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CN102428189A - 反应筒内多重核酸序列的检测 - Google Patents

反应筒内多重核酸序列的检测 Download PDF

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CN102428189A
CN102428189A CN2010800203218A CN201080020321A CN102428189A CN 102428189 A CN102428189 A CN 102428189A CN 2010800203218 A CN2010800203218 A CN 2010800203218A CN 201080020321 A CN201080020321 A CN 201080020321A CN 102428189 A CN102428189 A CN 102428189A
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H·恩格尔
R·西麦尔里奇
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Abstract

本发明涉及在反应筒内扩增和检测核酸序列的方法，其包括下述步骤，(i)提供包括至少一核酸分子的样品，(ii)在所述筒的第一反应室内提供用于扩增反应的试剂，(iii)将所述样品与所述扩增试剂混合，(iv)在所述筒的所述第一反应室内扩增至少一核酸，(v)将至少部分所述扩增反应转移到所述筒的各含有探针组的第二和第三反应室中，其中(a)各探针组由至少3种探针组成，(b)每种所述探针对核酸序列特异，(c)每组至少有两种探针携带相同标记，(d)给定的探针组里携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和所述探针组里具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，(e)其中携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，(f)进行熔点分析以确定哪种所述探针特异性结合核酸。

Description

反应筒内多重核酸序列的检测
发明领域
本发明涉及生物和化学领域，更具体地涉及分子生物学和人类遗传学领域。本发明涉及鉴定样品中特定核酸序列的领域。具体地，本发明涉及在反应中扩增和检测核酸序列的领域。本发明涉及用于检测样品中核酸序列的设备和筒。
发明背景
灵敏、特异并快速检测样品中生物介质如病原体的诊断实验对疾病和诊断生物介质监控愈加重要。对于存在感染性或其他有害介质的早期检测，很少有试验能在合适的时间精确检测生理学或临床相关的生物体。
DNA微阵列是通过共价连接到化学基质上的排列在固体表面的极微小的DNA位点集合，其通常代表单个基因。DNA阵列与其他类型微阵列的差异仅在于它们测量DNA或用DNA作为其检测系统的部分。用DNA微阵列的定性或定量检测利用高严谨性条件下DNA-DNA或DNA-RNA杂交的选择性和基于荧光团的检测。DNA阵列通常用于表达概况，即同时监控数千个基因的表达水平，或用于比较基因组杂交。这个系统的缺陷在于分析前需要进行多重步骤。而且，所述阵列不灵敏。
迄今，最敏感的检测方法涉及PCR。用多重检测法确定单一样品中含或不含多个生物介质。
多重PCR在单一PCR反应中使用多种独特引物组以产生对不同DNA序列(即不同转基因)特异的各种大小的扩增子。通过一次定位多基因，可从单一测试运行中获得额外信息，否则需要数倍所述试剂和更多时间来完成。各引物组的退火温度必须优化以在单一反应中正确工作，且扩增子大小即其碱基对长度需要有足够的差异以在凝胶电泳显现时形成不同条带。
多重实时PCR是一种可用作诊断测试的方法。基于PCR的测试会受到用于在符合成本效益数量的反应管中测试多种试剂的PCR反应优化复杂性限制。作为一般规律，探针数量需要支持高度特异的从两种到多至五种序列的确认结果。本领域技术人员会意识到用许多不同的引物对和探针来优化PCR反应可能是艰难的任务，其随着待检测的目标数量增加而愈加难处理。基于PCR的测试也可能受到用于结果分析的独特标记数量限制。例如，实时PCR测试一般使用荧光标记。
单个反应中可使用的荧光标记的数量受到光学检测系统中可用的荧光颜色通道数量的限制。
能同时扩增和检测多核酸序列的设备和/或筒是有利的。
发明概述
本发明涉及在反应筒内扩增和检测核酸序列的方法，其包括下述步骤，(i)提供包括至少一核酸分子的样品，(ii)在所述筒的第一反应室内提供用于扩增反应的试剂，(iii)将所述样品与所述扩增试剂混合，(iv)在所述筒的所述第一反应室内扩增至少一核酸，(v)将至少部分所述扩增反应转移到所述筒的各含有探针组的第二和第三反应室中，其中(a)各探针组由至少3种探针组成，(b)各所述探针对核酸序列特异，(c)每组至少有两种探针携带相同标记，(d)给定的探针组里携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和所述探针组里具有相同标记的另一探针有大于5℃的差异，(e)其中携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，(f)进行熔点分析以确定哪种所述探针特异性结合核酸。本发明一个巨大优势在于可分析的目标数量比现有技术大得多。进一步检测发现探针被分离，这表明其不在扩增反应中，因此聚合酶不消化它们。
本发明还包括实施扩增和检测目标核酸序列的方法的筒，其包括：(i)用于扩增反应的第一反应室，(ii)两个或更多反应室，其中之一包含至少3种对核酸序列特异的探针，其中至少两种探针携带相同标记，其中携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，其中所述携带相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同从而它们可通过熔点相区分，以及所述第一与所述两个或更多反应室之间的连接。
本文所用术语“筒”指本发明文章中允许所述扩增子从所述第一反应室在封闭系统内转移到所述第二组反应室中的设备(优选微流体的)。所述筒可由聚合材料制成。材料优选聚丙烯、聚苯乙烯、COC、聚碳酸酯、PMMA等。所述材料优选具有低自发荧光的透明材料。所述筒优选机械加工、热模压印或注模。
