任何组合或者被个体免疫系统识别或者个体中的免疫反应组分结合的任何其他组合物。
在一个实施方案中，第一结合位点是寡糖如α-Gal表位，即半乳糖基-α-1，3-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖。在另一个实施方案中，第一结合位点包含噬菌体的部分，更优选地包含在噬菌体表面表达的多肽。
第二结合位点可以包含多肽、多核苷酸、多糖、有机化学品、微生物如噬菌体、细菌、病毒或者病毒颗粒、原生动物、前述的任何片段或者部分、前述的任何组合或者与靶标结合的任何其他组合物。在一个特别的实施方案中，第一结合位点和第二结合位点包含在相同的微生物中。如本文使用的多核苷酸或者核酸指的是任何链构象的DNA或者RNA，如，单链、双链、三链或者上述物质的任何化学修饰，并且考虑核酸相关的蛋白质的存在或者缺失。化学修饰可以在核酸的扩增或者合成前在个别的核苷酸中，或者在核苷酸掺入多聚体后加入到核苷酸中。此类修饰包括但不限于在胞嘧啶、外环胺的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、异常的碱基配对组合和本领域技术人员已知的其他修饰。在一个实施方案中，第二结合位点包含抗体或者抗体片段，优选地包含抗体可变区的抗体片段，并且更优选地Fab片段。在另一个实施方案中，第二结合位点包含噬菌体表达的多肽，并且更优选地表达在噬菌体表面的多肽。
在一个实施方案中，骨架修饰是包括硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯可以包括在基本上在多核苷酸磷酸骨架的全部或者磷酸骨架的部分中。在一些实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或者99％的磷酸骨架被巯化了。预期磷酸骨架被巯化而不用牺牲与靶标的结合特异性。多核苷酸巯化的一个优点是增加了对核酸酶降解的抗性，其增加了半寿期以及本文描述的免疫接头提供的治疗益处的持续时间。
如上所述，免疫接头包括任何类型分子或者生物，其包含能结合免疫反应组分的第一结合位点，并且包含能结合靶标的第二结合位点。在一些实施方案中，免疫接头可以包含超过一个的第一结合位点和/或超过一个的第二结合位点。多个第一结合位点可以相同或者不同。多个第二结合位点也可以相同或者不同。结合位点在与不同分子的特异性或者与相同分子的亲和力中可以不同。免疫接头也可以经修饰以减少它自己的免疫原性。
第一个和第二结合位点分别与免疫反应组分以及靶标的结合可以通过任何相互作用完成，该相互作用包括通过其他分子如多糖或者核酸提供的结合。在一个优选的实施方案中，第一结合位点是免疫反应分子特异的并且第二结合位点是靶标特异的。如上所述，当一个分子与另一个分子以足够的亲和力结合导致用于免疫系统目的的功能性复合体的产生时，所述一个分子是另一个分子特异。在一个进一步优选的实施方案中，一个第二结合位点与非靶标的分子的交叉反应性是最小的。在另一个优选的实施方案中，一个第一结合位点与非免疫反应组分的分子的交叉反应是最小的。
在对个体施用免疫接头后，形成了包含免疫反应组分、免疫接头和靶标的免疫接头复合体。免疫接头与免疫系统组分的结合之前或之后，免疫接头可以结合靶标。在免疫接头复合体的形成之后，靶标通过免疫系统途径清除。抗原的“清除”此处指的是抗原的除去、失活或者修饰以使它不再对机体有害。
在另一个实施方案中，免疫接头包含第一结合位点，其相应于α-半乳糖基或者α-Gal，如Galili，U.和Avila，J.L.，Alpha-Gal，SubcellularBiochemistry，Vol.32，1991中描述的表位。异种移植研究已经确定人形成针对α-半乳糖基表位的免疫反应，其在人体中不常发现但在其他的动物和许多微生物中发现。在本发明一个特别的实施方案中，α-半乳糖基表位缀合到包含抗体的Fab片段或者巯化的适配体多核苷酸的第二结合位点。
在另一个实施方案中，免疫接头包含噬菌体。第一结合位点可以相应于噬菌体的任何部分，但是优选地相应于噬菌体表达的第一条多肽。噬菌体上的第二结合位点相应于结合靶标的第二个和不同的噬菌体表达的多肽。第一条和第二条多肽都在噬菌体表面表达。
下面的实施例3提供了噬菌体免疫接头的实例，其可以与噬菌体通用免疫原结合使用。在一些实施方案中，免疫接头包含通过噬菌体淘选方法从野生噬菌体得到的重组噬菌体。第一结合位点由野生噬菌体的任何部分组成，所述部分在受试者最初暴露于野生噬菌体时有免疫原性功能的并且仍被重组噬菌体保留作为接头使用。在重组噬菌体上用作接头的第二结合位点相应于重组噬菌体表达的肽，所述肽被选择是因为它结合靶标。
在另一个实施方案中免疫接头是作为第一结合位点的α-Gal表位和作为第二结合位点的合成肽的缀合物，所述合成肽的序列源于噬菌体淘选实验，其中通过附着到固相支持体的期望抗原，从展示重组噬菌体集合的随机肽库中淘选所述合成肽。
在其他实施方案中，第一个和/或第二结合位点包含适配体核酸，并且更优选地通过SELEX方法产生的适配体。SELEX代表通过指数富集的配体的系统性进化。SELEX方法在本领域已知并且至少在下列出版的美国专利中描述：美国专利号5,475,096；6,261,774；6,395,888；6,387,635；6,387,620；6,376,474；6,346,611；6,344,321；6,344,318；6,331398；6,331,394；6,329,145；6,300,074；6,280,943；6,280,932；6,261,783；和6,232,071。
一般，SELEX方法涉及鉴定特异地结合三维靶标的核酸。核酸具有足够的能力用于形成多种二维和三维结构，并且在它们的单体中可得到足够的化学多样性以至可以发现一些序列几乎特异地结合任何化学化合物。为生物液体中稳定的目的，优选的适配体包含一个或者多个修饰的核苷酸如2’-氟或者2’-氨基-2’-脱氧嘧啶。在体内使用这些碱基的核酸比天然形成的核酸更稳定。见M.Famulok和G.Mayer，Cur.Top.Micro.Immunobiol.243：123-146，1999。通过相似方法得到的Spiegelmers(见Vater，A.和Klussmann，S.Current Opin.Drug DiscovDevel.2003Mar；6(2)：253-61)也因为它们在血清中固有的稳定性而被使用。
