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CN102428103A - 抗light的人源化抗体及其使用 - Google Patents

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CN102428103A CN2010800216186A CN201080021618A CN102428103A CN 102428103 A CN102428103 A CN 102428103A CN 2010800216186 A CN2010800216186 A CN 2010800216186A CN 201080021618 A CN201080021618 A CN 201080021618A CN 102428103 A CN102428103 A CN 102428103A
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Abstract

本发明涉及特异性结合LIGHT多肽的抗原结合多肽或其变体或衍生物。本发明还涉及制备所述抗体的方法以及尤其在免疫性疾病或病症、炎症性疾病或病症和恶性疾病或病症(例如，炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、类风湿关节炎和移植)的治疗或诊断中使用所述抗体的方法。

Description

抗LIGHT的人源化抗体及其使用
背景技术
本申请要求2009年3月24日提交的美国临时申请第61/202,661号的权益。美国临时申请第61/202,661号的全部内容通过引用并入本文。
本发明涉及特异性结合LIGHT多肽的抗原结合多肽和制备及使用该类抗体的方法。具体地，本发明涉及特异性结合LIGHT多肽的人源化抗原结合多肽。所述抗原结合多肽用于治疗和诊断免疫性疾病和病症、炎症性疾病和病症和恶性疾病和病症，例如，炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、类风湿关节炎和移植。
与肿瘤坏死因子(TNF)在结构上有关的蛋白质统称为TNF超家族。LIGHT是TNF超家族的一个成员，其在被激活的T细胞和未成熟的树突状细胞中表达(Tamada等，J.Immunology.2000)。LIGHT是II型跨膜蛋白，被称为TNF超家族成员14(TNFSF14)，也被称为TL5、LTg、CD258和HVEML。LIGHT是T协同刺激分子，LIGHT诱导T细胞增殖和细胞因子的产生(Tamada K.等，Nat.Med.2000)。LIGHT也诱导单核细胞和内皮细胞中的炎症反应(Otterdal等，Blood 2006；Chang等，J.Biomed.Sci.2005)。
LIGHT结合于在不同细胞类型上表达的3个不同受体：在T-细胞和B细胞上表达的疱疹病毒进入介质(HVEM)(Kwon等，J.Biol.Chem 1997)、在基质细胞和非造血细胞上表达的淋巴毒素β受体(LTβR)(Ettinger等，Curr TopMicrobiol Immunol.2000)和诱骗受体3/TR6。树突状细胞和T细胞中的LIGHT增强了T细胞增殖和细胞因子的产生。rLIGHT可直接协同刺激T细胞反应(Tamada K.等，Nat.Med.2000)。
LIGHT在各种炎症性疾病和病症中的作用已通过使用LIGHT缺陷模型和LIGHT过表达转基因动物的各种模型所证明。LIGHT在小鼠中的过表达导致活化的外周T细胞群过度产生和严重的自身免疫性疾病的自发产生(Wang等，J.Clin.Invest.2001)。LIHGT的靶向破坏导致T细胞的协同刺激活化和Th1型免疫反应方面的缺陷(Scheu等，J.Exp.Med.2002；Xu等J.Immunol.2007)。
由于LIGHT对T细胞的有效刺激活性，LIGHT是慢性炎症的重要组成部分。因此，LIGHT的抗体，尤其是LIGHT拮抗剂抗体，会在治疗与慢性炎症有关的疾病中有用。这种疾病包括，但不仅限于下列讨论的疾病。
肠道菌群失调的免疫反应是炎症性肠病(IBD)的主要病因。T辅助细胞在IBD的异常免疫反应中有重要作用。具体而言，已经将Th1细胞与克罗恩病联系起来。一些研究已经验证了LIGHT在肠道炎症中的关键作用。LIGHT过表达的转基因小鼠易患T细胞介导的自身免疫疾病，且LIGHT转基因小鼠表现出严重的T细胞介导的肠道炎症并患上结肠炎(Wang J.等，J.Clin.Invest.2004；Wang J.等，J.Immunol2005；Wang等，J.Clin.Invest 2001；Shaikh等，J.Immunol.2001)。此外，用可溶性LTβR-Fc阻断LIGHT和其受体的相互作用改善了TNBS诱导的结肠炎(An，MM等，Pharmacol.Res.2005)。在人体染色体19p13.312-14上，LIGHT位于与IBD感受性基因座位重叠的位置(Rioux等，Am.J.Hum.Genet.(2000)；Bonen等，Gastroenterology(2003))。
在类风湿关节炎(RA)患者的关节滑液中已检测出高水平的LIGHT蛋白。例子可参见，RA患者滑膜成纤维细胞中重组LIGHT诱导的炎症介质(Recombinant LIGHT-induced inflammatory mediators in synovial fibroblastsfrom RA patients，Pierer等，Rheumatology(2007)；Kang等，Arthritis &Rheumatism(2007))和阻断LIGHT-受体相互作用防止胶原诱导性关节炎的进展(Blocking LIGHT-receptor interaction prevents development ofCollagen-Induced Arthritis，Fava等，J.Immunol.(2003))。最后，在2007年11月，Biogen IDEC公司宣布了在IIa期临床试验中对RA患者使用baminercept(LTβR-Fc融合蛋白)(Biogen IDEC Press Release，2007年11月9日)。
在肝炎的实验模型中LIHGT被上调。通过利用抗体或者可溶性LTβR处理阻断了LIGHT和LIGHT受体的相互作用，显著地减弱了肝脏炎症，减少了炎症细胞因子的产生并防止小鼠患上致命的肝炎(Anand等，J.Clin.Invest.(2006)；An等Biol.Pharm.Bull.(2006))。
几份研究表明，在动物模型中阻断LIGHT-受体相互作用防止移植物抗宿主病(GVHD)并且延长同种异体移植物的存活(Xu等，Blood(2007)；Ye等，J.Exp.Med.(2002)；Fan等，Transplantation(2007))。
除了上面提到的研究之外，阻断LIGHT受体(LTβR和HVEM)还显著地减少不同动物模型中的疾病迹象，所述疾病例如，胶原诱导性关节炎(CIA)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型是多发性硬化症(MS)的动物模型(Fava等，J Immunol.(2003)和Suen等，J.Exp.Med.(1997))。LIGHT敲除的小鼠也在IL-12的产生方面有缺陷，因此缺乏对炎症刺激产生IFNγ介导的、抗原特异性Th1反应的能力。
因此，本领域有必要创造特异性结合于LIGHT的抗原结合多肽和拮抗剂抗原结合多肽以治疗炎症性、恶性、自身免疫性疾病和病症，例如多发性硬化症、IBD和RA以及上文描述的或本领域已知的其他疾病。与可溶性受体的使用相比，特异性结合LIGHT的抗原结合多肽和拮抗剂抗原结合多肽有一些优势，例如：1)与Fc-融合蛋白相比，抗体在血流中具有更长的半衰期；2)与可溶性受体相比，抗体具有更高的疗效，因为抗体可被设计成对LIGHT具有更高的亲和力；以及3)由于对LIGHT的特异性，抗体是比可溶性受体更为安全的选择。LIGHT拮抗剂抗体只会阻断LIGHT介导的信号转导从而改善局部炎症过程，而没有由可溶性受体引起的可最终导致免疫抑制的次级淋巴组织结构的全身性衰竭。
发明内容
本发明基于LIGHT多肽在炎症疾病中的作用。具体地，本发明基于LIGHT刺激诸如IFN-γ和IL-8之类的致炎性细胞因子的能力并且基于LIGHT是CD3协同刺激的Th17细胞产生的IL-17的强效刺激剂。由于最近发现Th17细胞是所有主要的自身免疫病症中引起持续发炎和组织损伤的炎症过程的重要驱动因素，因此LIGHT和IL-17的产生之间的联系尤其重要，所述主要的自身免疫性疾病如多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)和类风湿关节炎(RA)。
总体上，本发明涉及特异性结合于TNF样细胞因子TL5的抗原结合多肽，所述TNF样细胞因子TL5又称LIGHT(参见GenBank登录号AF036581，通过引用全部并入本文)。在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽包括人源化重链可变区(VH)和人源化轻链可变区(VK)。例如，在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽包括人类抗体的轻链和重链可变区的骨架区(FR)，同时基本上保留亲本单克隆抗体的抗原结合特异性(即互补决定区(CDR))。除CDR外，人源化重链可变区和/或人源化轻链可变区至少约87％人源化、至少约90％人源化、至少约95％人源化、至少约98％人源化或至少约100％人源化。抗原结合多肽分子来自单克隆抗体供体(例如，小鼠单克隆抗体供体)并包括来自单克隆抗体的CDR(例如，小鼠单克隆CDR)。在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽是LIGHT活性的拮抗剂和/或LIGHT与LIGHT受体相互作用的拮抗剂。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含氨基酸序列X1Y X2X3X4(SEQ IDNO：18)，其中X1是氨基酸D、S、T或N，X2是氨基酸Y、L或W，X3是氨基酸I或M，且X4是氨基酸Y、H、E或N；(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含氨基酸序列X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17(SEQ ID NO：19)，其中X5是氨基酸Y、M、V或W，X6是氨基酸D、N、H或F，X7是氨基酸Y、G或S，X8是氨基酸N、S、T或D，X9是氨基酸G、S或D，X10是氨基酸G、D、E或I，X11是氨基酸T或S，X12是氨基酸K或R，且X13是氨基酸Y或L，X14是氨基酸Q或E，X15是氨基酸K或N，X16是氨基酸K、I或R，且X17是氨基酸G、A或D；(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：(i)WX18X19(SEQ IDNO：20)；(ii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28(SEQ ID NO：21)；和(iii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF(SEQ ID NO：22)，其中X18是氨基酸D或N，X19是氨基酸R或Y，X20是氨基酸E、T或G，X21是氨基酸D、S或N，X22是氨基酸Y或G，X23是氨基酸G、S或V，X24是氨基酸I、S或W，X25是氨基酸S、W或A，X26是氨基酸T、F或M，X27是氨基酸Y、P或D，且X28是氨基酸S或Y。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：(i)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38(SEQ ID NO：38)；(ii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42(SEQ ID NO：39)；和(iii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H(SEQ ID NO：40)，其中X29是氨基酸K或R，X30是氨基酸A或S，X31是氨基酸Q或K，X32是氨基酸D、S或N，X33是氨基酸V、I或L，X34是氨基酸G、S、V或L，X35是氨基酸T、N或H，X36是氨基酸A、N或S，X37是氨基酸V、L、N或G，X38是氨基酸A、H、G或Y，X39是氨基酸N或T，X40是氨基酸T或Y，X41是氨基酸Y或M，X42是氨基酸F或H；(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列X43X44X45X46X47X48X49(SEQID NO：41)，其中X43是氨基酸W、Y、K或I，X44是氨基酸A、T或V，X45是氨基酸S或Y，X46是氨基酸T、Q或N，X47是氨基酸R、S或L，X48是氨基酸H、I、F或E，且X49是氨基酸T或S；和(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列X50X51X52X53X54X55PX56T(SEQ ID NO：42)，其中X50是氨基酸Q或S，X51是氨基酸Q或H，X52是氨基酸S或Y，X53是氨基酸S、N、T或R，X54是氨基酸S、R、H或E，X55是氨基酸Y、W、V或L，且X56是氨基酸L或Y。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含氨基酸序列X1YX2X3X4(SEQ ID NO：18)，其中X1是氨基酸D、S、T或N，X2是氨基酸Y、L或W，X3是氨基酸I或M，且X4是氨基酸Y、H、E或N；(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含氨基酸序列X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17(SEQ ID NO：19)，其中X5是氨基酸Y、M、V或W，X6是氨基酸D、N、H或F，X7是氨基酸Y、G或S，X8是氨基酸N、S、T或D，X9是氨基酸G、S或D，X10是氨基酸G、D、E或I，X11是氨基酸T或S，X12是氨基酸K或R，且X13是氨基酸Y或L，X14是氨基酸Q或E，X15是氨基酸K或N，X16是氨基酸K、I或R，且X17是氨基酸G、A或D；和(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：(i)WX18X19(SEQ ID NO：20)；(ii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28(SEQID NO：21)；和(iii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF(SEQ ID NO：22)，其中X18是氨基酸D或N，X19是氨基酸R或Y，X20是氨基酸E、T或G，X21是氨基酸D、S或N，X22是氨基酸Y或G，X23是氨基酸G、S或V，X24是氨基酸I、S或W，X25是氨基酸S、W或A，X26是氨基酸T、F或M，X27是氨基酸Y、P或D，且X28是氨基酸S或Y。所述人源化抗体轻链可变区包含：(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：(i)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38(SEQ ID NO：38)；(ii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42(SEQ ID NO：39)；和(iii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H(SEQ ID NO：40)，其中X29是氨基酸K或R，X30是氨基酸A或S，X31是氨基酸Q或K，X32是氨基酸D、S或N，X33是氨基酸V、I或L，X34是氨基酸G、S、V或L，X35是氨基酸T、N或H，X36是氨基酸A、N或S，X37是氨基酸V、L、N或G，X38是氨基酸A、H、G或Y，X39是氨基酸N或T，X40是氨基酸T或Y，X41是氨基酸Y或M，X42是氨基酸F或H；(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列X43X44X45X46X47X48X49(SEQ ID NO：41)，其中X43是氨基酸W、Y、K或I，X44是氨基酸A、T或V，X45是氨基酸S或Y，X46是氨基酸T、Q或N，X47是氨基酸R、S或L，X48是氨基酸H、I、F或E，且X49是氨基酸T或S；和(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列X50X51X52X53X54X55PX56T(SEQID NO：42)，其中X50是氨基酸Q或S，X51是氨基酸Q或H，X52是氨基酸S或Y，X53是氨基酸S、N、T或R，X54是氨基酸S、R、H或E，X55是氨基酸Y、W、V或L，且X56是氨基酸L或Y。