本发明所用术语“核酸序列”指本发明内容中核酸上的序列。核酸可以是RNA、DNA、cDNA(互补DNA)、LNA(锁核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(线粒体)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、nRNA(核RNA)、siRNA(短干扰RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、scaRNA(小卡哈尔(Cajal)体特异RNA)、微小RNA、dsRNA(双链RNA)、核酶、核糖开关、病毒RNA、dsDNA(双链DNA)、ssDNA(单链DNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、病毒DNA、mtDNA(线粒体DNA)、nDNA(核DNA)、snDNA(小核DNA)等或与样品内大量核酸可区别的任何其他类或亚类核酸。
本发明所用术语“探针”指能结合其他核酸的核酸。
本文所用术语“组织”指人体、动物或植物内任何组织或液体，包括但不限于乳房、前列腺、血液、血清、脑脊液、肝、肾、头和颈、咽、甲状腺、胰腺、胃、结肠、结直肠、子宫、子宫颈、骨、骨髓、睾丸、脑、神经组织、卵巢、皮肤和肺。
本文所用术语“引物组”指可在特异位置即序列与核酸分子相互作用的一组3种或更多试剂。
本文中，“标记”指共价或非共价结合探针的部分，其可产生可被光学或其他物理方法检测的信号。
发明详述
本发明涉及在反应筒内扩增和检测核酸序列的方法，其包括下述步骤，(i)提供包括至少一核酸分子的样品，(ii)在所述筒的第一反应室内提供用于扩增反应的试剂，(iii)将所述样品与所述扩增试剂混合，(iv)在所述筒的所述第一反应室内扩增至少一核酸，(v)将至少部分所述扩增反应转移到所述筒的各含有探针组的第二和第三反应室中，其中(a)各探针组由至少3种探针组成，(b)各所述探针对核酸序列特异，(c)每组至少有两种探针携带相同标记，(d)给定的探针组里携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和所述探针组里具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，(e)其中携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，(f)进行熔点分析以确定哪种所述探针特异性结合核酸。
在另一个实施方式中，各探针组由至少4种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。
在另一个实施方式中，各探针组由至少5种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。
在另一个实施方式中，各探针组由至少6种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。
在另一个实施方式中，各探针组由至少6种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。
在另一个实施方式中，各探针组由至少7种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。也可3种或更多具有一个标记。
在另一个实施方式中，各探针组由至少8种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。也可3种或更多具有一个标记。
在另一个实施方式中各探针组由至少9种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。也可3种或更多具有一个标记。
在另一个实施方式中各探针组由至少10种探针组成且每组中至少有两种探针携带相同的标记。也可3种或更多具有一个标记。
在一个实施方式中有多于10种探针，至少3种具有相同标记且解链温度有至少2℃的差异。
本方法所基于的基本原理是，在扩增反应结束时用允许目标差异的单个双标记探针进行解链曲线分析。所述相同标记的探针Tm有差异。在第二和更多的室里完成此分析。通过将这些探针置于第二和更多的室里来避免其水解。本发明的观点第一次使Tm分布不依赖于聚合酶表现外切活性时的温度。PCR反应或等温扩增过程结束时，所述探针可水解且混合物在连续荧光监控中进行逐步升温。如典型TaqMan实时PCR，由所述探针产生的荧光信号基于共振能量转移(FRET)现象。然而与TaqMan实时PCR中发生的相反，在此实施方式中可用的探针分子没有通过Taq聚合酶发生水解。而是所述过程依赖于在所述探针从其目标上脱离以形成随机单链构象时观察到的FRET降低。当双标记探针从其和所述目标序列的杂交物中释放出来时，所述探针的报告和淬灭分子之间的平均距离会变得更小。由于所述FRET效应与该距离的6次幂成反比，可容易地检测出探针杂交和解链构型之间荧光发射的差异。总方案如图6所示。在此，逐个循环显示不同反应温度的荧光变化。在本发明的优选实施方式中，所用聚合酶缺少5′-3′外切核酸酶活性。
所述扩增反应的反应体积在10-200μl之间。检测反应的反应体积优选在1-100μl之间。
第二和更多室里的探针可以冻干、琼脂糖或果胶或藻酸盐包埋或简单干燥。
为了更好阐明本发明，我们指出图1。本发明的探针组包括至少两种探针。在一个实施方式中，探针组可视为所有共享同一标记的探针，但也可视为共享同一解链温度(Tm)的探针。理想情况下，探针组里具有相同标记或彼此不能区分标记的探针具有不同的解链温度。探针组里具有相同或非常相似的解链温度的探针应该具有不同标记。
本领域技术人员知道所述试剂普遍包括例如扩增酶、缓冲液、核苷酸等。当然这取决于扩增的类型。
本发明人开发了可用如20种模板进行多重扩增反应的方法。在一个实施方式中，使用5种不同的标记且所有共享同一标记的探针具有稍微不同的解链温度，理想上大于5℃。另一方面所有共享同一解链温度的探针具有不同的标记。通过在扩增期间或之后检测所述标记和所述解链温度，本发明人首次提供了可在一个管中分析如所述20种模板的方法。
具有相同标记探针的解链温度的差异大于2℃、大于3℃、大于4℃、大于5℃、大于6℃、大于7℃、大于8℃、大于9℃或大于10℃。理想情况下，所述探针的差异小于18℃、小于17℃、小于16℃、小于15℃、小于14℃、小于13℃、小于12℃或小于11℃。