在一个实施方案中，用于SELEX方法的寡核苷酸文库用来自Roche(曼海姆市，德国)的通过商业途径可得到的试剂盒如GS FLXTitanium系列方案和试剂如扩增子文库制备方案制备。GS FLX Titanium融合引物(Roche，曼海姆市，德国)可以用于对鉴定出的适配体测序，尽管其他测序方法在本领域已知并且也可以使用。
如上所述，本发明包括基本上由所有巯化的核苷酸制成的免疫接头适配体。(见美国专利号6,867,289；Yang，等人，J.Bioorganic &Med.Chem.Lett(1997)7：2651；美国专利号5,218,088；Nielsen，等人Tetrahedron Lett.(1998)29：2911：))其在本文中整体并入作为参考)。硫代磷酸酯的核苷酸间的连接比磷酸二酯键对核酸酶更稳定，这种特征使它在细胞培养和体内使用中有用。通过制备具有巯化核苷酸的适配体，得到的巯化免疫接头一般在体内具有更长的半寿期，因此增加了巯化免疫接头的有效活性。如上文所述，巯化适配体免疫接头可以包含基本上全部巯化的核苷酸或者可以包含巯化核苷酸的部分。
在一个特定的实施方案中，免疫接头分子包括第一结合位点，其具有通过连接分子或者直接的共价键连接第二结合位点的α-半乳糖基表位。第二结合位点包括针对炭疽病致死因子的适配体并且具有如下的序列：
5’-GGG GTT TTT GTT TTT TTC TT TTT CTC ACT CTA TTTTTCTGT3’-C3-OH(SEQ ID NO：1)
适配体多核苷酸任选地通过磷酸骨架的巯化修饰以提供更长的半寿期以便延长持续时间，通过所述磷酸骨架的巯化修饰免疫接头具有治疗效应。
此处描述的第一和第二结合位点可以通过本领域技术人员已知的任何方法连接或者缀合。术语“缀合的”或者“缀合”此处定义为指共价或者其他形式连接两个或者多个分子。缀合可以通过任何方法包括但不限于化学方法、基因工程方法或者通过体内生物学方法实现。第一和第二结合位点可通过双链核酸、多肽、化学结构、或者任何其他合适的结构连接，或者通过简单的化学键连接。
在一个特别的实施方案中，接头的第一和第二结合位点在体外以如此方式进化，所述方式使得在第二结合位点结合靶标后第一结合位点只与免疫反应组分相互作用。导致这种行为的别构作用在蛋白质和其他大分子中是众所周知的，并且接头的在体外进化中可以是选择方法的组分。
免疫反应组分
如上所述，免疫接头的一个或者多个第一结合位点结合免疫反应组分。此处使用的术语“免疫反应组分”指的是个体免疫反应中涉及的任何分子或者细胞。术语“个体”包括动物和人。免疫反应组分的非限制性的实例是抗体、淋巴细胞，包括但不限于T细胞、B细胞和自然杀伤细胞、巨噬细胞、粒细胞，包括但不限于嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞、和任一前述细胞上的受体，包括但不限于T细胞受体和B细胞受体。术语抗体包括抗体的所有类型和亚类，Ig G、Ig M、Ig A、IgD、IgE等，抗体的分泌型和排出型，抗体片段，包括可变区、高变区和恒定区、重链和轻链、片段组合和片段混合物和完整抗体。这些抗体可以是人源化的、多克隆或者单克隆的、天然来源的或者合成的抗体。
在一个实施方案中，至少一个第一结合位点结合免疫反应组分的活性结合位点。例如，如果免疫反应组分是如Ig G分子的抗体，那么免疫接头的第一结合位点是抗原表位，Ig G分子可变区的活性结合位点通常结合所述抗原表位。
靶标
免疫接头的一个或多个第二结合位点结合靶标，并且优选地第二结合位点是该靶标特异性的。此处术语“靶标”指的是任何组合物，个体中增强其的免疫反应是所期望的。
在一个实施方案中，抗原是还没有暴露于对象个体的化合物或者生物。然而，抗原也可以是化合物或者生物，该化合物或者生物已经暴露于对象个体但还没有形成针对该化合物或者生物的最优免疫反应。
靶标包括但不限于微生物、病原体、病毒、病毒颗粒、细菌、多肽、有毒化学品、非自身分子和上述物质的任何片段、部分或者组合。此处使用的靶标也包括在个体中免疫反应通常不靶定的分子或者组合物，如识别为自身的分子、太小不能引起免疫系统应答的分子、非免疫原性的化合物或者化学物、和与免疫系统的免疫原性组分隔离的分子或者物质。在一个实施方案中，靶标是免疫系统的抗体或者细胞组分，个体想要将其除去以减轻自身免疫病症。
在另一个实施方案中，靶标是细菌毒素。这些细菌毒素包括但不限于破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、霍乱毒素、毒素B、毒素A、fragilysin(来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、致死因子、水肿因子、来自炭疽杆菌的保护性抗原、来自大肠杆菌的热不稳定毒素和热稳定毒素、来自索氏梭菌(C.sordelli)的致死毒素或者出血性毒素。其他产毒素的细菌和它们的毒素在下表1中提供。
表1：产毒素细菌和它们的毒素
Figure BDA0000122348380000131
Figure BDA0000122348380000141
免疫接头群体
如上文指出，本发明的免疫接头可以具有超过一个第一结合位点和/或超过一个第二结合位点。本发明也包括一种或多种免疫接头群体的用途，其中每个群体具有不同的第一结合位点和/或第二结合位点。多个结合位点在它们对不同分子或者表位的特异性或者它们对相同分子或者表位的亲和力上可以不同。在本发明的一个实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第二结合位点，每个特异地针对不同靶。在另一个实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第二结合位点，每个特异地针对相同靶上的不同表位。在另一个实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第二结合位点，每个特异性地针对靶标上的相同表位但是具有对靶标不同的亲和力。