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含选自以下的氨基酸序列：(i)SSYIH(SEQ ID NO：23)，(ii)DYYIY(SEQ ID NO：26)，(iii)TYLIE(SEQ IDNO：29)，(iv)TYWMN(SEQ ID NO：32)，和(v)NYLIE(SEQ ID NO：35)；(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含选自以下的氨基酸序列：(i)WIFPGSDITKYNEKFKG(SEQ ID NO：24)，(ii)YIDPYNGGTKYNQKFKD(SEQ ID NO：27)，(iii)VINPGTGETKYNENFRA(SEQ ID NO：30)，(iv)MIHPSDSESRLNQKFID(SEQ ID NO：33)，和(v)VINPGSGDTKYNENFKG(SEQ ID NO：36)；和(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：(i)EDYGISTYSAMDF(SEQ ID NO：25)，(ii)TSGSSWFPY(SEQ IDNO：28)，(iii)WDR(SEQ ID NO：31)，(iv)GNYVWAMDY(SEQ ID NO：34)，和(v)WNY(SEQ ID NO：37)。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：(i)KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：43)，(ii)RASQSISNNLH(SEQ ID NO：46)，(iii)RSSQNLVHSNGNTYFH(SEQ ID NO：49)，(iv)RASKSVSTSGYTYMH(SEQ ID NO：52)，和(v)RSSQSLLHSNGNTYFH(SEQ ID NO：55)；(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含选自以下的氨基酸序列：(i)WASTRHT(SEQID NO：44)，(ii)YTYQSIS(SEQ ID NO：47)，(iii)KVSNRFS(SEQ IDNO：50)，和(iv)ITSNLES(SEQ ID NO：53)；和(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的氨基酸序列：(i)QQYSSYPLT(SEQ ID NO：45)，(ii)QQSNRWPLT(SEQ ID NO：48)，(iii)SQSTHVPYT(SEQ ID NO：51)，和(iv)QHSRELPYT(SEQ ID NO：54)。
本发明的另一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区和/或人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含氨基酸序列SYYIH(SEQ ID NO：23)，(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含氨基酸序列WIFPGSDITKYNEKFKG(SEQ ID NO：24)，和(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含氨基酸序列EDYGISTYSAMDF(SEQ ID NO：25)；所述人源化抗体轻链可变区包含：(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：43)，(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：44)，和CDR-L3，所述CDR-L3(3)包含氨基酸序列QQYSSYPLT(SEQ ID NO：45)。
本发明的实施方式还包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMELSX′10LRSX′11DTAVYYCARWX18X19WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO：1)；
(2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMELSX′10LRSX′11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)；和
(3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMELSX′10LRSX′11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)，其中X1是氨基酸D、S、T或N，X2是氨基酸Y、L或W，X3是氨基酸I或M，X4是氨基酸Y、H、E或N，X5是氨基酸Y、M、V或W，X6是氨基酸D、N、H或F，X7是氨基酸Y、G或S，X8是氨基酸N、S、T或D，X9是氨基酸G、S或D，X10是氨基酸G、D、E或I，X11是氨基酸T或S，X12是氨基酸K或R，且X13是氨基酸Y或L，X14是氨基酸Q或E，X15是氨基酸K或N，X16是氨基酸K、I或R，且X17是氨基酸G、A或D，其中X18是氨基酸D或N，X19是氨基酸R或Y，X20是氨基酸E、T或G，X21是氨基酸D、S或N，X22是氨基酸Y或G，X23是氨基酸G、S或V，X24是氨基酸I、S或W，X25是氨基酸S、W或A，X26是氨基酸T、F或M，X27是氨基酸Y、P或D，X28是氨基酸S或Y，且其中X′1是氨基酸R或G，X′2是氨基酸M或I，X′3是氨基酸K或R，X′4是氨基酸V或A，X′5是氨基酸M、L或I，X′6是氨基酸V或R，X′7是氨基酸T或K，X′8是氨基酸A、I或T，X′9是氨基酸V或A，X′10是氨基酸R或S，且X′11是氨基酸D或E。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)，
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)，
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)，
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGTGETKYNENFRARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARWDRWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)，和
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSESRLNQKFIDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVWAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(1)
X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38WX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36PX′37X′38LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′47X′48EDX′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQ ID NO：9)；
(2)
X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42WX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36X′37X′38LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′4 7X′48ED X′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQ IDNO：10)；和
(3)
X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42HWX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36X′37X′3 8LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′47X′48EDX′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQ IDNO：11)，其中X29是氨基酸K或R，X30是氨基酸A或S，X31是氨基酸Q或K，X32是氨基酸D、S或N，X33是氨基酸V、I或L，X34是氨基酸G、S、V或L，X35是氨基酸T、N或H，X36是氨基酸A、N或S，X37是氨基酸V、L、N或G，X38是氨基酸A、H、G或Y，X39是氨基酸N或T，X40是氨基酸T或Y，X41是氨基酸Y或M，X42是氨基酸F或H，X43是氨基酸W、Y、K或I，X44是氨基酸A、T或V，X45是氨基酸S或Y，X46是氨基酸T、Q或N，X47是氨基酸R、S或L，X48是氨基酸H、I、F或E，X49是氨基酸T或S，X50是氨基酸Q或S，X51是氨基酸Q或H，X52是氨基酸S或Y，X53是氨基酸S、N、T或R，X54是氨基酸S、R、H或E，X55是氨基酸Y、W、V或L，X56是氨基酸L或Y，且其中X′12是氨基酸D或E，X′13是氨基酸I或V，X′14是氨基酸V或Q，X′15是氨基酸M或L，X′16是氨基酸S或T，X′17是氨基酸S、D、A或L，X′18是氨基酸S、T或F，X′19是氨基酸L或Q，X′20是氨基酸A、S或P，X′21是氨基酸V或A，X′22是氨基酸S或T，X′23是氨基酸P、L或V，X′24是氨基酸G或K，X′25是氨基酸E、Q或D，X′26是氨基酸R、K或P，X′27是氨基酸A或V，X′28是氨基酸T或S，X′29是氨基酸I或L，X′30是氨基酸S、T或N，X′31是氨基酸F或Y，X′32是氨基酸Q或L，X′33是氨基酸K或R，X′34是氨基酸G或D，X′35是氨基酸Q或K，X′36是氨基酸A、S或P，X′37是氨基酸K、R或Q，X′38是氨基酸L或R，X′39是氨基酸Y或K，X′40是氨基酸V或I，X′41是氨基酸S、A或D，X′42是氨基酸D或E，X′43是氨基酸K或T，X′44是氨基酸S或N，X′45是氨基酸S或R，X′46是氨基酸V或L，X′47是氨基酸Q或E，X′48是氨基酸P、A或S，X′49是氨基酸F、A或V，X′50是氨基酸A或G，X′51是氨基酸T或V，且X′52是氨基酸R或K。
本发明的一些实施方式也包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：12)，
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYTYQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNRWPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)，
EIVMTQSPATLSVSPGEKATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTYQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNRWPLTFGQGTRVEIKR(SEQ ID NO：14)，
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：15)，
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：16)，和
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYITSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：17)。
本发明的一些实施方式包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)和(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：12)。
在本发明的一些实施方式中，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽包含上述人源化重链或人源化轻链中的任一个或其组合。另外，在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽包含来自重链的上述CDR区(即CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)中的一个或一个以上，或来自轻链的上述CDR区(即CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3)中的一个或一个以上或其组合。
在本发明的其他实施方式中，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽是抗体分子或其片段，所述片段例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或scFv分子。
在一些实施方式中，所述抗原结合多肽是抗体分子。抗体分子可包含嵌合抗体，包括例如，融合于鼠重链可变区和鼠轻链可变区的人重链恒定区和人轻链恒定区。在其他实施方式中，所述抗原结合多肽是scFv分子，所述scFv分子包含具有选自NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH的化学式的多肽，其中L是前导序列，VH是人源化抗体重链可变区，X是连接多肽，VK是人源化抗体轻链可变区。在另外的实施方式中，将scFv分子融合或连接于人类血清白蛋白多肽(HSA)以产生scFv HSA融合分子。可将scFv分子融合或连接于HSA的N-末端或C-末端。在其他的实施方式中，所述抗原结合多肽是Fab片段。可将本发明的Fab片段融合或连接于HSA上。可将Fab片段的重链或轻链融合或连接于HSA的N-末端或C-末端。
本发明的一些实施方式包括结合或融合于治疗剂或诊断剂的抗原结合多肽。例如，治疗剂可选自：细胞毒性剂、放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂及其组合。诊断剂的例子可包括放射性标记物、光敏诊断剂、超声增强剂或非放射性标记物。
本发明的一些实施方式还包括含有本发明抗原结合多肽的组合物和制备这种多肽的方法。此外，本发明的实施方式包括治疗或诊断炎症性、免疫性或恶性疾病或病症的方法，所述方法包括将本发明的抗原结合多肽和组合物给药于有此需要的患者。在其他实施方式中，本发明包括使用本发明的组合物治疗疾病的方法，所述疾病包括但不限于：自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎(例如，类风湿关节炎)、多发性硬化症、移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、中枢神经系统损伤、诸如克罗恩病、银屑病、白血病或淋巴瘤(例，慢性淋巴细胞白血病(CLL))之类的Th1介导的肠道疾病、动脉粥样硬化、肺癌与结肠癌以及诸如肝炎之类的病毒感染。
在一些实施方式中，本发明包括分离的编码前述抗原结合多肽的多核苷酸。可将多核苷酸可操作地连接至启动子以在合适的宿主细胞中表达所编码的多肽。另外，本发明的实施方式包括生产本发明的抗原结合多肽的方法，所述方法包括：a)培养用多核苷酸转化的细胞以表达所编码的多肽，所述多核苷酸编码本发明的抗原结合多肽；b)回收由此表达的多肽。
附图说明
图1表示从外周血淋巴细胞(PBL)中分离Th1和Th17细胞，所述外周血淋巴细胞(PBL)由聚蔗糖密度梯度离心法从血液分离。去除单核细胞后，用2μg/mL PHA加IL-12和抗-IL-4抗体对Th1细胞进行培养。Th17细胞在37℃下被结合于板的抗-CD3抗体加可溶性抗-CD28抗体或IL-12加IL-18刺激2天。收集细胞培养的上清液，并由ELISA检测上清液中IFN-γ和IL-17的产生。