原则上所述“通过测定标记探针是否结合其核酸序列来检测扩增的核酸”和“检测各给定标记探针从其结合的核酸序列上分离时的温度”可在给定反应结束时或所述反应期间完成。在此，优选在所述筒的第一反应室中扩增所述至少一核酸之后的扩增后完成所述检测。将至少部分所述反应转移到所述筒的各含有探针组的第二和第三反应室中，其中各探针组由至少3种探针组成，各所述探针对核酸序列特异，每组至少有两种探针携带相同标记，给定的探针组里携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和所述探针组里具有相同标记的另一探针有大于5℃的差异，其中携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，进行熔点分析以确定哪种所述探针特异性结合核酸。
可应用不同的扩增方法，例如，滚环扩增(如Liu，等，“滚环DNA合成：作为DNA聚合酶有效模板的小圆形寡核苷酸组”(″Rolling circle DNA synthesis：Smallcircular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases″)J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594(1996))，等温扩增(如Walker，等，″Strand displacementamplification--an isothermal，in vitro DNA amplification technique″(“链置换扩增—等温、体外DNA扩增技术”)，Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992))，连接酶链反应(如Landegren，等，″A Ligase-Mediated Gene Detection Technique，″(连接酶介导的基因检测技术)，Science 241：1077-1080，1988，或Wiedmann，等，″Ligase ChainReaction(LCR)--Overview and Applications，″(“连接酶链反应(LCR)--概述和应用”)，PCR Methods and Applications(《PCR方法和应用》)(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring HarborLaboratory，NY)，1994)第S51-S64页)。然而，优选聚合酶链式反应。
如果所述反应为聚合酶链式反应，则所述“通过测定标记的探针是否结合其核酸序列来检测扩增的核酸”和“检测各给定标记的探针从其结合的核酸序列上分离时的温度”可在每个循环后、一次循环后、多于一次循环后、间隔中或所述整个PCR反应结束时完成。该情况下，部分所述反应在各自循环后转移到所述检测室中。
PCR反应可由DNA分子的10-100个变性和合成“循环”构成。在优选实施方式中，在热循环扩增反应中进行变性的温度约为90℃至95℃以上，更优选92-94℃。优选的热循环扩增方法包括聚合酶链式反应，其涉及约10至约100个循环，更优选约25至约50个循环，且峰值温度约为90℃至95℃以上，更优选92-94℃。在一个优选实施方式中，采用DNA聚合酶I进行PCR反应，可产生相对所涉及反应步骤数量以指数扩增的至少一种靶核酸序列，前提是(a)对靶序列末端的了解足够详细，以便合成与其杂交的寡核苷酸引物，和(b)得到少量靶序列以启动所述链反应。该链反应的产物是不连续的核酸双链体，其末端对应于所用特异性引物的末端。可采用任何来源的纯化或非纯化形式的核酸作为起始核酸，只要其含有或被认为含有所需的靶核酸序列。因此，该方法可采用例如，单链或双链DNA。此外，可利用各含一条链的DNA-RNA杂合体。也可采用任何这些核酸的混合物，或者相同或不同引物进行前述扩增反应所产生的核酸。扩增的核酸优选DNA。待扩增的靶核酸序列可以仅是较大分子的一部分，或者最初可以不连续分子形式存在，从而该靶核酸构成完整的核酸。待扩增的靶序列最初不必需以纯化形式存在；其可以是复杂混合物的微小部分或某特定动物核酸序列的一部分，所述生物体可能只构成特定生物样品的很小部分。起始核酸可含有一种以上的所需靶核酸序列，这些序列可以相同或不同。因此，所述方法可用于同时扩增位于相同或不同核酸分子上的多种靶核酸序列。所述核酸可获自任何来源且包括质粒和克隆的DNA、任何来源的DNA，包括细菌、酵母菌、病毒和高等生物如植物或动物。可通过各种技术例如Maniatis等Molecular cloning.A laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约冷泉港实验室(New York：Cold Spring Harbor Laboratory))第280-281页(1982)所述从例如血液或其他液体或组织材料如绒膜绒毛或羊膜细胞中提取DNA。此外可应用坦普勒斯(Templex)技术，其将格纳克(Genaco)Tem-PCR技术和鲁米耐克斯(Luminex)xMAP技术相结合。
该试验采用基因座特异性引物。可用任何合适的方法，例如磷酸三酯和磷酸二酯法或其自动化实施方式制备寡核苷酸引物。在一个这类自动化实施方式中，将二乙基亚磷酰胺用作起始材料并可如Beaucage等，Tetrahedron Letters，22：1859-1862(1981)所述(其通过引用纳入本文)进行合成。一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法参见美国专利号4,458,006，其通过引用纳入本文。也可采用分离自生物源(例如限制性核酸内切酶消化物)的引物。引物长度优选约为15-100个碱基，更优选约20-50个，最优选约20-40个。重要的是该方法的引物横跨包含所述目标序列的区域。用含有该序列作为模板的核酸来扩增靶核酸序列。如果所述核酸含有两条链，则将其用作模板之前需要分离所述核酸链，其可作为单独步骤或与合成引物延伸产物同时。可用任何合适的变性方法实施这种链分离，包括物理、化学或酶学方法。分离核酸链的一种物理方法包括加热核酸，直到其完全(＞99％)变性。典型热变性可涉及约80℃到105℃的温度，优选约90℃到约98℃，更优选93℃到95℃，持续时间约1-10分钟。在等温扩增的情况中，也可用称为解旋酶的这类酶或具有解旋酶活性且已知能变性DNA的RecA酶诱导链分离。适合用解旋酶分离核酸链的反应条件参见冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harbor Symposia onQuantitative Biology)，第XLIII卷，DNA：Replication and Recombination，(DNA：复制和重组)(纽约：冷泉港实验室，1978)，且使用RecA的技术综述参见C.Radding，Ann.Rev.Genetics，16：405-37(1982)，其通过引用纳入本文。