在其他的或者另外的实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第一结合位点，每个能结合不同的免疫反应组分。在另一个实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第一结合位点，每个能结合相同免疫反应组分的不同亚结构。在另一个实施方案中，免疫接头包含两个或者多个第一结合位点，每个能结合免疫反应组分的相同亚结构但是具有与免疫反应组分不同的亲和力。
本发明的免疫接头可以具有前述多个第一结合位点和第二结合位点的任何组合。本发明也包括免疫接头不同群体的施用，每个群体具有前述多个第一结合位点和第二结合位点的任一组合。
在一个实施方案中，免疫接头群体施用给个体，其中每个接头具有相同的第一结合位点，并且第二结合位点都是适配体，它们与相同的靶标结合，但是对该靶标具有不同的亲和力。在另一个实施方案中，将免疫接头群体施用于个体，其中所述每个接头具有相同的第一结合位点，并且第二结合位点都是结合不同靶标的抗体或者抗体部分。在另一个实施方案中，群体的免疫接头都具有相同的第一结合位点和不同类型的第二结合位点，即抗体结合位点，适配体结合位点等，其中每个第二结合位点特异性的针对相同的靶标或者不同的靶标。
本发明预期免疫接头群体，其包含至少本文描述的一个第一结合位点。这种群体可以具有免疫接头，其都具有第一结合位点，所述第一结合位点具有相同的结合特异性或者结合特异性的组合。此外，结合可以通过相同类型的第一结合位点，如所有全是核酸分子或者蛋白质实现，所述第一结合位点可以具有相同或者不同的结合特异性。结合可以通过一个免疫接头上不同类型的第一结合位点或者具有不同的第一结合位点的不同免疫接头群体实现。不同类型的第一结合位点可以具有对一个或者多个免疫反应组分相同或者不同的结合特异性。
另外，本发明预期免疫接头群体，其包含至少一个本文描述的第二结合位点。这种组合物包含免疫接头，其都具有第二结合位点，所述第二结合位点具有相同的结合特异性或者结合特异性的组合。此外，结合可以通过相同类型的第二结合位点如所有全是核酸分子或者蛋白质实现，所述第二结合位点可具有相同或者不同的结合特异性。结合可以通过一个免疫接头上不同类型的第二结合位点或者具有不同第二结合位点的不同免疫接头群体实现。不同类型的第二结合位点可以具有对一个或者多个靶标相同或者不同的结合特异性。
因此，组合物包含免疫接头，其中至少一个第一结合位点的结合特异性和至少一个第二结合位点的结合特异性都是一致的，就是说，每个第一结合位点对它的结合配偶体具有相同的结合特异性，并且每个第二结合位点对它的结合配偶体具有相同的结合特异性。备选地，组合物可以包含多个免疫接头群体，每个群体具有不同结合特异性的第一结合位点并且还具有不同结合特异性的第二结合位点。
使用方法
本发明包括将个体中的现有的免疫反应从第一个抗原转向至第二个靶标的方法和组合物。因为第一个抗原或者第一个抗原的免疫等同物在接头分子中存在，免疫反应的“转向”不需要终止针对第一个抗原的免疫反应。本发明进一步地提供了在个体中增强针对靶标的免疫反应的方法和组合物。以前的对靶标的免疫反应在个体中可以已经存在或者不存在。本发明还为个体提供了化学可编程的免疫，其提供了针对病原体或者其他不希望的物质的个体立即和特异的免疫。
按照本发明，个体首先用通用免疫原免疫。简单地通过给个体施用包含免疫接头的组合物然后可以使个体立即针对选择的靶标免疫，所述免疫接头具有结合免疫反应组分的至少一个第一结合位点和结合靶标的第二结合位点。本文描述的通用免疫原和免疫接头的任何组合都可以使用，只要求免疫接头的第一结合位点被由通用免疫原的接种导致的免疫反应组分的一些所结合。针对通用免疫原的免疫可以由意向接种的结果而发生或者在α-Gal表位以及其伴随的抗Gal免疫的情况下通过自然过程发生。
在军队中本发明可能特别有用，其中部队可能意外地暴露于病原体、毒素或者有毒化学物质。军事人员用相应于免疫接头的第一结合位点的通用免疫原预先免疫。如果病原体、毒素或者化学试剂意外地攻击接触或者被认为攻击军事人员，将具有与病原体、毒素或者化学试剂结合的第二结合位点的免疫接头施用于军事人员，从而立即保护他们免受病原体的危害。
本发明可以用于预防和/或治疗来自生物的疾病或者感染，所述生物包括但不限于炭疽、登革病毒和马堡病毒。例如，通过检测作战地带的炭疽菌，将特异地针对炭疽菌的免疫接头口服地施用于以前免疫过通用免疫原的军队和平民从而赋予了针对炭疽菌的保护。只要人员持续维持体内免疫接头的浓度，免疫一直持续。在一个实施方案中，将免疫接头在持续的基础上施用于个体以维持免疫接头足够的体内浓度。免疫接头可以以任何间隔包括但不限于每小时、每天、每周或者每月的间隔施用。在免疫接头必需长期施用的情况下，寻找第二结合位点自身不是免疫原性的接头。一旦威胁过去，免疫接头的施用就停止。因此本发明可能的副作用是短暂的，不像常规免疫，其在受免疫的人或者动物中经常产生长期的副作用或者并发症。
关于更一般的群体，药房可以具有为多种不同的病原体和有毒物质可用的不同免疫接头的文库。一旦个体用通用免疫原预先免疫，这些不同的免疫接头的一种或者多种的施用导致针对多种不同的病原体和有毒物质的保护性免疫反应的产生。
用本发明可治疗感染的一个实例是流行性感冒或者流感病毒的感染。通过使用本发明的免疫接头，每年不需要开发对该年新的流感病毒株应答的新疫苗株。只有免疫接头的一部分需要改变，因为流感病毒改变了它的抗原标记。每年至少一个第二结合位点可以改变或者按照需要改变为结合出现的新流感病毒。优选地，至少一个第二结合位点是由修饰的核苷酸制成的DNA适配体。这些DNA分子对代谢酶非常稳定。例如，个体可以吸入具有合适的第一和第二结合位点的免疫接头组合物来阻止流感病毒的吸附和感染。这种吸入治疗只要必要就持续，并且当流感季节过去时停止。