图2表示LIGHT如何诱导Th17细胞产生IL-17。37℃下，在不存在LIGHT或存在各种浓度的LIGHT的情况下，用结合于板的抗-CD3抗体刺激Th17细胞2天。收集细胞培养上清液，并用ELISA检测上清液中IL-17的产生。
图3说明鼠抗-LIGHT单克隆抗体(10D11)如何抑制LIGHT与其受体结合。用蛋白A捕获法将LIGHT受体HVEM(TR2)、诱骗受体3(TR6)和LTβR的Fc融合蛋白包被在96孔板上。在不存在LIGHT抗体或存在各种浓度的LIGHT抗体的情况下，使用链霉亲和素-HRP测定LIGHT-生物素与受体的结合。
图4说明鼠抗-LIGHT单克隆抗体(10D11)如何抑制LIGHT诱导内皮细胞产生IL-8。将HUVEC细胞接种于96孔板中。在不存在LIGHT抗体或存在LIGHT抗体(10D11)和非中和对照(19H9)的情况下，用LIGHT处理汇合的HUVEC细胞5小时。用ELISA测定来自HUVEC的IL-8分泌。
图5A至5C说明各种抗-LIGHT鼠单克隆抗体如何抑制LIGHT诱导的HT-29细胞凋亡。LIGHT/TL5诱导结肠癌细胞系HT-29的细胞死亡。用HT-29细胞活性检测(如实施例2所述)测定LIGHT抗体的中和活性。37℃下用IFN-γ预处理HT-29细胞6小时。然后在不存在抗-LIGHT或存在各种浓度的抗-LIGHT和对照抗体或LTβR-Fc的情况下用LIGHT培养细胞3天。细胞活性用细胞滴度Glo试剂(Promega)测定。图5A显示鼠抗-LIGHT单克隆抗体(10D11)抑制LIGHT诱导的HT-29细胞凋亡的能力。图5B和图5C显示鼠源抗体5E10、13C7、14A10、14G8、15G4、7G5、18F1、2B12、16F12、18B1和10D11AB抑制人(B)和猕猴(C)LIGHT诱导的HT-29细胞凋亡的能力。
图6A表示小鼠抗-LIGHT 10D11的VH结构域与最接近的人胚系VH1-02的比对。该比对用作制备人源化10D11VH的模板，所述人源化10D11VH在图6A确定为Hum 10D11VH#1。
图6B表示小鼠抗-LIGHT 10D11的VH结构域与确定为CAI54212的表达抗体VH结构域的比对，CAI54212部分来自图6A的VH1-02胚系。该序列比对用作制备人源化10D11VH的模板，所述人源化10D11VH在图6B确定为Hum10D11VH#2。
图6C表示小鼠抗-LIGHT 10D11的VK结构域与最接近的人类胚系基因A26的比对。该序列比对用作制备人源化10D11VK的模板，所述人源化10D11VK在图6C确定为10D11VK#1。
图7表示2种不同的人源化LIGHT抗体抑制LIGHT诱导的HT-29细胞凋亡。37℃下用IFN-γ预处理HT-29细胞6小时。然后在不存在小鼠和人源化LIGHT抗体或存在各种浓度的小鼠和人源化LIGHT抗体或对照抗体的情况下，用LIGHT培养细胞3天。用细胞滴度Glo试剂(Promega)测定细胞活性。
图8表示完全人源化LIGHT抗体抑制LIGHT诱导的HT-29细胞凋亡。37℃下用IFN-γ预处理HT-29细胞6小时。然后在不存在小鼠和人源化LIGHT抗体或存在各种浓度的小鼠和人源化LIGHT抗体或对照抗体的情况下，用LIGHT培养细胞3天。用细胞滴度Glo试剂(Promega)测定细胞活性。
图9A和图9B表示，与对照抗体16H02相比，人源化抗体抑制人LIGHT(A)和猕猴LIGHT(B)诱导的HT29细胞凋亡。37℃下用IFN-γ预处理HT-29细胞6小时。然后在不存在小鼠和人源化LIGHT抗体或存在各种浓度的小鼠和人源化LIGHT抗体或对照抗体的情况下，用LIGHT培养细胞3天。用细胞滴度Glo试剂(Promega)测定细胞活性。
图10A和图10B表示LIGHT抗体和活化的T细胞的结合。Th1、Th2和Th17细胞由外周血淋巴细胞(PBL)产生，所述PBL通过聚蔗糖密度梯度离心法从血液中分离。Th1和Th17细胞如前述(图1)产生。通过2μg/mL PHA加IL-4和抗-IFN-α抗体培养PBL 3天产生Th2细胞。3天后，细胞用5ng/mL IL-12维持。用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素激活细胞持续24小时以诱导LIGHT表达。通过流式细胞仪使用与PE结合的山羊抗-小鼠耦合抗体测定LIGHT抗体与活化T细胞的结合。
图10A表示小鼠LIGHT抗体结合于活化的Th17细胞。常温下将LIGHT抗体与Th17细胞一起孵育40分钟。小鼠IgG1用作阴性对照。
图10B表示，与对照组相比，人源化5E10抗体与Th1、Th17和Th2活化的T细胞的结合。用PMA/离子霉素活化极化的T细胞持续24小时。常温下将细胞与生物素标记的LIGHT抗体或对照抗体一起孵育40分钟。用PBS洗2次后，通过流式细胞仪用结合于PE的链霉亲和素确定抗体与表达在活化T细胞上的LIGHT的结合。图中虚线表示人源化LIGHT抗体的结合。实体填充表示对照抗体的结合。
图11A和图11B显示候选的鼠抗-LIGHT抗体中的重链可变结构域(A)和轻链可变结构域(B)(5E10、13C7、14G8和18B1)的序列比对。图中的方框表示每个序列的CDR结构域。
图11C和图11D表示鼠5E10重链可变VH(C)和轻链可变VK(D)与三个最匹配的人胚系重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VK)序列的序列比对。
具体实施方式
术语的定义
注意，单数形式(“a”或“an”)是指一个(一种)或一个以上(一种以上)；例如，“单数形式(“an”)抗原结合多肽”理解为代表一种或一种以上抗原结合多肽。因此，单数形式(“a”或“an”)、“一个(一种)或一个以上(一种以上)”和“至少一个(一种)”在本发明中可互相交换使用。
如本发明所使用的术语“多肽”意为包含单个“多肽”和多个“多肽”，并指由酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或两个以上氨基酸的任何单链或多链，且不指明产物的具体长度。因此，用于指两个或两个以上氨基酸的单链或多链的肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语都包含在“多肽”的定义内，且可用术语“多肽”替代任何上述肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语或与任何上述肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语互换使用。术语“多肽”还意指多肽表达后修饰的产物，包括而不限于被已知的保护基团糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化，以及蛋白水解切割或被非天然生成的氨基酸修饰。多肽可来自天然的生物来源或由重组技术产生，但未必由特定的核酸序列翻译而来。它可以任何方式生成，包括通过化学合成而生成。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不在其自然环境中的多肽。不需要特殊水平的纯化。例如，分离的多肽可从天然或自然的环境中分离出去。就本发明的目的而言，认为宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白是分离的，正如已用任何适当的技术分离、分馏、部分纯化或完全纯化的天然多肽或重组多肽。
术语“多核苷酸”意为包括单个核苷酸和多个核苷酸，并指分离的核苷酸分子或结构，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可含有常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，诸如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键之类的酰胺键)。术语“核酸”指出现在多核苷酸中的任何一个或一个以上的核酸片段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意为从自然环境中分离的核酸分子(DNA或RNA)。例如，就本发明的目的而言，认为包含在载体内的编码本发明抗体的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的另外例子包括，保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或完全)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录体。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这种分子。另外，多核苷酸或核酸可为诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子之类的调控元件，或可包括诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子之类的调控元件。
如本发明所使用的“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子构成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但也可认为“终止密码子”是部分编码区，而任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等等)不是部分编码区。本发明的两个或两个以上编码区可出现在单个多核苷酸结构中，例如，在单个载体上，或在分离的多核苷酸结构中(例如，在独立的(不同的)载体上)。此外，任何载体可包含单个编码区或包含两个或两个以上的编码区，例如，单个载体可分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区融合或不融合于编码本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于特定元件或模体，例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在一些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。就DNA而言，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包含启动子和/或其他转录或翻译控制元件，所述控制元件可操作地与一个或一个以上的编码区结合。可操作地结合使基因产物(如多肽)的编码区与一个或一个以上的调控序列以该方式结合，以使基因产物的表达在调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码预期基因产物的mRNA转录，并且两个DNA片段之间的连接性质没有干扰指导基因产物表达的表达调控序列的能力或者没有干扰待转录的DNA模板的能力，那么两个DNA片段(例如多肽编码区和与之相关的启动子)是“可操作地结合”的。因此，如果启动子能够使所述核酸转录，那么启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。启动子可为仅在特定细胞中指导基本的DNA转录的细胞特异启动子。除启动子外，其他转录控制元件(例如增强子、操纵基因、阻遏子和转录终止信号)可与多核苷酸可操作地结合，从而指导细胞特异性转录。本发明公开了合适的启动子和其他转录控制区。
本领域技术人员已知许多转录控制区。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(与内含子-A结合的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子片段。其他转录控制区包括来自脊椎动物基因(例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白)的转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子可诱导的启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
相似地，本领域普通技术人员已知许多翻译控制元件。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子以及来自小核糖核酸病毒的元件(尤其是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌多肽或信号多肽的其他编码区结合，所述分泌多肽或信号多肽指导本发明的多核苷酸编码的多肽分泌。根据信号假说，哺乳细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经开始使生长的蛋白链输出穿过粗面内质网，就从成熟蛋白中切除所述信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员意识到，脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合于该多肽N-末端的信号肽，从完整的或“全长”的多肽中切除所述信号肽从而产生该多肽分泌的或“成熟的”形式。在一些实施方式中，使用天然的信号肽(例如，免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或所述天然的信号肽序列的功能性衍生物，所述功能性衍生物保留了指导与其可操作地结合的多肽分泌的能力。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可由人类组织型纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡萄糖苷酸酶的前导序列代替。
如本发明所描述的“抗体”或“抗体分子”，指全长的(即，自然生成或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)。
本发明包括结合LIGHT的一些抗原结合多肽，所述多肽包括抗体、抗体或抗原结合片段、其变体或衍生物。如上所述，除非特指全尺寸的抗体，术语“抗原结合多肽”包括全尺寸的抗体以及“抗原结合片段”或这些抗体的变体、类似物或衍生物，例如，天然产生的抗体或免疫球蛋白分子或工程抗体分子或以类似的方式将抗原结合于抗体分子的片段-Fab片段、scFv分子等。抗体片段(包括单链抗体)可只包含可变区或包含与下列全部或部分结合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段也包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。
如本发明所使用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等等。不考虑结构，抗体片段与完整抗体所识别的同种抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像适体(spiegelmer)和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过结合于特定抗原以形成复合物的像抗体一样作用的任何合成蛋白或基因工程改造蛋白。例如，抗体片段包括由可变区构成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区构成的“Fv”片段、轻链和重链可变区由肽连接物连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、scFv融合于HSA的N末端或C末端进行表达的scFv HSA融合多肽、Fab’HSA融合多肽和由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单元，在所述Fab’HSA融合多肽中，VH-CH1或VK-CK通过融合于HSA来产生，然后分别和与其同源的VK-CK轻链或VH-CH1重链一起折叠以形成Fab’。
术语“抗原结合多肽”和“免疫球蛋白”在本发明中可互换使用。抗原结合多肽或免疫球蛋白包含重链的至少可变结构域，并通常包含重链和轻链的至少可变结构域。已相对熟知脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构。参见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)。