可用任何合适方法进行所述合成。通常，在缓冲水溶液中进行合成。在一些优选实施方式中，所述缓冲液pH为约7.5-8.9。优选地，将摩尔过量(对于克隆核酸，引物∶模板的比例通常约为1000∶1，对于基因组核酸，引物∶模板的比例通常约为106∶1)的寡核苷酸引物加入到含有分离的模板链的缓冲液中。然而应理解，如果将本文所述方法用于某些应用，互补链的量可能未知，因此不能明确测定相对于互补链含量的引物量。然而，作为一个实际问题，当复杂的长链核酸链的混合物中包含待扩增序列时，加入的引物摩尔量通常超过互补链(模板)的量。优选较大的摩尔过量以提高该方法的效率。
也优选在合成混合物中加入适量的三磷酸核苷，优选dATP、dCTP、dGTP、dTTP和/或dUTP。核苷酸的优选摩尔浓度为0.025mM-1mM，优选0.05-0.6mM，最优选0.1-0.5mM。
本发明聚合酶优选选自以下菌属：栖热菌属(Thermus)、产液菌属(Aquifex)、栖热袍菌属(Thermotoga)、热发状菌属(Thermocridis)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、嗜热蓝细菌属(Thermosynchecoccus)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。
本发明聚合酶优选选自以下生物体：伊欧产液菌属(Aquifex aeolicus)、酿脓产液菌属(Aquifex pyogenes)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、太平洋栖热菌(Thermus pacificus)、艾格索尼栖热菌(Thermus eggertssonii)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。
最优选的聚合酶是Taq聚合酶。但是如下文详述，在一些实施方式中，聚合酶优选具有5′-3′外切酶活性。在其他实施方式中，聚合酶优选缺少5′-3′外切酶活性。在多数实施方式中，聚合酶优选缺少3′-5′外切酶活性
在一个实施方式中，在PCR反应中掺入尿嘧啶残基。尿嘧啶DNA糖基化酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)是大肠杆菌(Escherichia coli)ung基因的产物，且已克隆、测序并在大肠杆菌(E.coli)中表达。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能去除DNA(单链和双链)中的这些尿嘧啶残基，但不破坏DNA糖-磷酸二酯主链，从而防止其成为杂交靶标或DNA聚合酶的模板。在升高的温度下，所得脱碱基位点易受到水解切割。因此，去除尿嘧啶碱基通常伴随着所述DNA的片段化。本领域技术人员知道如何使用尿嘧啶DNA糖基化酶来避免污染。同样，此酶以及尿嘧啶核苷酸均可用于本发明试剂盒中。
理想情况下，所述第一和第二或更多探针组内的探针标记为荧光标记且具有非常相似的发射波长。理想情况下，这意味着它们可被检测出而不用改变可能被所述检测仪器检测出的波长调节。在第一、第二和第三或更多探针组中的探针的标记优选是相同的。
优选携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过在给定仪器上的熔点相区分。
在一个实施方式中，所述双链区段的解链转移可通过监测双链核酸特异(dsNAS)染料的荧光强度来测量。在一个实施方式中，所述双链核酸特异性染料选自SYBR
Figure BPA00001462422500091
绿I、SYBR
Figure BPA00001462422500092
金、溴化乙啶、溴化丙锭、皮可(Pico)绿、赫斯特(Hoechst)33258、YO-PRO-I和YO-YO-I、SYTO9、LC Green
Figure BPA00001462422500094
LC Green
Figure BPA00001462422500095
Plus+、EvaGreenTM。这些饱和染料能在扩增期间或扩增后以对DNA足够饱和的情况存在，而同时对PCR的抑制最小。例如，在最大PCR相容浓度下，所述dsDNA结合染料具有至少50％的饱和比例。在其他实施方式中，所述饱和比例为至少80％。在其他实施方式中，所述饱和比例为至少99％。应理解饱和比例是相较饱和浓度下同一染料荧光的荧光百分比。饱和浓度是在预定量的dsDNA存在下可提供最高荧光强度的浓度。由于这些染料可以明显较高的浓度存在而不显著干扰特定核酸反应，其在监控单链核酸和dsDNA的构象上特别有用。
优选的反应为聚合酶链式反应。
所述探针优选选自下组：TaqMan探针、分子信标探针、蝎形探针和光循环仪探针。扩增产物的检测本身可通过使用下述探针之一完成：TaqMan探针、分子信标探针、蝎形探针、光循环仪探针、杂交探针、置换探针和其他类型的序列特异性探针形式。
TaqMan测试利用Taq DNA聚合酶的5′核酶活性切割荧光标记探针(FAMTM标记的MGB)。
分子信标是形成茎环结构的单链寡核苷酸杂交探针(图2)。所述环包括与目标序列互补的探针序列，且所述茎由定位在探针序列任一侧的互补臂序列退火形成。荧光团共价连接在一个臂的末端且淬灭剂共价连接在另一臂的末端。分子信标游离在溶液中时不发荧光。然而，当它们与包含目标序列的核酸链杂交时，其发生构型改变从而能明亮地发出荧光。没有目标时探针是暗的，因为茎将荧光团和非荧光淬灭剂放置很近从而它们短暂共享电子，消除了荧光素发出荧光的能力。当探针遇到目标分子时，其形成比茎杂交物更长且更稳定的探针-目标杂交物。所述探针-目标杂交物的刚性和长度阻止所述茎杂交物同时存在。结果，所述分子信标经历自发构象重组从而迫使所述茎杂交物解离且所述荧光团和所述淬灭剂彼此离开，恢复荧光。进行基因扩增前在实验混合物中加入分子信标并实时测量荧光。分子信标可合成具有不同颜色的荧光团，使得本发明方法能够完成。