本发明进一步地包含从人体或者动物体内除去其他不需要物质的方法，其通过施用包含免疫接头的组合物实施。免疫接头可用于除去身体合成的或者体内发现的过量的或者不需要的分子或者化学物，其包括但不限于蛋白质、脂肪、核酸多聚体、激素、细胞因子、神经化学物质、有毒细胞因子、凋亡因子、细胞信号分子、抗体或者不需要的细胞、矿物质如钙或镁以及包含这些和其他分子的组合或者混合的化合物。期望在一些情况下，复合方法可以用于除去不需要的细胞，如通过使它们对免疫接头的结合敏感的方式进行。免疫接头可以用于除去来自身体的任何不需要的物质，其通过提供结合不需要的物质的第二结合位点和使用结合免疫反应组分的第一结合位点以便机体的天然清除机制参与除去不需要的物质来实施。可被第二结合位点结合的任何物质可通过本发明的方法影响或者除去，因此受影响或者除去的物质列表只受限于提供不需要的物质的结合配体的能力。提供不需要物质的结合配体的方法在技术人员的能力范围之中，并且所述方法包括本文讨论的方法和本领域技术人员使用的其他方法。
如果免疫反应已经直接被不需要的物质引起，通过化学可编程免疫的方法和组合物，免疫反应可以用于清除或者包含这些不需要的物质。例如，包含免疫接头的抗体复合体通过机体的免疫清除机制除去，所述免疫接头在一个位点结合抗体并且在另一个位点结合不需要的物质。靶标的包含可以包含如其中细胞在与不需要的物质结合的免疫接头的周围隔开或者形成屏障的机制，类似于用于隔开结核病原体的细胞反应。在一些方法中，人工机制如血浆去除术(其中血液或者其他液体在体外过滤)可以用于捕获与免疫接头形成的免疫复合体或者细胞复合体。可以使用结合的免疫接头的特异性地去除，例如使用针对免疫接头自身的抗体通过使用柱或者分离系统。
因此，本发明可以用于多种感染、疾病或者状况的治疗。此处使用的术语“治疗”以及类似的词语通常指的是取得期望的药理学效应和/或生理效应。效应在完全地或者部分地将免疫从一个抗原转移至另一个方面可以是预防性的和/或者在部分或者全部的稳定或者治愈疾病和/或对疾病的不利作用方面是治疗性的。此处使用的“治疗”覆盖了使用针对一种抗原的免疫反应来控制另一种抗原或者其在受试者特别是人中的效应如疾病的治疗，并且所述治疗包括：a)阻止疾病或者症状在受试者中的发生，该受试者易感染这种疾病或者症状，但是还没有诊断出患病；(b)抑制疾病症状，即阻止它的发展；或者(c)减轻疾病症状，即引起疾病或者症状的消退。术语“治疗”以及类似的词还包括不需要物质的减少、控制或者包含，所述不需要物质包括个体中的抗原。物质的减少可以通过任何方法来测定。
表述“治疗有效量”指的是例如本文公开的组合物的量，其有效地阻止、改善、治疗或者推迟疾病或者状况的发作。“预防有效量”指的是例如本文公开的组合物的量，其有效地预防疾病或者状况。
施用方法
按照本发明，在相应的免疫接头施用之前将通用免疫原施用于个体。通用免疫原可以在相应的免疫接头施用之前的任何时间施用并且可以在在相应的免疫接头施用之前多次施用。这些多次施用可被称作“加强”施用。本发明预期的一种方法包括不同的通用免疫原的多次施用。通过不同的通用免疫原的多次施用，增加了可能的免疫接头的所有组成成分。
免疫接头的多次施用也包括在本发明中。方法包括使用一种通用免疫原免疫个体之后相同或者不同的免疫接头的一次或者多次施用。方法还包括使用一些不同的通用免疫原免疫个体之后相同或者不同的免疫接头的一次或者多次施用。
优选地只要需要并且在合适的间隔内将免疫接头施用于个体以维持免疫接头体内适当的浓度来治疗感染或者疾病或者从个体中除去足够量的不需要的物质。免疫接头可以以任何间隔施用，所述间隔包括但不限于每小时、每天、每周或者每月的间隔或者其任何划分。适当的施用间隔可由本领域的技术人员确定，并且其基于靶标或者病原体的身份、个体中检测的靶标或者病原体的量、暴露持续时间、免疫接头的药物代谢动力学、个体的特征如年龄、重量、性别等、以及任何其他相关的因素。免疫接头的施用时间需要靠经验决定并且随着特定的病原体、毒素等、暴露持续时间、接头药物代谢动力学等而不同。
包含含有巯化的磷酸酯骨架的经修饰的适配体的免疫接头的使用是有利的，因为巯化磷酸酯的使用增加了适配体对核酸酶消化的抗性。因此，巯化的适配体免疫接头在循环中具有更长的半寿期和更长的治疗益处的持续时间。在靶标的感染/侵入阶段中这减少了免疫接头多次后续施用的需要。
使用适当的途径将本发明的通用免疫原和免疫接头施用于个体。适当的施用途径包括但不限于经口、吸入、肠胃外的、皮下、肌内的、静脉内的、关节内、支气管内的、眼内的、腹腔内的、囊内的、软骨内的、腔内的、体腔内的、小脑内的、脑室内的、结肠内的、颈内的、胃内的、肝内的、心肌内的、骨内的、盆腔内的、心包内的、腹膜内的、皮下的、胸膜内的、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、直肠内、脊柱内、滑膜内、胸腔内的、子宫内的、膀胱内的、弹丸、阴道、直肠、口含、舌下的、经粘膜的、鼻内的、离子电渗疗法、和经皮的方式。免疫反应的不同类型有时通过抗原施用的不同途径触发，并且本领域的技术人员知道特定免疫反应的优选途径。本发明不受限于通用免疫原或者免疫接头的施用途径。
关于噬菌体接头分子和噬菌体通用免疫原，两者都可以以纯化的噬菌体或者包含噬菌体的细菌克隆施用。在一个优选的实施方案中，裂解的噬菌体作为细菌内的一部分或者包含在细菌中施用于个体。噬菌体可以通过已知的施用方法递送，该施用方法允许针对靶标的最优的反应。
本文描述的组合物还预期包括药物组合物，其包含免疫接头或者通用免疫原以及至少一种任何适合辅料，所述辅料如但不限于稀释剂、黏合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等等。可药用辅料是优选的。制备这种无菌溶液的实例和方法在本领域是已知的并且在众所周知的课本如但不限于REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES(Gennaro，Ed.，18th Edition，Mack Publishing Co.(1990))中找到。可药用载体可以常规地选择，其适合于施用方式，溶解性和/或化合物的稳定性。本发明中有用的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂类和糖类。包含本发明化合物的药物组合物也可以包括缓冲剂或者pH调节剂。另外，本发明的药物组合物可以包括聚合的赋形剂/添加剂。