如以下将详细讨论的，术语“抗原结合多肽”包含各种类型的可从生物化学上区别的多肽。本领域技术人员将认为，重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们之中包含一些亚类(例如γ1至γ4)。所述重链的性质决定抗体的“类别”，所述类别分别是IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等)已被表征并已知其赋予功能性特化作用。根据本发明，本领域技术人员可容易地辨别这些类别中的每一种的修饰类型和同种型的修饰类型，因此所述修饰类型在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别都明显在本发明范围之内，以下讨论主要涉及免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量约53,000至70,000道尔顿的重链多肽。典型地，所述四条链由二硫键以“Y”结构连接，其中轻链从“Y”的开口处开始将重链括在一起并穿过可变区延伸。
轻链分为κ或λ类。每类重链均可与κ或λ轻链结合。一般而言，轻链和重链互相共价结合，两条重链的“尾”部以共价二硫键互相结合；或者当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因改造宿主细胞生成时，所述两条重链的“尾”部以非共价键互相结合。重链中氨基酸序列从在Y结构的叉末端的N-末端开始，至每条链底部的C-末端结束。
轻链和重链均分为结构同源的区域和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”是功能上使用的。就这点而言，认识到轻链(VK)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原的识别和特异性。相反，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域提供重要的生物特性，例如分泌、经胎盘的移动、Fc受体结合、补体结合等等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或氨基末端越远，恒定区结构域的编号越大。N-末端部分是可变区而C-末端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上文所指出的，可变区使抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的子集组合以形成可变区，所述可变区以三维抗原结合位点为特征。这个四级抗体结构形成抗原结合位点，所述位点位于Y每条臂的末端。更具体地，抗原结合位点以每个VH和VK链上的三个CDR(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)为特征。在一些例子中(例如，来自骆驼的一些免疫球蛋白分子或基于骆驼免疫球蛋白设计的一些免疫球蛋白分子)，完整的免疫球蛋白分子可只包含重链，没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)。
在天然产生的抗体中，出现在每个抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、非连续的氨基酸序列，所述氨基酸序列被特异性定位以使抗体在水性环境中呈现三维结构时形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中氨基酸的剩余部分(也称“骨架”区)显示出较少的分子间可变性。骨架区主要采用β-折叠结构，而CDR形成连结β-折叠结构的环，并在某些情况下形成部分β-折叠结构。因此，骨架区起形成支架的作用，所述支架用于通过链间、非共价相互作用以正确的方向定位CDR。定位的CDR形成的抗原结合结构域界定了互补于免疫反应抗原上的表位的表面。所述互补的表面提高了抗体与其关联表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域的普通技术人员可容易地辨别分别包含CDR和骨架区的氨基酸，因为它们已被精确定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，Kabat，E.等，美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，1983；和Chothia与Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987)，上述文献通过引用全部并入本文)。
如果本领域使用和/或接受的术语有两个或两个以上的定义，本发明使用的定义意在包含所有这些定义，除非明确指出相反意义。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽可变区内发现的非连续抗原结合位点。这个特殊的区域已在Kabat等在美国健康与人类服务部发表的文章“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)和Chothia等在J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中发表的文章中描述，上述文献通过引用全部并入本文。当将Kabat和Chothia的CDR定义相互比较时，根据Kabat和Chothia的CDR定义包括氨基酸残基的重叠或氨基酸残基的子集。然而，适用于抗体或其变体CDR的任一定义的应用意在本发明定义及使用的术语的范围之内。包括由以上引用的每一参考文献所定义的CDR的适当的氨基酸残基在下表I中列出以作比较。包含特定CDR的确切的残基数目随CDR的序列和大小而不同。已知抗体的可变区氨基酸序列，本领域的技术人员通常可确定哪些残基包含特定的CDR。
表1
  Kabat   Chothia
  CDR-H1   31-35   26-32
  CDR-H2   50-65   52-58
  CDR-H3   95-102   95-102
  CDR-L1   24-34   26-32
  CDR-L2   50-56   50-52
  CDR-L3   89-97   91-96
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统指定于任何可变结构域序列，无需依赖序列本身以外的任何实验数据。如本发明使用的“Kabat编号”指由Kabat等所提出的编号系统(Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”(1983))。
除了上述表1，Kabat编号系统还描述CDR区如下：CDR-H1大约从氨基酸31(即第一个半胱氨酸残基后约9个残基)开始，包括大约5至7个氨基酸，在下一个色氨酸残基处结束。CDR-H2从CDR-H1末端后第十五个残基开始，包括大约16至19个氨基酸，在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。CDR-H3从CDR-H2末端后大约第三十三个氨基酸残基开始，包括3至25个氨基酸，在序列W-G-X-G处结束，其中X是任意氨基酸。CDR-L1大约从残基24(即半胱氨酸残基后)开始，包括大约10至17个残基，在下一个色氨酸残基处终止。CDR-L2从CDR-L1末端后的大约第十六个残基开始，包括大约7个残基。CDR-L3从CDR-L2末端后大约第三十三个残基(即半胱氨酸残基后)处开始，包括大约7至11个残基，在序列F或W-G-X-G处结束，其中X是任意氨基酸。
本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、灵长类抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫连接Fv(sdFv)、含有VK或VH结构域的片段、Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗-Id型抗体)。本领域已知并描述了scFv分子，例如美国专利第5,892,019号。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类。
本发明公开的抗原结合多肽可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一实施方式中，可变区可来源于软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。
如本发明所使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽含有以下结构域中的至少一种：CH1结构域、铰链(例如上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，本发明使用的抗原结合多肽可包含含有CH1结构域的多肽链，含有CH1结构域、至少部分铰链结构域和CH2结构域的多肽链，含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链，含有CH1结构域、至少部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链或含有CH1结构域、至少部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。另外，本发明使用的抗原结合多肽可缺少至少部分CH2结构域(例如，全部或部分CH2结构域)。如上述提出的，本领域的普通技术人员将明白，重链恒定区可被修饰，从而其氨基酸序列与天然产生的免疫球蛋白分子不同。
本发明公开的抗原结合多肽的重链恒定区可来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可包含部分来自IgG1分子、部分来自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链部分可包含部分来自IgG1分子和部分来自IgG4分子的嵌合铰链。
如本发明所使用的术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
如前所述，众所周知各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维结构。如本发明所使用的术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链氨基末端的可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最靠近氨基末端的)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并为免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端。
如本发明所使用的术语“CH2结构域”包括部分重链分子，使用常规的编号方案，所述部分重链分子例如，大约从抗体的残基244延伸至残基360(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231至340，EU编号系统；参见Kabat等，美国健康与人类服务部，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))。CH2结构域的独特之处在于不与另一结构域紧密配对。相反，两个N-连接的分支糖链被插在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。文献还详细记录CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，包含大约108个残基。
如本发明所使用的术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。铰链区包含大约25个残基且是柔韧的，因此使两个N-末端的抗原结合区得以独立移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上铰链结构域、中铰链结构域和下铰链结构域(Roux等，J.Immunol 161：4083(1998))。
如本发明所使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含一个巯基，所述巯基可与另一个巯基形成二硫键或桥。在大多数天然产生的IgG分子中，CH1和CK区由二硫键连接，两条重链在对应于使用Kabat编号系统的239和242位(EU编号系统226或229位)由两个二硫键连接。
如本发明所使用的术语“嵌合抗体”是指任何抗体，其中，免疫反应区或免疫反应位点从第一种类获得或衍生出，且恒定区(可为根据本发明的完整的、部分的或修饰的)从第二种类获得。在优选的实施方式中，目标结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区是人类的。
如本发明所使用的“人源化百分比”计算方式是如下的计算方式：确定人源化结构域与胚系结构域之间的骨架氨基酸的差值(即，非CDR之差)，从氨基酸总数中减去所述差值，然后用氨基酸总数除以上述结果再乘以100。
“特异性结合”通常指抗原结合多肽通过其抗原结合结构域结合于表位，该结合需要抗原结合结构域与表位之间的若干互补性。相比结合于随机的、不相关的表位，当抗原结合多肽更容易地通过抗原结合结构域结合表位时，根据所述定义，可以说抗原结合多肽“特异性结合”于表位。本发明使用术语“特异性”来限定某种抗原结合多肽结合于某种表位的相对亲和力。例如，对于给定的表位，可认为抗体“A”比抗体“B”具有更高的特异性，或可认为相对于相关表位“D”，抗体“A”以更高特异性结合于表位“C”。
“优先结合”意义是相对于相关的、相似的、同源的或同功的表位，抗原结合多肽更容易地特异性结合于一个表位。因此，相对于相关的表位，“优先结合”于给定表位的抗原结合多肽更可能结合于给定表位，即使该抗体可与相关表位发生交叉反应。
作为非限制性的实施例，如果抗原结合多肽结合第一个表位的解离常数(KD)低于第二个表位的抗原结合多肽的KD，可认为抗原结合多肽优先结合于第一个表位。在另一个非限制性的实施例中，如果抗原结合多肽结合于第一个表位的亲和力比第二个表位的抗原结合多肽的KD低至少一个数量级，可认为抗原结合多肽优先结合第一个表位。在另一个非限制性的实施例中，如果抗原结合多肽结合于第一个表位的亲和力比第二个表位的抗原结合多肽的KD低至少两个数量级，可认为抗原结合多肽优先结合第一个表位。
也可根据其与LIGHT多肽的结合亲和力来描述或规定本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物。优选的结合亲和力包括具有低于以下数值的解离常数或KD的结合亲和力：5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。
在另一非限制性的实施例中，如果抗原结合多肽结合第一个表位的解离速率(k(off))低于第二个表位的抗原结合多肽k(off)，可认为抗原结合多肽优先结合第一个表位。在另一非限制性的实施例中，如果抗原结合多肽结合第一个表位的亲和力比第二个表位的抗原结合多肽的k(off)低至少一个数量级，可认为抗原结合多肽优先结合第一个表位。在另一非限制性的实施例中，如果抗原结合多肽结合第一个表位的亲和力比第二个表位的抗原结合多肽的k(off)低至少两个数量级，可认为抗原结合多肽优先结合第一个表位。
可认为本发明公开的抗原结合多肽或变体或衍生物以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离速率(k(off))结合本发明公开的目标LIGHT多肽或其片段或变体。更为优选地，可认为本发明的抗原结合多肽以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离速率(k(off))结合本发明公开的目标LIGHT多肽或其片段或变体。
可认为本发明公开的抗原结合多肽或变体或衍生物以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的弛豫速率(k(on))结合本发明公开的目标LIGHT多肽或其片段或变体。更为优选地，可认为本发明的抗原结合多肽以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、5×106M-1sec-1或107M-1sec-1、5×107M-1sec-1的弛豫速率(k(on))结合本发明公开的目标LIGHT多肽或其片段或变体。
如果抗原结合多肽以某种程度优先结合于给定表位，所述程度为在一定程度上阻断相关抗原结合多肽结合于该表位，那么，可认为该抗原结合多肽竞争性抑制相关抗原结合多肽与给定表位的结合。可用本领域任何已知方法测定竞争性抑制，例如，竞争性ELISA试验。可认为抗原结合多肽至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％竞争性抑制相关抗体和给定表位的结合。