所得荧光颜色(如果有)联合所述解链温度的测量来识别病原体。
蝎形引物(图3)是双功能分子，其中引物与探针共价连接。所述分子也包括荧光团和淬灭剂。没有目标时，所述淬灭剂几近吸收荧光团发出的荧光。在蝎形PCR反应期间，存在目标时所述荧光团和所述淬灭剂分离，其导致发出荧光的增加。所述荧光可在所述反应管中检测和测量。
光循环仪FRET探针系统是一对单链荧光标记的寡核苷酸。探针1(供体探针)在其3′末端用供体荧光团(常用荧光素)标记且探针2(受体探针)在其5′末端用四种可用的荧光团之一(红610、640、670或705)标记。探针2的3′游离羟基基团须用磷酸基团(P)封闭以防止TaqDNA聚合酶延伸。为了避免在两探针上的所述供体和所述受体荧光团之间的任何空间问题，需要有1-5nt的间隔(
Figure BPA00001462422500101
的距离)以使这两个探针彼此分开。在进行任何实时定量PCR反应前，可在所述管内观察到荧光背景。
实时定量PCR退火步骤期间，PCR引物和光循环仪探针与其特异目标区域杂交使得所述供体染料与所述受体染料非常接近。当供体染料被来自光循环仪器的光(hγ1)激发时，能量通过荧光共振能量转移(FRET)从所述供体转移到所述受体染料。所述能量转移引起所述受体染料发出比所述仪器发射光(hγ1)波长更长的光(hγ2)。所述仪器的光学单元检测所述受体荧光的发射波长。测量的荧光信号的增加与积累的目标DNA量成正比。
其他替代探针为遮蔽(Eclipse)探针(爱普客纳米基因公司(Epoch，Nanogen)，置换探针(Cheng等，Nucleic Acids Research，2004，卷32，第7号)，普勒阿得斯(pleiades)探针(NAR 2007卷35 5 e30)和普莱科塞(plexor)系统(普洛麦格公司(Promega))。当然本发明也包括其他探针系统。
在本发明的一个实施方式中，所述TaqMan探针与用于熔点分析的插入染料相结合。
在另一实施方式中，所述TaqMan探针与用于熔点分析的杂交探针相结合，在具体实施方式中所述TaqMan探针是所述杂交探针。在另一个实施方式中，所述TaqMan探针不是所述杂交探针而独立的寡核苷酸用作杂交探针。
理想情况下，所述筒包括用于熔点分析的更多的反应室。理想情况下，所述筒包括3个或更多用于熔点分析的反应室，4个或更多用于熔点分析的反应室，5个或更多用于熔点分析的反应室，6个或更多用于熔点分析的反应室，7个或更多用于熔点分析的反应室或者8个或更多用于熔点分析的反应室。
理想情况下，所述筒是一次性制品且当所述筒置于扩增设备中时进行所述扩增和熔点分析。扩增可通过上述不同的技术实现。加工所述筒的仪器需要提供由用于第一反应室的扩增技术规定的充足温度分布。与扩增技术无关，所述仪器需提供用于更多反应室熔点分析的温度分布。
在图4中，所述反应包括杂交探针和TaqMan探针。在此，(a)每探针组由例如至少两种探针组成，其中所述探针是所述杂交探针，(b)各所述探针对核酸序列特异，(c)给定探针组里的各所述杂交探针(例如图4中的BHQ 1、BHQ 2、BHQ 3)携带不同标记(参见例如图1中的A列)，(d)当通过加热从目标核酸序列上分离时，给定探针组里的全部所述探针具有相似的，优选相同的解链温度(Tm)(参见例如图1中的A列)。进行反应中的核酸序列的扩增，检测扩增的核酸并测定各给定标记的探针从其结合的核酸序列上分离时的温度。在此实施方式中，尽管不是本质上必须的，所述杂交探针的解链温度优选低于扩增所用引物的解链温度。
图5中给出了一个例子。在给定熔点(所述杂交探针Q1的熔点)的PCR反应期间，所述杂交探针Q1会对DNA链分离。所述杂交探针携带淬灭剂。一旦分离，下游TaqMan探针会产生来自目前不再被淬灭的荧光标记的信号。已知所述信号引起所述熔点(熔点mp1)。所述标记已知(FL1)。因此，可确定此杂交标记对例如病原体1(p1)特异，因此可知该病原体存在于所述反应中。同时所述TaqMan探针允许在PCR反应期间在线定量。但本发明的检测步骤在所述第二或更多室中进行。
或者所述反应额外包括双链核酸特异性染料。如果使用双链特异性染料，则所述染料优选选自下组：SYBR
Figure BPA00001462422500121
绿I、SYBR金、溴化乙啶、溴化丙锭、皮可绿、赫斯特33258、YO-PRO-I和YO-YO-I，特别优选SYBR绿I。
本发明理想情况下，所述双链核酸特异性染料在光谱上可区别于所述探针标记。
理想情况下，所述标记是荧光标记且所述标记选自下组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、雅基马黄、Alexa Fluor PET、Biosearch BlueTM、Marina Blue
Figure BPA00001462422500124
、Bothell Blue、Alexa Fluor
Figure BPA00001462422500126
、350FAMTM、SYBR
Figure BPA00001462422500127
绿1、荧光素、EvaGreenTM、AlexaFluor
Figure BPA00001462422500128
488JOETM、VICTM、HEXTM、TETTM、CAL Fluor
Figure BPA00001462422500129
金540、Yakima Yellow
Figure BPA000014624225001210
、ROXTM、CAL Fluor
Figure BPA000014624225001211
红610、Cy3.5TM、Texas Red
Figure BPA000014624225001212
、Alexa Fluor
Figure BPA000014624225001213
、568Cy5TM、QuasarTM670、LightCycler Red640
Figure BPA000014624225001214
、Alexa Fluor 633QuasarTM 705、LightCycler Red705
Figure BPA000014624225001215
、Alexa Fluor
Figure BPA000014624225001216
680、SYTO
Figure BPA000014624225001217
9、LC Green、LC Green
Figure BPA000014624225001219
Plus+、EvaGreenTM。