此处使用的术语“佐剂”是与通用免疫原混合后增加或者另外修饰了产生的免疫反应的任何物质。本领域已知的任何佐剂系统可以用于本发明的组合物中。这些佐剂包括但不限于，弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、多分散的β-(1，4)连接的乙酰化甘露聚糖(“Acemannan”)、TitermaxR(来自CytRx公司的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物佐剂)、来自Chiron公司的修饰的脂类佐剂、来自Cambridge Biotech的皂苷衍生物佐剂，灭活的百日咳包特氏菌，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、大的聚合阴离子如葡聚糖硫酸酯以及无机凝胶如明矾、氢氧化铝或者磷酸铝。
对于口服施用，药物组合物可以为片剂或者胶囊剂的形式，如每个包含了免疫接头预定量的分离单位如胶囊剂、扁囊剂或者片剂；粉剂或者粒剂；在含水液体或者不含水的液体中的溶液剂或者混悬剂；或者水包油型乳剂或者油包水型乳剂和作为大丸药的形式等。片剂可以任选地与一种或者多种辅助成分通过压缩或者制模生产。片剂任选地可以被包衣或者有刻痕并且可以经配制以便提供其中活性成分的缓慢的或者可控的释放。在一个实施方案中，免疫接头或者通用免疫原通过口服施用噬菌体免疫接头或者噬菌体通用免疫原感染的大肠杆菌提供。
另外，本发明的组合物或许可以掺入生物可降解的聚合物，其允许免疫接头的持续释放，例如植入聚合物用于免疫接头的缓慢释放。生物可降解聚合物和它们的用途例如在Brem等人，74J.NEUROSURG.441-46(1991)中详细描述。
适合肠胃外施用的制剂包括含水的和不含水的无菌注射溶液，其可包含使制剂与预期的接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；和含水和不含水的无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以在单剂量容器中或者多剂量容器中存在，例如密封的安瓿和小瓶里，并且可以在冷冻干燥(冻干)的情况下贮存，只需要在临使用前加入无菌液体载体例如注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以从前面描述类型的无菌粉剂、粒剂和片剂制备。
适合在口中局部施用的制剂包括锭剂，其在增香的基质，通常蔗糖和阿拉伯胶或者西黄蓍胶中包含成分；软锭剂，其在惰性基质如明胶或者甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分；和漱口剂，其包含将在合适的液体载体中施用的免疫接头或者通用免疫原。液体形式可包括合适香味的悬浮或者分散的试剂如合成的和天然的树胶，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等等。直肠施用的制剂可以为具有合适基质的栓剂，所述基质包含例如可可脂或者水杨酸盐。适合阴道施用的制剂以子宫托、tamports、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或者喷雾制剂存在，其除了活性成份之外还包含在本领域认为是适当的载体。
本发明的组合物也可被捕获在例如通过凝聚技术或者界面聚合制备的微胶囊剂(例如分别为羟甲基纤维素或者明胶微胶囊剂和聚(甲基丙烯酸酯)微胶囊剂)，在胶体药物运输系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒剂和纳米胶囊剂)或者粗乳状液中。REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(A.Osol ed.，16th ed.(1980))。
本发明提供了稳定的制剂以及防腐溶液，和包含防腐剂的制剂以及适合药物或者兽医使用的多用途防腐制剂，在可药用的制剂中包含本文公开的免疫接头组合物。
一般，本文公开的组合物可以单独使用或者与治疗剂以常规测试定义的适合的剂量一起使用以得到最优的功效同时使任何潜在的毒性最小。利用本发明的组合物的剂量方案可以根据多种因素来选择，所述因素包括患者的类型、种类、年龄、重量、性别、医疗条件、待治疗状况的严重性、施用途径、患者的肾和肝功能以及使用的特定的组合物或治疗剂。一般的内科医生或兽医可以容易地决定和开出预防、抵制或者抑制状况进展所需的免疫接头和/或通用免疫原的有效量的处方。
当联合实现期望的效果时，本文公开的组合物的剂量可以调整。确定公开的药物组合物用于治疗和预防疾病目的有效剂量的方法在本领域是已知的。更具体地，药物组合物可以以单剂量或者每日单剂量施用，或者每日总剂量在一天中分成2、3或者4次的分份剂量施用。组合物的剂量可以在从每个个体约0.0001至约1000mg的宽范围内改变或者直到实现有效的反应。范围可能更特定地从约0.001mg/kg至10mg/kg体重，对于成人(约60kg)约0.1-100mg，约1.0-50mg或者约1.0-20mg。组合物可以按照每天约1至约10次的方案施用，持续一天或者多天，或者每周一次或者每个月一次直到实现有效的反应。在几周或者几个月中，本发明的药物组合物至少每周施用一次。从细胞培养测定和动物研究得到的数据可用于配制用于人体的剂量范围。
另外，本发明的组合物和其他治疗剂的共同施用或者顺序施用是所希望的。本文描述的组合物可以在任何其他治疗剂施用的期间、之前或者之后施用。
制备方法