如本发明所使用的术语“亲和力(affinity)”指单个表位与免疫球蛋白分子的CDR结合的强度测量。参见，例如，Harlow等Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)第27-28页。如本发明所使用的术语“亲合性(avidity)”指群体抗原结合多肽与一个抗原之间的复合物总体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如，Harlow 29-34页。亲合性与群体中个体抗原结合多肽与特定表位的亲和力有关，还与抗原结合多肽和抗原的化合价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(例如多聚体)的抗原之间的相互作用，将是一种高亲合性。
如本发明所使用的术语“工程抗体”指重链和轻链中的任一个或两者的可变结构域通过从已知特异性的抗体中至少部分取代一个或一个以上CDR来改变的抗体，并且，如果必要的话，取代部分骨架区并改变序列。尽管CDR可来自与作为骨架区来源的抗体同类甚至同亚类的抗体，但理想的是，CDR将来自不同类的抗体，并优选地来自不同物种的抗体。来自已知特异性的非人类抗体中的一个或一个以上“供体”CDR嫁接于人重链或轻链骨架区的工程抗体称为“人源化抗体”。可不必用供体可变区的完整CDR取代所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域。相反，只需转移维持目标结合位点活性所需的残基。已知在例如美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号中提出的解释，本领域技术人员将能够通过常规实验或反复试验获得功能性工程抗体或人源化抗体。
如本发明所使用的术语“正确折叠的多肽”包括其中所有构成多肽的功能性结构域均具有突出活性的多肽(例如，抗原结合多肽)。如本发明所使用的术语“非正确折叠的多肽”包括其中至少一个功能性结构域无活性的多肽。在一种实施方式中，正确折叠的多肽包含由至少一个二硫键连接的多肽链。
如本发明所使用的术语“工程的”包括通过合成方法处理核酸或多肽分子(例如，通过重组技术、体外肽合成、酶促或化学偶联肽或这些技术的组合)。
如本发明所使用的术语“连接的”、“结合的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语指以任何方式把两个以上元件或组分连接起来，所述任何方式包括化学结合和重组方法。“框内融合”指以保持原ORF的正确翻译阅读框的方式，把两个或两个以上多核苷酸开放阅读框(ORF)连接起来以形成一个连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是单一蛋白，所述单一蛋白包含两个或两个以上对应于原ORF编码的多肽的片段(在自然界中所述片段通常并不如此结合)。虽然因此阅读框在整个融合片段中是连续的，但所述片段可由例如框内连接序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可框内融合，但由编码至少一个免疫球蛋白骨架区或额外CDR区的多核苷酸分离，只要“融合”CDR作为连续多肽的部分被共同翻译。
如本发明所使用的术语“表达”指基因产生生化物质(例如，RNA或多肽)的过程。所述过程包括基因在细胞内功能性体现的任何表现形式，包括但不限于基因抑制(gene knockdown)以及瞬时表达和稳定表达。这包括但不限于：基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，及这种mRNA翻译成多肽。如果最终期望的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。
如本发明所使用的“治疗”指治疗性处理和预防疾病的措施或预防性措施，其目标是预防或延缓(减少)不期望的生理改变或生理失调，例如多发性硬化症的发展。有利的或理想的临床结果包括但不限于：病症的缓和、疾病程度的降低、病情稳定(即无恶化)、疾病进展的延迟或减缓、病情的改善或减轻和缓解(部分或全部的)，无论可检测或不可检测的。“治疗”还可指相比未接受治疗的预期存活时间延长存活时间。需要治疗的那些受治者包括已有病症或失调的受治者和倾向于患上病症或失调的受治者或待预防病症或失调的受治者。
“受治者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指任何受治者，尤其是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受治者。哺乳动物受治者包括人、家畜、农场动物及诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等的动物园动物、运动动物或宠物动物。
如本发明使用的诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受治者”之类的短语包括从用于例如检测、诊断过程和/或治疗的本发明的抗原结合多肽或组合物的给药中受益的受治者(例如哺乳动物受治者)。
LIGHT抗体
本发明公开的是特异性结合于TNF样细胞因子多肽的抗原结合多肽，所述TNF样细胞因子多肽称作LIGHT(参见GenBank登录号AF036581，通过引用全部并入本文)。本发明的一些抗原结合多肽包括人源化重链多肽、人源化轻链多肽、人源化重链可变区、人源化轻链可变区和包含本发明描述的LIGHT抗体的互补决定区的人源化重链和轻链多肽。在一些实施方式中，抗原结合多肽作为LIGHT活力和/或LIHGT与LIGHT受体相互作用的拮抗剂而起作用。
例如，本发明的一些抗原结合多肽包括人类抗体轻链和重链可变区的骨架(FR)区，同时充分保留亲本单克隆抗体的抗原结合特异性。人源化重链可变区和/或人源化轻链可变区至少大约87％人源化、至少大约88％人源化、至少大约89％人源化、至少大约90％人源化、至少大约91％人源化、至少大约92％人源化、至少大约93％人源化、至少大约94％人源化、至少大约95％人源化、至少大约96％人源化、至少大约97％人源化、至少大约98％人源化、至少大约99％人源化或至少大约100％人源化，不包括互补决定区(CDR)。
本发明的抗原结合多肽分子包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段和抗独特型(抗-ID)抗体。本发明的抗原结合多肽还包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFV)、单链抗体、二硫连接Fv(sdFv)和包含轻链可变结构域或重链可变结构域的片段。本发明的抗原结合多肽(包括单链抗体)可只包含可变区或包含与整体或部分重链恒定区或轻链恒定区、铰链区、CH1、CH2和CH3结构域结合的可变区。
本发明的抗原结合多肽可来自任何动物来源，包括人、鼠、驴、羊、兔、山羊、猪、骆驼、马或鸡。例如，本发明的抗原结合多肽可来自单克隆抗体供体(例如小鼠单克隆抗体供体)并可包括来自单克隆抗体的CDR(例如小鼠单克隆CDR)。
在一些实施方式中，本发明涉及抗原结合多肽或其变体或衍生物。具体地，本发明包括特异性结合于LIHGT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含下面表2中的氨基酸序列、所述抗原结合多肽基本由表2中的氨基酸序列组成，或所述抗原结合多肽由表2中的氨基酸序列组成：
表2人源化抗-LIGHT抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
Figure BPA00001463509700281
Figure BPA00001463509700301
Figure BPA00001463509700311
Figure BPA00001463509700321
每个人源化重链可变区的CDR区用粗体和下划线表示。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽涉及人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列，所述人源化抗体重链可变区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述人源化抗体重链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8。具体地，本发明的一些抗原结合多肽包含重链可变区，本发明的一些抗原结合多肽基本由重链可变区组成或本发明的一些抗原结合多肽由重链可变区组成，所述重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述重链可变区基本由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成或所述重链可变区由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
在一种实施方式中，本发明的抗原结合多肽涉及完全人源化的LIGHT抗体，所述抗体包含本发明描述的重链可变区和完整重链(即恒定区)。
在另一实施方式中，本发明提供特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化重链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化重链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区，所述人源化重链可变区基本由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区组成或所述人源化重链可变区由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区组成。在一些实施方式中，CDR区包含选自下面表3中的序列，CDR区基本由选自表3中的序列组成或CDR区由选自表3中的序列组成。
表3人源化抗-LIGHT抗体的重链CDR的氨基酸序列
Figure BPA00001463509700351
在另一实施方式中，本发明提供特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化重链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化重链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区。在一些实施方式中，CDR-H1区包含下列氨基酸序列，CDR-H1区基本由下列氨基酸序列组成或CDR-H1区由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32、和SEQ ID NO：35。在一些实施方式中，CDR-H2区包含下列氨基酸序列，CDR-H2区基本由下列氨基酸序列组成或CDR-H2区由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36。在一些实施方式中，CDR-H3区包含下列氨基酸序列，CDR-H3区基本由下列氨基酸序列组成或CDR-H3区由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、和SEQ ID NO：37。
在特定的实施方式中，本发明包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含含有CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区的人源化重链可变区，所述抗原结合多肽基本由含有CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区的人源化重链可变区组成或所述抗原结合多肽由含有CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区的人源化重链可变区组成，所述CDR-H1区包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述CDR-H1区基本由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成或所述CDR-H1区由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成，所述CDR-H2区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，所述CDR-H2区基本由SEQ IDNO：24的氨基酸序列组成或所述CDR-H2区由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成，所述CDR-H3区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述CDR-H3区基本由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成或所述CDR-H3区由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成。
特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽可包含人源化重链可变区，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽可基本由人源化重链可变区构成，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽可由人源化重链可变区构成，所述人源化重链可变区包含任何组合中的本发明公开的任何CDR重链区。
本发明还包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区包含下面表4中描述的氨基酸序列，所述人源化轻链可变区基本由表4中描述的氨基酸序列组成或所述人源化轻链可变区由表4中描述的氨基酸序列组成。
表4人源化抗-LIGHT抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
Figure BPA00001463509700361
Figure BPA00001463509700371
Figure BPA00001463509700381
Figure BPA00001463509700391
Figure BPA00001463509700401
Figure BPA00001463509700411
Figure BPA00001463509700421
每个人源化轻链可变区的CDR区用粗体和下划线表示。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽涉及人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列，所述人源化抗体轻链可变区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述人源化抗体轻链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。具体地，本发明的一些抗原结合多肽包含轻链可变区，本发明的一些抗原结合多肽基本由轻链可变区组成或本发明的一些抗原结合多肽由轻链可变区组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述轻链可变区基本由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成或所述轻链可变区由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。
在一种实施方式中，本发明的抗原结合多肽涉及完全人源化LIGHT抗体，所述完全人源化LIGHT抗体包含本发明所描述的轻链可变区和完整轻链(即恒定区)。
在另一实施方式中，本发明提供特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区包含下面表5中描述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区。
表5人源化抗-LIGHT抗体的轻链CDR的氨基酸序列
Figure BPA00001463509700431
Figure BPA00001463509700441
Figure BPA00001463509700451
在另一实施方式中，本发明提供特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成。在一些实施方式中，CDR-L1区包含选自以下的氨基酸序列，CDR-L1区基本由选自以下的氨基酸序列组成或CDR-L1区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：55。在一些实施方式中，CDR-L2区包含选自以下的氨基酸序列，CDR-L2区基本由选自以下的氨基酸序列组成或CDR-L2区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：50和SEQ ID NO：53。在一些实施方式中，CDR-L3区包含选自以下的氨基酸序列，CDR-L3区基本由选自以下的氨基酸序列组成或CDR-L3区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQID NO：51和SEQ ID NO：54。