在优选的实施方式中，使用不对称引物浓度。这通过改变各靶标的两种引物比例实现，产生结合所述探针的DNA链的引物加入浓度高于另一引物。
本实施方式还优选所述杂交探针的解链温度(Tm)低于所述聚合酶表现出其最优活性的温度。这提供了杂交探针的分离且为聚合酶与TaqMan探针提供便利。显然在理想情况下所述方法使用表现出5′-3′外切酶活性的聚合酶。
实时PCR需要由热循环仪、计算机、用于荧光激发和发射收集的光学装置，和数据获取和分析软件组成的仪器平台。这些机器可获自数个工厂，其差异在于样品容量(一些是96孔或384孔标准平板型，其他处理较少的样品或需要特殊玻璃毛细管，一些具有封闭形式，其他有转盘(carousel))、激发方法(一些用激光器，其他用具有可调滤片或者一个或多个二极管的宽谱光源)、检测(一些用相机，其他用光电倍增管，或各种类型的光检测系统)和总体灵敏度。在所述软件如何处理数据方面也有平台特异性差异。原则上包含两个或更多检测通道的机器可适用于本发明的方法。在任何情况下所述设备必须装有本发明的筒(也见图8和9)。
理想情况下，所述筒是一次性制品且当所述筒置于热循环装置或限制于等温扩增的扩增装置中时进行所述扩增和熔点分析。
本发明方法的一个实施方式中，所述等温扩增设备包括转子且当所述筒在所述转子中时进行所述扩增和熔点分析并且通过离心力完成所述至少部分扩增反应向所述筒的第二、第三和更多反应室中转移。
本发明还包括实施用于扩增和检测目标核酸序列的方法的筒，其包括：(i)用于扩增反应的第一反应室，(ii)两个或更多反应室，其中之一包含至少3种对核酸序列特异的探针，其中至少两种探针携带相同标记，其中携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，其中所述携带相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同从而它们可通过熔点相区分，以及所述第一和所述两个或更多反应室之间的连接。
理想情况下所述筒为微流体筒。
所述筒可具有一定流径(也称为“流动通道”)，即所应用的液体流过所述筒的路径。所述反应室排列在所述流径中，从而液体流经或流入所述模块。例如它们可能串联或平行排列，如允许使用多通路。当串联排列时，所述多孔阻挡层的孔径可沿着所述流径减小以避免堵塞。所述模块可包括固定的、溶液中的或干燥的不同或相同探针。当包含不同探针时，可以同时检测不同分析物。所述探针可固定于所述检测室的颗粒上。
因此本发明结合流通式和拂过式装置的特性，从而提供这两种装置的特定优势。
所述反应室还可包括核酸例如DNA、RNA、适配体、抗体、Fab片段、Fc尾。其他探针可以是蛋白质例如受体、抗体。另外的抗体可以多克隆或/和单克隆抗体形式使用。
在检测步骤期间装有所述筒的装置优选还包括检测装置(“检测器”)，优选光学读取。检测装置可选自由以下组成的组：用于测量光的吸收或发射的光电二极管光传感器、用于测量来自探针阵列的光学信号的CCD相机、共聚焦显微镜、GMR(巨大磁性电阻)传感器—用于磁性颗粒、伽玛检测器(放射性同位素)、电容桥—用于测量介电性质的变化。优选地，所述检测器可以是荧光检测器，用于检测例如含荧光标记的分析物的荧光。本文所有光学检测器可称为“光学读取”。在一个实施方式中，各检测室存在一个检测装置，在其他实施方式中，两个或更多检测室共享同一检测器。所述转子的优势在于所述室可飞越即穿过所述检测器而且仅需要一个。
所述筒优选是微流体装置，其允许液体在封闭系统中从第一反应容器转移到至少两个更多的反应容器中。所述流体转移优选通过离心力或压力产生技术(泵机制)实现。所述反应室之间的流体连接设计使第一反应室的反应液体分流为所需数量的部分。这可通过不同方法实现。对于离心液体转移，第一和第二反应室之间的连接通道设计决定了转移液体所需的离心力。或者，所述筒设计中可包括阀门技术(不优选)以调节所述室之间的液体转移。所述筒可由聚合材料制成。材料优选聚丙烯、聚苯乙烯、COC、聚碳酸酯、PMMA等。所述材料优选具有低自发荧光的透明材料。所述筒优选机械加工、热模压印或注模。
本发明还涉及PCR装置中依据本发明的筒。
本发明的引物和探针可对各目标特异，例如疾病标记物、病原体、法医标记物或可通过扩增方法涉及的任何其他目标。本发明特别适用于病原体分析。最常见的细菌疾病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的结核病，其每年杀死约200万人，大部分在撒哈拉沙漠以南的非洲。致病性细菌导致其他全球性的重大疾病，如可由细菌如链球菌(Streptococcus)和假单胞菌(Pseudomonas)引起的肺炎，和由细菌如志贺杆菌(Shigella)、弯曲杆菌(Campylobacter)和沙门菌(Salmonella)引起的食源性疾病。致病性细菌也引起感染如破伤风、伤寒、白喉、梅毒和麻疯病。食物或水被污染的主要途径之一是未处理污水释放到饮用水供应中或农田上，导致吃或喝污染源的人受到感染。在发展中国家大多数污水排放到环境中或农田上。这是霍乱、甲肝、脊髓灰质炎和轮状病毒的感染介质传播的典型模式。因此，在一个实施方式中，所述引物和探针对一种或多种致病性细菌特异。
所述筒可用于人或兽医诊断、用于检测食物或水、用于法医应用或用于科学目的。
实施例
实施例1
用荧光标记的探针进行多重实时PCR和随后解链曲线分析的本发明方法的技术概念的实施方式
在本实验中，将证实图中所示的技术概念的可行性。所述反应如下表所示组成，其设置为四重反应并按表6所示的实验方案进行。用表8的试剂实现此目的。20x引物混合物和50x探针混合物的组成分别示于表2和3。所述引物和探针的序列示于表1。用来自人白细胞的cDNA作为PCR中的模板核酸生成PCR产物，且用于各靶标的正向和反向引物示于表1，用QiaQuick(凯杰公司，Qiagen)PCR纯化试剂盒纯化PCR产物并1∶1000稀释使用。如表9所示在单独的反应中加入模板：在第一种情况“仅IC”下，仅加入Ubi模板作为内部阳性对照。在第二种情况下，加入Ubi IC和靶标1Alb。在第三种情况下，加入Ubi IC和靶标2Cmyc。在第四种情况下，引入Ubi IC和靶标3TBP。在第五种情况下，加入Ubi IC和靶标4GAP。对于第六种情况，加入Ubi IC和靶标5SRY作为模板。
在具有72位转子的RotorGene 6000PCR系统(6通道)上进行实时PCR。6检测通道的规格示于表5，包括适于在各通道中检测的荧光染料的例子。PCR循环和随后的解链曲线的参数示于表6。