免疫接头可以以多种方式制备，其中一些在本文描述并且不认为限制了制备免疫接头的方法。通用免疫原或者第一结合位点可以如用已知的化学缀合方法或者分子物理上连接或者缀合到分子或者生物，该分子或者生物具有结合靶标的至少一个第二结合位点。在另一个实施方案中，免疫接头可以生产或者制备成包含第一和第二结合位点的单个分子。免疫接头也可以包含生物。在另一个实施方案中，免疫接头由两个活性结合位点组成，其通过刚性或者柔性的间隔区如RNA或者DNA的双螺旋区相互连接。间隔区的功能是将接头的两端结合在一起，从而防止它们相互作用。
本发明的第一和第二结合位点可以通过任何方法鉴定和分离。分离靶标或者免疫反应组分的结合部分的方法可以使用如Mario Geysen的方法确定。Geysen，等人，PNAS 198481(13)：3998-4002和Geysen，等人，J.Immunol.Methods.1987，102(2)259-74描述了使用Geysen的pin装置的肽合成和筛选的早期方法。原始方法的改进和方法的应用在很多出版物中教导，其包括但不限于出版物如Geysen，等人，Chem.Biol.1996，3(8)：679-88；Schultz等人，Biotechnol.Prog.，1996，12(6)：729-43；Carter，JM，Methods Mol.Biol.1994，36：207-23(Geysen PEPSCAN procedure)；Int.J.Pept.Protein Res.1993，42(1)：1-9；Wagner等人，Comb.Chem.High Throughput Screen 19981(3)：143-153；Edmundson，等人，Proteins，1993，16(3)：246-67；Alexander等人，PNAS 199289(8)：3352-6；Edmundson，等人，Ciba Found.Sump 1991，158：213-25；Rodda等人，Australas Bioechnol.1993，3(6)346-7；Tribbeck等人，J.Immunol.Methods.1991，139(2)155-66；Smith，G.P.，Curr.Opin.Biotechnol.1991，668-73。
这些组合合成方法可以用于快速确定在结合靶标中行使第二结合位点功能的结合肽。随机产生的肽也可以快速检测其与靶标的结合以及提供结合靶标的第二结合位点。这些肽、蛋白片段或者肽可以与第一结合位点缀合以形成免疫接头。
在本发明的一些实施方案中，通用免疫原包含表达第一条多肽的第一个噬菌体，并且免疫接头包含表达第一多肽和第二多肽的第二个噬菌体。在一些实施方案中，第一个噬菌体是野生型形式的噬菌体而第二个噬菌体是相同噬菌体的突变或者重组形式。噬菌体展示技术可用于筛选表达第一条多肽和第二条多肽中的一条或者两条的噬菌体。更特别地，噬菌体展示是一种筛选技术，其中多肽或者蛋白质表达为与噬菌体的外壳蛋白的融合物，导致融合蛋白在噬菌体病毒体的外表面上展示。噬菌体展示允许筛选在噬菌体外面展示的与靶标结合的肽。这种肽或者肽的部分行使第二结合位点的功能。
制备核酸适配体的方法在本领域是已知的并且至少在上文参考的一些专利中出现，所述方法形成了第一和/或第二结合位点的一个实施方案。通常，该方法包含制备针对任何期望靶标的核酸配体。该方法涉及从候选核酸的混合物中筛选以及使用相同的一般筛选主题进行结构改进的逐步重复以便实现结合亲和力和选择性的几乎任何期望的标准。例如，SELEX方法允许从包含至少1014个序列变体的混合物中分离单个序列变体。使用SELEX方法或者改进方法或者其他方法产生的适配体然后用作免疫接头的第二结合位点。针对任何靶标的适配体可以在几小时或者几天内产生，其连接接头部分和免疫接头的第一结合位点并且提供群体的保护。
产生硫代取代的适配体的方法在本领域例如美国专利公开2005/0214772中已知。使用硫代修饰的核苷酸包括如d ATP(αS)、dTTP(αS)、d CTP(αS)和d GTP(αS)、d ATP(S2)、d TTP(S2)、d CTP(S2)和d GTP(S2)。巯化适配体可以在化学寡核苷酸的合成中通过使用硫代氧化制备。
本文提到的所有出版物和专利并入本文作为参考用于描述和公开的目的，例如在出版物中描述的构建体和方法学，其可与当前所述的发明结合使用。提供上文讨论和贯穿本文的出版物仅仅用于它们在本申请的申请日之前的公开。本文的任何内容不被理解为承认发明人无权由于在先发明而先于这些公开。
当然，应当理解前面的内容仅仅涉及本发明的优选实施方案，并且其中可以进行多种修饰或者改变不背离本公开给出的本发明的精神和范围。
实施例1
向新生大鼠施用B型流感嗜血杆菌免疫接头
B型流感嗜血杆菌(Hib)是有荚膜的细菌病原体，其引起严重的侵入性疾病，特别在幼童和免疫受损的群体中。针对Hib的保护性免疫反应直接针对荚膜多糖(PS)的表位。已知感染前对经腹膜内接种10-100Hib生物的大鼠被动施用抗荚膜多糖抗体将保护它们免于菌血症/败血症。针对Hib的保护的主要的效应模式是通过抗PS抗体的补体依赖的杀菌活性进行的。
为了本发明的目的，克隆了特异性的针对Hib荚膜多糖(PS)的人Fab片段。尽管这种Fab片段使用与“天然”抗体相同的重链和轻链可变区，但是它缺少IgG重链的CH2和CH3结构域。因此，该Fab片段单独不能结合补体并且显示杀菌/保护活性。该Fab片段(Fab41)用作免疫接头的第二结合位点。这种Fab片段与用作免疫接头的第一结合位点的苯胂酸盐半抗原连接。得到的免疫接头是经标记的Fab41-ARS。
新生大鼠接受抗苯胂酸盐抗体的皮下注射，所述抗体通过注射苯胂酸化的匙孔血蓝蛋白至成年大鼠中并且在苯胂酸盐柱上亲和纯化产生的抗体来制备。18小时后，将Hib生物经腹膜内施用于新生大鼠。2小时后，接头Fab41-ARS经腹膜内注射给新生大鼠。18至24小时后，将来自新生大鼠的血液平板接种于巧克力琼脂上并且计数Hib菌落。结果在下面表2显示。
表2：Fab41-ARS处理结果
  组   抗-ARS   Fab41-ARS   Hib CFU/ml
  1   -----   -----   ＞106，＞106，＞106
  2   +(1.0mg)   -----   ＞106，105，4x104