在特定的实施方式中，本发明包括特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含含有CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区的人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由含有CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由含有CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成，所述CDR-L1区包含SEQID NO：43的氨基酸序列，所述CDR-L1区基本由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成或所述CDR-L1区由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成，所述CDR-L2区包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列，所述CDR-L2区基本由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成或所述CDR-L2区由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成，所述CDR-L3区包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，所述CDR-L3区基本由SEQID NO：45的氨基酸序列组成或所述CDR-L3区由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成。
特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽可包含含有本发明公开的任何CDR-轻链区的人源化轻链可变区，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽可基本由含有本发明公开的任何CDR-轻链区的人源化轻链可变区组成或特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽由含有本发明公开的任何CDR-轻链区的人源化轻链可变区组成。
在本发明的其他实施方式中，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽包含选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽基本由选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成或特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽由选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成：
i.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9；
ii.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10；
iii.SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11；
iv.SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12；
v.SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13；
vi.SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：14；
vii.SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：15；
viii.SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：16；
ix.SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：17；以及
x.其组合。
在本发明的其他实施方式中，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽包含人源化重链可变区和人源化轻链可变区，特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽基本由人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成或特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽由人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成，所述人源化重链可变区和人源化轻链可变区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述人源化重链可变区和人源化轻链可变区基本由选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成或所述人源化重链可变区和人源化轻链可变区由选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成：
i.SEQ ID NO：18、19、20和SEQ ID NO：38、41、42；
ii.SEQ ID NO：18、19、21和SEQ ID NO：39、41、42；
iii.SEQ ID NO：18、19、22和SEQ ID NO：40、41、42；
iv.SEQ ID NO：23、24、25和SEQ ID NO：43、44、45；
v.SEQ ID NO：26、27、28和SEQ ID NO：46、47、48；
vi.SEQ ID NO：29、30、31和SEQ ID NO：49、50、51；
vii.SEQ ID NO：32、33、34和SEQ ID NO：52、53、54；
viii.SEQ ID NO：35、36、37和SEQ ID NO：55、50、51；以及
ix.其组合。
以上描述的任何多肽可进一步包括另外的多肽，例如，指导编码的多肽分泌的信号肽、如本发明所描述的抗体恒定区或如本发明所描述的其他异源多肽。
本领域的普通技术人员还将理解本发明公开的抗原结合多肽可被修饰，以使得它们的氨基酸序列与作为其来源的天然产生的结合多肽不同。例如，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可相似(例如，与起始序列具有一定百分比的一致性，所述一致性例如可与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同)。
此外，可使核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入，导致在“非必需”氨基酸区的保守取代或改变。例如，除了一个或一个以上单个氨基酸的取代、插入或缺失(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多单个氨基酸的取代、插入或缺失)之外，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相同。在一些实施方式中，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列具有相对于起始序列的一至五个、一至十个、一至十五个或一至二十个单个氨基酸的取代、插入或缺失。
本发明的一些抗原结合多肽包含来自人类氨基酸序列的氨基酸序列，本发明的一些抗原结合多肽基本由来自人类氨基酸序列的氨基酸序列组成或本发明的一些抗原结合多肽由来自人类氨基酸序列的氨基酸序列组成。然而，一些抗原结合多肽可包含来自其他哺乳动物物种的连续氨基酸序列的一个或一个以上。例如，本发明的抗原结合多肽可包括灵长类的重链部分、铰链部分或抗原结合区。在一些治疗应用中，设计抗原结合多肽或其抗原结合片段、变体或类似物，以在用抗体给药的动物中不产生免疫性。
在一些实施方式中，抗原结合多肽包含氨基酸序列或一个或一个以上通常不与抗体结合的部分。典型的修饰在下文更详细地描述。例如，本发明的单链Fv抗体片段可包含柔韧的连接物的序列，或可被修饰以添加功能性的部分(例如，PEG、药物、毒素或标签)。
本发明的抗原结合多肽包含融合蛋白，本发明的抗原结合多肽基本由融合蛋白组成或本发明的抗原结合多肽由融合蛋白组成。融合蛋白是嵌合分子，包含例如，具有至少一个目标结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域，和至少一个异源部分(即通常自然界中不与其自然连接的部分)。氨基酸序列通常可以单个蛋白的形式存在，在融合多肽中连结在一起，或者它们通常可存在于同一个蛋白中，但在融合多肽中以新的排列方式排列。融合蛋白可通过例如化学合成或通过创造并翻译多核苷酸来产生，所述多核苷酸中的肽区以期望的关系被编码。
术语“异源的”应用于多核苷酸或多肽时，其意思是所述多核苷酸或多肽来自与用作对比的剩余实体不同的实体。例如，如本发明所使用的“异源多肽”来自同种的非免疫球蛋白多肽或不同种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽，所述“异源多肽”融合于本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物。
可进一步将本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物在N-末端或C-末端融合于异源多肽，或化学结合(包括共价和非共价结合)于多肽或其他组合物。例如，特异性结合于LIGHT多肽的人源化LIGHT抗原结合多肽可融合或结合于在检测试验中用作标签的分子以及诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素之类的效应分子。参见，例如，PCT国际公开WO 92/08495、WO91/14438、WO 89/12624、美国专利第5,314,995号和EP 396,387，上述专利文献通过引用全部并入本文。
本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物包括修饰的衍生物，即，通过将任何类型的分子共价结合于抗体，以使共价结合不阻止抗原结合多肽结合于LIGHT多肽。例如，但不限于，抗原结合多肽包括已被修饰的抗体，所述修饰例如，被已知的保护基团糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、衍生化，蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白等。众多化学修饰中的任何一个都可通过现有技术实现，包括但不限于：特定的化学分裂、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。另外，抗原结合多肽可包含一个或一个以上非传统的氨基酸。
本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物可由互相以肽键或修饰的肽键(即肽的电子等排体)连接的氨基酸组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。本发明的抗原结合多肽可由天然过程修饰(例如翻译后加工)或由本领域熟知的化学修饰技术来修饰。所述修饰在一般性文章中有描述，并在专著和大量研究资料中有更详细的描述。修饰可在多肽的任何位置发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端或在诸如糖类之类的部分上发生。可被理解的是相同类型的修饰可以相同或不同的程度出现在本发明已知的抗原结合多肽的几个位点。另外，给定的抗原结合多肽可包含许多类型的修饰。抗原结合多肽可为分支的(例如，作为泛素化的结果)，也可为具有分支或不具有分支的环。环状的、分支的和分支环状抗原结合多肽可由翻译后天然加工得到或可由合成方法制得。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA介导向蛋白质中添加氨基酸如精氨酰化(arginylation)和泛素化。(参见，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York二次出版，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson(编辑)，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter等，Meth Enzymol182：626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明还提供包含抗原结合多肽、其变体或衍生物和异源多肽的融合蛋白。抗体与其融合的异源多肽可在功能上是有用的或在治疗过程中用于靶向人体的特定区域。在一种实施方式中，本发明的融合蛋白包含多肽，本发明的融合蛋白基本由多肽组成或本发明的融合蛋白由多肽组成，所述多肽含有本发明抗原结合多肽的重链可变区中的任何一个或一个以上的氨基酸序列或本发明抗原结合多肽的轻链可变区中的一个或一个以上的氨基酸序列或其变体以及异源多肽序列。在另一实施方式中，本发明公开的融合蛋白包含多肽，本发明公开的融合蛋白基本由多肽组成或本发明公开的融合蛋白由多肽组成，所述多肽含有本发明所描述的抗原结合多肽、其变体或衍生物的任何一个、两个、三个重链可变CDR的氨基酸序列或本发明所描述的抗原结合多肽、其变体或衍生物的任何一个、两个、三个轻链可变CDR的氨基酸序列，以及异源多肽序列。
在一种实施方式中，融合蛋白包含多肽，所述多肽含有本发明抗原结合多肽或其衍生物或变体的重链可变CDR的氨基酸序列和异源多肽序列，所述融合蛋白特异性结合于LIGHT多肽。在另一实施方式中，融合蛋白包含多肽，所述多肽含有至少一个本发明抗原结合多肽的重链可变区的氨基酸序列和至少一个本发明抗原结合多肽或其衍生物或变体的轻链可变区的氨基酸序列，以及异源多肽序列。优选地，融合蛋白的重链可变区和轻链可变区对应单一来源的特异性结合LIGHT的抗体(或scFv或Fab片段)。在又一实施方式中，本发明公开的融合蛋白包含多肽，所述多肽含有抗原结合多肽的任何一个、两个、三个或更多重链可变CDR的氨基酸序列和抗原结合多肽或其变体或衍生物的任何一个、两个、三个或更多轻链可变CDR的氨基酸序列，以及异源多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多重链可变CDR或轻链可变CDR对应本发明的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。本发明还包含编码这种融合蛋白的核酸分子。
文献报道的典型融合蛋白包括T-细胞受体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 54：2936-2940(1987))；CD4(Capon等，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等，DNA CellBiol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等，Nature 344：667-670(1990))；L-选择素(归巢受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等，Cell(57：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等，J.Exp.Med.773：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 55：10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.774：1483-1489(1991))；和IgE受体α(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))的融合。