然后用适当的仪器软件分析运行数据。在实时PCR中观察到的内参(IC)CT值和各靶标示于表10。检测探针熔点(最大解链峰值示于图8)，结果示于表11。四重反应在6种不同实验条件(表9)下观察到的解链峰值示于图8。所有反应显示预期结果，表明CT值在正确的检测通道中且检测所加靶标的各探针具有含预期熔点的解链峰值。
Figure BPA00001462422500151
Figure BPA00001462422500161
Figure BPA00001462422500171
Figure BPA00001462422500181
解链曲线的软件设置：每管收获优化。所述软件通常仅从一个检测通道收集解链数据，因此运行3个随后的解链曲线是先从绿色通道然后从橙色通道再然后从深红色通道检测解链数据。
Figure BPA00001462422500182
Figure BPA00001462422500201
实施例2
在FAM检测通道中对含有可区分Tm的不同探针进行多重实时PCR和随后解链曲线分析的本发明方法的技术概念的实现
在本实验中证明区分同一检测通道内携带相同标记的数种探针的能力。所述反应组成示于表18且用表17所示的实验方案进行。用表18和19的试剂实现此目的。20x引物混合物和10μM探针混合物的组成分别示于表13和14。所述引物和探针的序列示于表12。从人白细胞RNA中生成10ng/反应的cDNA作为模板，且各目标的正向和反向引物示于表12。制备并分析四种靶标的各自单重反应，双重和三重和四重反应。所述7种不同条件和预期结果示于表20。
在具有72位转子的RotorGene 6000PCR系统(6通道)上进行实时PCR。6检测通道的规格如表16所示，包括适于在各通道中检测的荧光染料的例子。PCR循环和随后的解链曲线的参数示于表17。
随后用适当的仪器软件分析运行数据。检测探针熔点(最大解链峰值示于图9)，结果示于表21。
Figure BPA00001462422500211
Figure BPA00001462422500221
Figure BPA00001462422500231
Figure BPA00001462422500241
解链曲线的软件设置：每管收获优化。软件仅从一个检测通道收集解链数据
Figure BPA00001462422500242
Figure BPA00001462422500251
附图简要说明
图1
图1显示本发明的原理。在例如第一行用共享同一标记的探针进行所述反应。然而，探针的解链温度不同。因此可用区分解链温度的方法来鉴定每种探针。例如D列的探针都具有相同的解链温度但标记不同。因此可用不同标记的方法来鉴定每种探针。
图2
图2显示分子信标探针的原理。分子信标可在例如诊断试验中用作扩增子检测探针。因为非杂交分子信标较暗，所以不需要分离探针-靶标杂交物以检测试验期间合成的扩增子数量。因此它们理想地适于本发明。进行基因扩增前在实验混合物中加入分子信标并实时测量荧光。
图3
使用单一寡核苷酸与蝎形探针实现序列特异性引导和PCR产物检测。所述蝎形探针维持非杂交态的茎环结构。所述荧光团附着在5′末端且被偶联在3′末端的部分淬灭。所述茎的3′部分还包含与引物延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增单体连接特定引物的5′末端。蝎形引物延伸后，所述特异性探针序列能在延伸的扩增子内结合其互补序列并因此打开发夹环。这防止了荧光淬灭并观察到信号。
图4
本图显示了本发明的一个优选实施方式。在此，所述反应中存在用于各目标序列的两种探针。存在的第一杂交探针携带标记，例如被相邻的TaqMan探针淬灭的荧光标记。当达到解链温度时，所述杂交探针对其结合的链解离。所述荧光标记不再淬灭并产生信号。
图5
本图显示了本发明的一个优选实施方式。在解链温度mp1的荧光信号FL 1表明目标序列p1存在于反应中。
图6
图6显示单一双标记探针的荧光信号强度，其在循环过程中和PCR过程中变化。当结合所述靶标时该信号强烈。分离时信号较弱。由于模板数的增加，在所述反应趋向结束时该信号变得更强。
图7
图7显示实施用于扩增和检测目标核酸序列的方法的筒部分，其包括：(i)用于扩增反应的第一反应室，(ii)两个或更多反应室，其中之一包含至少3种对核酸序列特异的探针，其中至少两种探针携带相同标记，其中携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和具有相同标记的另一探针有大于5℃的差异，其中所述携带相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，(iii)所述第一和所述两个或更多反应室之间的连接。
图8
图8A显示其上/中装有众多本发明筒的转子。各筒具有用于所述扩增反应的第一室和用于检测的其他3室。所述转子速度用于将所述PCR反应旋转入所述检测室。所述筒具有微流体通道。所述筒可钩挂在转子上。所述转子可在考百特(Corbett)实时循环仪中运行。显示24个PCR反应室和72个检测室。已知每个室检测例如24种探针，所述转子可在一个反应中分析1728种目标。
图8B显示单一筒的俯视图。
图8C显示单一筒的仰视图。
图9
图9显示不同的筒实施方式。在此多个筒制于一个塑料片中。
图10
图10显示本发明的工作流程。图A中显示如前所述的本发明优选实施方式。在例如第一行用共享同一标记的探针进行所述反应。然而，如上图A所示，所述探针的解链温度之间相差约5℃，从约60℃到约80℃。当所述探针信号也在实时PCR中检测时，给定的探针解链温度优选从约60℃(约为平均值+/-约10％偏差)到约80℃，因为这些温度能与典型的PCR参数较好兼容。在本实施例中，样品中包含靶标22。图B图示显示在样品中包含靶标22的情况(黑色圆圈表示)下该多重实验的实时PCR结果，其通过检测通道的扩增曲线上升而显而易见，该检测通道检测靶标22的探针上所含标记。获取所述实时PCR数据是任选步骤，但不是进行本发明方法所必需的。图1C显示在存在足够产物以产生信号的反应阶段中进行多通道解链曲线实验的结果。在优选实施方式中，在所述反应的平台期完成此实验。通过进行多通道解链曲线分析，可用区分解链温度的方法来鉴定每种探针。例如D列的探针都具有相同的解链温度但标记不同。因此可用不同标记的方法来鉴定每种探针，使得所述多通道解链曲线分析成为本发明的核心成分。所述解链峰值代表dF/dT信号，其中最大峰值指各探针的熔点。
图11