  3   +(0.1mg)   -----   ＞106，1.3x105，5.5x104
  4   -----   +(100μg)   ＞106，＞106，＞106
  5   -----   +(10μg)   ＞106，＞106，＞106
  6   -----   +(1.0μg)   ＞106，＞106，＞106
  7   +(1.0mg)   +(100μg)   2.2x104，＜20，＜20
  8   +(1.0mg)   +(10μg)   4.5x104，1.1x104，4x102
  9   +(1.0mg)   +(1.0μg)   4.5x104，4.4x104，1.3x104
  10   +(0.1mg)   +(100μg)   ＜20，＜20，＜20
  11   +(0.1mg)   +(10μg)   1.0x105，2.1x104
  12   +(0.1mg)   +(1.0μg)   1.1x105，7.2x104，6.6x104
施用的无菌PBS-BSA，其中通过(-----)指出
每一cfu值代表个体新生大鼠的结果。
实施例2
α-半乳糖基表位免疫接头
给重组基因敲除鼠施用包含α-半乳糖基表位的免疫接头，所述重组基因敲除鼠缺少α-1，3-半乳糖基转移酶，因此具有其产物α-1，3-半乳糖基半乳糖键或者α-半乳糖表位的B-和T-细胞免疫反应。α-半乳糖表位在Galili，U.和Avila，J.L.，Alpha-Gal and Anti-Gal，Subcellular Biochemistry，Vol.32，1999中描述。免疫接头包含Gal(α1，3)Gal(β1，4)-GlcNAc-R，其中R代表特异性地针对B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖的人Fab片段。10分钟后，老鼠经腹膜内施用明显存活剂量的Hib。24小时后，通过将它们的血液接种于巧克力琼脂上，实验小鼠血液中的cfu数目与在接受过病原体但没有预先用免疫接头处理的小鼠中相同测定比较。相对于没有接受接头的小鼠，用与α-半乳糖基表位连接的Fab片段的处理抑制了菌血症。在接头的一些量中，抑制是剂量依赖的。
实施例3
开发特异地针对炭疽的噬菌体展示免疫接头
1.使用如New England Biolabs销售的标准噬菌体展示技术，用编码大量随机肽的随机寡核苷酸分离重组噬菌体，其展示炭疽杆菌孢子或者其他毒素、毒素组分(如PA)或者炭疽杆菌的抗原特异的肽。
2.体外表明重组噬菌体通过1)抗体结合噬菌体的非重组形式和重组噬菌体，并且2)重组噬菌体结合炭疽孢子起免疫接头的作用。
3.用非重组噬菌体免疫受试者。这种免疫通过注射或者吸入发生。
4.暴露受试者于包含重组噬菌体的组合物，该噬菌体包含表达炭疽孢子结合肽。使用吸入施用途径提供组合物的足够量以有效地预防受试者肺中炭疽感染。
5.通过吸入方式暴露受试者于炭疽杆菌，保护了受试者免受吸入型炭疽的感染。
这些步骤也可以用于阻止或者抑制经皮肤或者胃肠的炭疽暴露。
实施例4
制备抗核酸酶降解的经修饰的适配体
使用SELEX方法开发具有对来自炭疽杆菌致死因子毒素的特异结合活性的适配体。该适配体具有序列GGG GTT TTT GTT TTT TTC TTTTT CTC ACT CTA TTT TTC TGT3’-C3-OH(PAA12)并且经过修饰以评估对核酸酶降解的抗性。
在化学寡核苷酸的合成中通过使用硫代氧化巯化适配体多核苷酸(使用Gerald Zon描述的方法“寡核苷酸硫代磷酸酯”Protocals forOligonucleotides and Analogs，Ed S.Agrawal，Chapter 8，P165，HumanaPress 1993)以得到5’G＊G＊G＊G＊T＊T＊T＊T＊T＊G＊T＊T＊T＊T＊T＊T＊T＊C＊T＊T＊T＊ T＊T＊C＊ T＊C＊A＊ C＊T＊C＊ T＊A＊T＊ T＊T＊T＊ T＊C＊TG＊T3’-C3-OH(Thio-PAA-12)。
修饰和未修饰的适配体用70％胎牛血清处理1、2、4、6或者24小时以评估适配体的降解。硫代磷酸酯修饰的适配体在24小时时间点在70％胎牛血清中抗降解，而未修饰的适配体在4小时内被降解。
相似地，修饰和未修饰的适配体用核酸酶处理以评估适配体的降解。未修饰的适配体用核酸酶处理30分钟。相对地，硫代磷酸酯修饰的适配体在24小时时间点抗核酸酶中的降解，而未修饰的适配体在1小时内被降解。
这些结果强调硫代磷酸酯适配体对核酸酶降解的抗性，提示使用硫代磷酸酯适配体作为治疗剂将减少维持有效治疗浓度以产生和维持针对靶标的立即免疫需要的施用次数。
实施例5
产生巯化适配体-α-gal表位免疫接头
α-gal表位与巯化适配体的缀合可以通过文献中已知的许多制备寡核苷酸缀合物方法中的任一种方法实现(Protocols for OligonucleotideConjugates，ed S.Agrawal，Humana Press 1994，T.Zatsepin，等人，中和“Use of Carbonyl Group Addition-Elimination Reactions for Synthesisof Nucleic Acid Conj ugates”，Bioconj ugate Chemistry，Volume 16(3)，p471-489，2005)。α-gal表位可通过商业途径从供货商如Vectorlabs(Covington，LA)得到的，并且可以得到具有用于缀合的一些官能团，所述官能团包括但不限于羧基和氨基。巯化的适配体可用多种适合所选择的α-gal表位缀合的5’官能性制备。例如适合的配对将包括羧基/胺；硫醇/马来酰亚胺；羰基/胺；叠氮化物/炔等等(见Synthesis of ModifiedOligonucleotides and Conj ugates，Chapter 4，Current Protocols in NucleicAcid Chemistry，December 2009，John Wiley和Sons)。
Figure BDA0000122348380000291