可用本领域熟知的方法制备融合蛋白(参见例如，美国专利第5,116,964号和第5,225,538号)。可凭经验选择进行融合的准确位点以优化融合蛋白的分泌特性或结合特性。随后转染编码融合蛋白的DNA至宿主细胞中表达。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽是单链Fv分子(scFv)。具体地，本发明的一些scFv分子包含具有选自NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH的化学式的多肽，本发明的一些scFv分子基本由具有选自NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH的化学式的多肽组成或本发明的一些scFv分子由具有选自NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH的化学式的多肽组成，其中L是前导序列，VH是人源化抗体重链可变区，X是连接多肽，VK是人源化抗体轻链可变区。
在其他实施方式中，本发明的抗原结合多肽是融合于人血清白蛋白(HSA)以产生特异性结合于LIGHT多肽的scFV HSA融合分子的单链Fv分子(scFv)。在特定的实施方式中，在scFv HSA融合分子中scFV融合或连接于HSA的N-末端。在其他实施方式中，在scFv HSA融合分子中scFV融合或连接于HSA的C-末端。在其他的实施方式中，scFv HSA融合分子的化学式选自：NH2-L-VH-X-VK-HSA-COOH，NH2-L-VK-X-VH-HSA-COOH，NH2-HSA-VH-X-VK-COOH和NH2-HSA-VK-X-VH-COOH，其中L是前导序列，VH是人源化抗体重链可变区，X是连接多肽，HSA是人血清白蛋白，VK是人源化抗体轻链可变区。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽是Fab片段。在其他的实施方式中，本发明的抗原结合多肽是融合或连接于人血清白蛋白(HSA)以产生特异性结合于LIGHT多肽的Fab HSA融合分子的Fab片段。在特定的实施方式中，在Fab HSA融合分子中，Fab片段的重链部分融合或连接于HSA的N-末端或C-末端。在其他实施方式中，在Fab HSA融合分子中，Fab片段的轻链部分融合或连接于HSA的N-末端或C-末端。在其他实施方式中，Fab HSA融合分子的化学式选自：NH2-VH-CH1-HSA-COOH，NH2-HSA-VH-CH1-COOH，NH2-VK-CK-HSA-COOH和NH2-HSA-VK-CK-COOH，其中VH是人源化抗体重链可变区，HSA是人血清白蛋白，VK是人源化抗体轻链可变区，CH1是重链恒定结构域1，CK是轻链恒定结构域。Fab片段或Fab HSA融合分子的重链或轻链部分与其同源对应物(例如本发明所述的抗原结合多肽的人源化重链可变区或人源化轻链可变区)一起折叠以产生完整的Fab-HSA或HSA-Fab融合分子。
在其他实施方式中，本发明的抗原结合多肽可包含保守的氨基酸取代。
“保守的氨基酸取代”中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义了含有相似侧链的氨基酸残基家族，包括基本侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必须氨基酸残基最好由同一侧链家族的另一氨基酸残基取代。在另一实施方式中，一串氨基酸可由结构上相似的串取代，所述结构上相似的串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
与治疗剂或诊断剂的联合
特别地，本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物可与治疗剂、前药、多肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药学制剂或PEG结合。
本发明公开的抗原结合多肽可结合或融合于治疗剂，所述治疗剂可包括放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂(可为药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记物、其组合以及其他本领域已知的这种药剂。
药物可包括具有选自以下的药物特性的药物：抗有丝分裂、抗激酶、烷化、抗代谢、抗生素、生物碱、抗血管生成、细胞凋亡剂及其组合。更具体地，这些药物选自：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位化合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、蒽环类、紫杉烷及其类似物以及其组合。本发明包含的毒素可选自：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂角苷、核糖核酸酶(RNase)(例如豹蛙酶(onconase))、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
免疫调节剂可选自：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、促血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素(例如肿瘤坏死因子(TNF))、成血因子(例如白细胞介素(IL))、集落刺激因子(例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、-β或-γ)和干细胞生长因子(例如指定的“S1因子”)。更特别地，免疫调节剂可包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α或其组合。
在一些实施方式中，本发明公开的抗原结合多肽可进一步包含靶向部分。靶向部分包括指导定位于人体中某一部位(例如，炎症的特定区域)的蛋白或多肽。
如本发明其他部分所讨论的，本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物可融合于异源多肽以增加多肽的体内半衰期或使用本领域已知的方法用于免疫检测。例如，在一种实施方式中，可将聚乙二醇(PEG)结合于本发明的LIGHT抗体以增加其体内半衰期。Leong，S.R.等，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)
此外，本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物可融合于标记序列，例如方便其纯化或检测的多肽。在优选的实施方式中，标记氨基酸序列是六-组氨酸多肽(例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN公司，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其他很多是商售的。例如，如Gentz等Proc.Natl.Acad.Sci USA 55：821-824(1989)中描述的六-组氨酸为融合蛋白的纯化提供方便。用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于来自流感血凝素蛋白的“HA”标签(Wilson等，Cell 37：161(1984))和“旗帜(flag)”标签(Brizzard等，Biotechniques 16(4)：730-735(1994))。
本领域技术人员将理解的是，还可使用一系列技术将结合物组合起来，所述技术依赖于所选择的待结合的药剂。例如，与生物素的结合通过例如，使结合多肽与活化的生物素酯(例如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应来制备。类似地，具有荧光标记的结合物可在有偶联剂(例如本发明所列举的)的情况下制备，或通过与异硫氰酸酯(优选荧光素-异硫氰酸酯)反应来制备。本发明的抗原结合多肽、其片段、变体或衍生物的结合物以类似方式来制备。
本发明进一步包括结合于诊断剂或治疗剂的本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物。所述结合的多肽可在诊断上用于，例如，监测疾病的发展或进程，所述监测是临床试验程序的部分，所述临床试验程序用于例如，确定已知的治疗方案和/或预防方案的效力。将抗原结合的多肽片段、其变体或衍生物偶联于可检测的物质可有利于检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射X线断层摄影术的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。参见例如，美国专利第4,741,900号的金属离子，所述金属离子可结合于根据本发明的用作诊断剂的抗体。适当的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；适当的放射性物质的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
抗原结合多肽、其变体或衍生物通过将其偶联于化学发光化合物可以被可检测地标记。随后通过检测化学反应过程中产生的发光度来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记的化合物的例子为鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
抗原结合多肽、其变体或衍生物还可使用发射荧光的金属(例如152Eu或其他镧系元素)可检测地标记。这些金属可通过诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之类的金属螯合基团与抗体结合。将各个部分结合于抗体的技术已众所周知，参见例如，Arnon等在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中发表的″Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，Reisfeld等(编辑)，在第243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)页发表的文章；Hellstrom等在Controlled Drug Delivery(二次出版)中发表的″Antibodies For Drug Delivery″，Robinson等(编辑)在Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)发表的文章；Thorpe在Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications在发表的″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，Pinchera等(编辑)在第475-506页(1985)发表的文章；在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中发表的″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，Baldwin等(编辑)，在Academic Press第303-16页(1985)发表的文章，以及Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。
本发明公开的抗原结合多肽还可结合或融合于其他诊断剂，包括但不限于，光敏诊断剂或具有60keV至4000keV能量的放射性标记物或非放射性标记物。放射性标记物优选γ-、β-或正电子发射同位素并且选自：125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O、76Br及其组合。诊断剂还可包括造影剂，例如锰、铁或钆。
编码抗原结合多肽的多核苷酸
本发明还提供分离的编码本发明抗原结合多肽、其变体或衍生物的多核苷酸或核酸分子。
在一种实施方式中，本发明的多核苷酸编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，并且，本发明的多核苷酸包含人源化重链可变区，本发明的多核苷酸基本由人源化重链可变区组成或本发明的多核苷酸由人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含选自以下的氨基酸序列，所述人源化重链可变区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述人源化重链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。具体地，本发明的一些多核苷酸编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，并且本发明的一些多核苷酸包含人源化重链可变区，本发明的一些多核苷酸基本由人源化重链可变区组成或本发明的一些多核苷酸由人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述人源化重链可变区基本由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成或所述人源化重链可变区由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
在另一实施方式中，本发明的多核苷酸编码完全人源化的LIGHT抗体，所述抗体包含本发明描述的重链可变区和完整的重链(即恒定区)。
在另一实施方式中，本发明提供编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，所述抗原结合多肽包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区的人源化重链可变区，所述抗原结合多肽基本由含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区的人源化重链可变区组成或所述抗原结合多肽由含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区的人源化重链可变区组成。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码CDR-H1区，所述CDR-H1区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-H1区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-H1区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码CDR-H2区，所述CDR-H2区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-H2区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-H2区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码CDR-H3区，所述CDR-H3区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-H3区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-H3区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：37。
在特定的实施方式中，本发明包括编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，所述抗原结合多肽包含人源化重链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化重链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化重链可变区组成，所述人源化重链可变区包含CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区，所述人源化重链可变区基本由CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区组成或所述人源化重链可变区由CDR-H1区、CDR-H2区和CDR-H3区组成，所述CDR-H1区包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述CDR-H1区基本由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成或所述CDR-H1区由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成，所述CDR-H2区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，所述CDR-H2区基本由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成或所述CDR-H2区由SEQ IDNO：24的氨基酸序列组成，所述CDR-H3区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述CDR-H3区基本由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成或所述CDR-H3区由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成。