图11显示所述实施例的多通道解链曲线分析的结果。获得表中模板PCR条件下四重反应的荧光解链曲线。标有“绿”、“橙”和“深红”的水平图表示获自表中指定的各检测通道的信号。虚水平线分开的数据组代表表9中6种不同模板PCR条件下的结果，清楚显示仅在预期检测通道中的预期阳性解链峰值信号和预期熔点，阳性对照(内参)一直可靠地为阳性。获得的熔点概括于表11。
图12
图12显示实施例2的PCR后解链曲线分析的结果。图A显示获自表20实验PCR条件的反应中单重反应的荧光解链峰值(df/dT)。四种探针各自测量的解链峰值示于各图下方并概括于表21。
图B显示荧光解链峰值(df/dT)(从左至右)，第一个是双重的Ubi和HPRT，第二个是三重的Ubi、HPRT和HSP，且第四个(黑框)是四重的Ubi、HPRT、HSP和Cmyc。四种探针各自测量的解链峰值示于各图下方并概括于表21。获得的熔点概括于表21。
这些数据清晰证明数种携带同一标记的探针可通过它们的熔点而明显区分。
Figure IPA00001462422000011
Figure IPA00001462422000021
Figure IPA00001462422000031
Figure IPA00001462422000041
Figure IPA00001462422000051
Figure IPA00001462422000061
Figure IPA00001462422000071

Claims (10)

1.在反应筒内扩增和检测核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包括至少一核酸分子的样品，
(ii)在所述筒的第一反应室内提供用于扩增反应的试剂，
(iii)将所述样品与扩增试剂混合，
(iv)在所述筒的所述第一反应室内扩增所述至少一核酸，
(v)将至少部分所述扩增反应转移到所述筒的各含有探针组的第二和第三反应室中，其中
a.各探针组由至少3种探针组成，
b.每种所述探针对核酸序列特异，
c.每组至少有两种探针携带相同标记，
d.给定的探针组里携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和所述探针组里具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，
e.其中携带所述相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，
(vi)进行熔点分析以确定哪种所述探针特异性结合核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是多重聚合酶链式反应。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少1种探针组包含至少3种具有相同标记的探针。
4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述筒还包括用于熔点分析的反应室。
5.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述筒是一次性制品且当所述筒置于扩增设备中时进行所述扩增和熔点分析。
6.如权利要求5所示的方法，其特征在于，所述扩增设备包括转子且当所述筒在所述转子中时进行所述扩增和熔点分析并且通过离心力将所述至少部分所述扩增反应转移至所述筒的第二、第三和更多反应室。
7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述探针选自以下组：TaqMan探针、分子信标探针、蝎形探针和光循环仪探针、杂交探针和置换探针。
8.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光标记且所述标记选自下组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、雅基马黄、Alexa FluorPET、Biosearch BlueTM、Marina Blue
Figure FPA00001462422400021
、Bothell Blue
Figure FPA00001462422400022
、Alexa Fluor
Figure FPA00001462422400023
、350FAMTM、SYBR
Figure FPA00001462422400024
绿1、荧光素、EvaGreenTM、Alexa Fluor488JOETM、VICTM、HEXTM、TETTM、CAL Fluor
Figure FPA00001462422400026
金540、Yakima Yellow
Figure FPA00001462422400027
、ROXTM、CAL Fluor
Figure FPA00001462422400028
红610、Cy3.5TM、TexasRed
Figure FPA00001462422400029
、Alexa Fluor
Figure FPA000014624224000210
、568Cy5TM、QuasarTM 670、LightCycler Red640
Figure FPA000014624224000211
、Alexa Fluor633QuasarTM 705、LightCycler Red705
Figure FPA000014624224000212
、Alexa Fluor
Figure FPA000014624224000213
680、SYTO
Figure FPA000014624224000214
9、LC Green
Figure FPA000014624224000215
、LC Green
Figure FPA000014624224000216
Plus+、EvaGreenTM。
9.实施用于扩增和检测目标核酸序列的方法的筒，所述筒包括：
a.用于扩增反应的第一反应室，
b.两个或更多反应室，其中之一包含至少3种对核酸序列特异的探针，其中至少两种探针携带相同标记，其中携带相同标记的各探针的解链温度(Tm)和具有相同标记的另一探针有大于2℃的差异，其中所述携带相同标记的探针在解链温度(Tm)上不同，从而它们可通过熔点相区分，
c.所述第一和所述两个或更多反应室之间的连接。
10.如权利要求9所述的筒，其特征在于，所述筒是微流体筒。
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