得到的缀合物使用寡核苷酸合成领域已知的标准方法纯化。
实施例6
在用炭疽杆菌攻击过的小鼠中施用抗炭疽病致死因子免疫接头
本研究中使用的小鼠品系不能产生针对α-Gal表位的免疫反应，因此设计间接的方法，其中将已经针对该表位免疫过的人血清注射给已经对所有人抗体免疫的小鼠。从而，免疫接头(称作α-Gal)通过它的“病原体靶向端”和它的另一端捕获炭疽病致死因子，所述“病原体靶向端”是二硫代衍生的DNA适配体，选择它是因为它在血清中稳定并且具有对炭疽致死因子的高亲和力，所述接头的另一端是α-Gal表位，与针对α-Gal的人抗体结合，该抗体又被小鼠中的抗人抗体结合，引起针对致死因子的免疫攻击。感染的小鼠用抗生素、多西环素治疗能杀死炭疽杆菌，但不能预防动物的死亡，因为足量的致死因子已经被释放进入动物体内。这由HSboost+BAS+doxy(12小时和酶24小时)曲线阐明。
存活实验：用1％人血清免疫并且用α-gal TPAA-12适配体处理的A/J小鼠用1XPBS或者1％人血清经腹膜内免疫5周，每周免疫一次(200μl)。然后小鼠在鼻内滴注1.0×106炭疽杆菌Sterne株孢子(50μl)2小时后用仅PBS、PBS+1％人血清、含有1％人血清的75μg/50μl浓度(μg/小鼠)的α-gal硫代修饰的TPAA-12适配体处理，并且之后每24小时处理一次(总共11次剂量)。另外，一个处理组在炭疽杆菌属sterne株孢子攻击后12小时经腹膜内接受1.5μg/g小鼠剂量的多西环素，并且在受到攻击后2小时鼻内施用含有1％人血清的75μg/50μl剂量的α-gal硫代修饰的PAA-12适配体，并且都是每24小处理一次持续10天(适配体)和14天(多西环素)。而且，在受到攻击后的24小时，一个处理组免疫与上面剂量相同的多西环素，和在鼻滴注后2小时接受含有1％人血清的α-gal硫代修饰的PAA-12适配体，并且都是每24小时处理一次持续10天(适配体)和14天(多西环素)。在攻击前持续9天每天对所有小鼠称重并且测定体温。人血清在实验的早晨加入到适配体中。用炭疽处理的小鼠作为对照，并且用炭疽/多西环素处理以近似于炭疽感染治疗的正常护理标准。使用多西环素杀死炭疽但保留循环的致死因子，其导致多西环素的处理所看出的低的存活率。
在多西环素的存在和缺少下，暴露于炭疽的小鼠中的单独组用抗致死因子/α-gal免疫接头处理。表3提供本研究中检测组的列表。
表3：在炭疽杆菌存活研究中的检测组
Figure BDA0000122348380000301
图3.提供了用与作为靶标的炭疽杆菌致死因子结合的免疫接头处理的小鼠的存活曲线并且提供了作为第一结合位点的α-gal表位。对照炭疽处理的小鼠具有最低的存活率(组2)。在12小时内施用多西环素后(组5)存活率增加了约30％，而在24小时施用时则没有存活率的增加(组7)。提供对炭疽处理过的小鼠单独施用免疫接头延长了存活时间，但是存活率仍然很低(组4)。这仍然是次优的，因为免疫接头不靶向炭疽杆菌，所述炭疽杆菌仍然在小鼠中活跃地产生致死因子。组合施用用于杀死感染性炭疽杆菌的多西环素和针对循环的致死因子蛋白的免疫接头，存活率增加到几乎100％(组6)。在研究中对照组中1只小鼠死亡，如组1曲线所示。

Claims (19)

1.免疫接头分子，其包含
结合免疫系统分子的至少一个第一结合位点和结合靶标的至少一个第二结合位点，
其中所述第二结合位点是巯化的适配体。
2.权利要求1的免疫接头分子，其中所述第一位点与抗体结合。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体来自针对第一位点已经预免疫过的人或者动物。
4.权利要求1的免疫接头分子，其中所述靶标是微生物。
5.权利要求4的免疫接头分子，其中所述微生物是细菌、病毒或者真菌。
6.权利要求1的免疫接头分子，其中所述化合物或者分子是细菌毒素。
7.权利要求6的免疫接头分子，其中所述细菌毒素选自破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、霍乱毒素、毒素B、毒素A、fragilysin、炭疽杆菌致死因子、炭疽杆菌水肿因子、炭疽杆菌保护性抗原、大肠杆菌热不稳定毒素、大肠杆菌热稳定毒素、索氏梭菌致死毒素或者索氏梭菌出血性毒素。
8.针对分子或者化合物免疫人或者动物的方法，其包括对人或者动物施用免疫接头分子，所述免疫接头分子包含与免疫系统分子结合的至少一个第一位点，以及与靶标结合的第二位点，其中所述第二结合位点是巯化的适配体。
9.权利要求8的方法，其中所述人或者动物已经针对免疫接头分子上的第一位点预免疫。
10.权利要求8的方法，其中所期望的化合物或者分子是微生物。
11.权利要求10的方法，其中所述微生物是细菌、病毒或者真菌。
12.权利要求8的方法，其中所述化合物或者分子是药物。
13.权利要求1的方法，其中所述免疫接头分子是适配体。
14.增强个体中对靶标的免疫反应的方法，其包括：
对个体施用有效量的包含一种或多种免疫接头的组合物，
其中所述接头分子包含至少一个第一结合位点和至少一个第二结合位点，
其中所述个体具有针对第一结合位点的现有的免疫反应，并且其中所述第二结合位点是与靶标结合的巯化适配体。
15.权利要求14的方法，其中所述个体是人并且第一结合位点包含α-半乳糖基表位。
16.权利要求14的方法，其中所述个体在施用所述免疫接头之前不能产生针对靶标的有效的免疫反应。
17.权利要求14的方法，其中所述组合物包含不同免疫接头群，其中所述第一结合位点在以下方面不同a)它们对免疫反应组分上不同表位的特异性，或者b)它们对免疫反应组分上相同表位的亲和力。
18.权利要求14的方法，其中所述免疫反应组分是抗体。
19.权利要求14的方法，其中所述组合物包含不同免疫接头群，其中所述不同免疫接头群包含第二结合位点，所述第二结合位点在以下方面不同：a)它们对靶标上不同表位的特异性，或者b)它们对靶标上相同表位的亲和力。
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