本发明还包括编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，并且本发明包含人源化轻链可变区，本发明基本由人源化轻链可变区组成或本发明由人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列，所述人源化轻链可变区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述人源化轻链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。具体地，本发明的一些多核苷酸编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，并且本发明的一些多核苷酸包含人源化轻链可变区，本发明的一些多核苷酸基本由人源化轻链可变区组成或本发明的一些多核苷酸由人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述人源化轻链可变区基本由SEQ IDNO：12的氨基酸序列组成或所述人源化轻链可变区由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。
在另一实施方式中，本发明的多核苷酸编码完全人源化的LIGHT抗体，所述抗体包含本发明描述的轻链可变区和完整的轻链(即恒定区)。
在另一实施方式中，本发明提供编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，所述抗原结合多肽包含含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的人源化轻链可变区组成。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码CDR-L1区，所述CDR-L1区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-L1区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-L1区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：55。在一些实施方式中，所述CDR-L2区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-L2区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-L2区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：53。在一些实施方式中，所述CDR-L3区包含选自以下的氨基酸序列，所述CDR-L3区基本由选自以下的氨基酸序列组成或所述CDR-L3区由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：54。
在特定的实施方式中，本发明包括编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，所述抗原结合多肽包含人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由人源化轻链可变区组成，所述人源化轻链可变区包含CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区，所述CDR-L1区包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，所述CDR-L1区基本由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成或所述CDR-L1区由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成，所述CDR-L2区包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列，所述CDR-L2区基本由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成或所述CDR-L2区由SEQID NO：44的氨基酸序列组成，所述CDR-L3区包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，所述CDR-L3区基本由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成或所述CDR-L3区由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成。
在本发明的其他实施方式中，本发明的多核苷酸编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成或所述抗原结合多肽由选自以下的人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成：
i.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9；
ii.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10；
iii.SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11；
iv.SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12；
v.SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13；
vi.SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：14；
vii.SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：15；
viii.SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：16
ix.SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：17；以及
x.其组合。
本发明的其他实施方式包括编码特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽的多核苷酸，所述抗原结合多肽包含人源化重链可变区和人源化轻链可变区，所述抗原结合多肽基本由人源化重链可变区和人源化轻链可变区或所述抗原结合多肽由人源化重链可变区和人源化轻链可变区组成，所述人源化重链可变区和人源化轻链可变区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述抗原结合多肽基本由选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成或所述抗原结合多肽由选自以下的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成：
x.SEQ ID NOs：18，19，20和SEQ ID NOs：38，41，42；
xi.SEQ ID NOs：18，19，21和SEQ ID NOs：39，41，42；
xii.SEQ ID NOs：18，19，22和SEQ ID NOs：40，41，42；
xiii.SEQ ID NOs：23，24，25和SEQ ID NOs：43，44，45；
xiv.SEQ ID NOs：26，27，28和SEQ ID NOs：46，47，48；
xv.SEQ ID NOs：29，30，31和SEQ ID NOs：49，50，51；
xvi.SEQ ID NOs：32，33，34和SEQ ID NOs：52，53，54；
xvii.SEQ ID NOs：35，36，37和SEQ ID NOs：55，50，51；以及
xviii.其组合。
本发明的多核苷酸可在同一多核苷酸分子上或分离的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的整个重链可变区和轻链可变区。另外，本发明的多核苷酸可在同一多核苷酸分子上或分离的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的部分重链可变区和轻链可变区。
制备抗原结合多肽的方法
制备抗体或抗原结合多肽的方法为本领域所熟知且在本发明进行描述。在一些实施方式中，本发明抗原结合多肽的可变区和恒定区都是完全人类的。完全人类的抗体可使用本领域和本发明所描述的技术来制备。例如，抗特定抗原的完全人类的抗体可通过将抗原给药于转基因动物来制备，改良所述转基因动物以产生应答抗原激发的这种抗体，但其内源性位点已经失效。可用于制备这种抗体的典型技术在美国专利第6,150,584号、第6,458,592号、第6,420,140号中有描述，上述专利文献通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物将不会在待治疗的动物(例如，人)体内产生有害的免疫反应。在一种实施方式中，应用本领域公知的技术修饰本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物，从而降低其免疫反应。例如，抗体可为人源化的、灵长类源化的、去免疫化的，或可制备嵌合抗体。这些类型的抗体来自非人类抗体(典型的是鼠或灵长类抗体)，所述非人类抗体保留或基本保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人体内产生较低的免疫反应。上述抗体可使用多种方法获得，包括(a)将完整的非人类可变结构域嫁接于人恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或一个以上非人类互补决定区(CDR)的至少一个部分嫁接于保留或未保留关键性骨架残基的人类骨架和恒定区中；或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过取代表面残基用类似人类的部分“隐藏”它们。这些方法在Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57：6851-6855(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，和美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,190,370号中公开，上述所有文献通过引用全部并入本文。
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。如本发明所使用的术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T-细胞表位(参见例如，国际申请公开WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变序列和轻链可变序列，并创建来自每个V区的人类T-细胞表位“地图”，所述“地图”显示与互补决定区(CDR)以及序列中其他关键残基相关的表位的位置。分析来自T-细胞表位地图的单个T-细胞表位，以使得以较低的改变最终抗体活性的风险来确定可选的氨基酸取代。设计一系列可选的包含氨基酸取代的组合的重链可变序列和轻链可变序列，随后将这些序列整合到一系列的结合多肽中。典型地，产生12至24种可变抗体并测试其结合和/或功能。随后将包含修饰的可变区和人恒定区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体和后来的质粒中，所述质粒被导入细胞系用于产生完整抗体。随后以适当的生化和生物试验比较抗体，确定最优变体。
单克隆抗体可用本领域已知的许多技术制备，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可通过杂交瘤技术产生，所述杂交瘤技术包括本领域已知的技术，例如在Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，二次出版(1988)；Hammerling等，在Monoclonal Antibodies和T-CeIl Hybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)中发表的文章(上述参考文献通过引用并入本文)中教导的技术。如本发明所使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指的是来自单一克隆(包括任何真核的、原核的或噬菌体克隆)的抗体，而不涉及其生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可用本领域已知的许多技术制备，包括应用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术。
本发明抗原结合多肽的结合特异性可用体外检测测定，例如，免疫沉淀、放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
可选地，本发明的单链抗体可采用所描述的生产单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号、Bird，Science 242：423-442(1988)、Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)和Ward等，Nature 334：544-554(1989))生产。单链抗体通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成。也可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science 242：1038-1041(1988))。
抗体片段(例如Fab和F(ab′)2片段)可由现有技术产生，包括使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)之类的酶水解切割免疫球蛋白分子。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1区。
可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术例子包括美国专利第4,946,778号和第5,258,498号、Huston等在Methods in Enzymology 203：46-88(1991)中发表的文章、Shu等在Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)中发表的文章和Skerra等在Science 240：1038-1040(1988)发表的文章所描述的那些例子。对于一些应用(包括人体抗体的体内使用和体外检测)，优选地使用嵌合的、人源化的或人类的抗体。嵌合抗体是不同部分来自不同动物种类的分子，如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和来自人类免疫球蛋白的恒定区的抗体。本领域已知生产嵌合抗体的方法。参见例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715号、第4,816,567号和第4,816397号，上述文献通过引用全部并入本文。
人源化抗体是来自非人类物种的结合预期抗原的抗体分子，所述抗体具有一个或一个以上来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的骨架区。通常，用CDR供体抗体的相应残基取代人类骨架区的骨架残基，以改变(优选提高)抗原结合。这些骨架取代用本领域熟知的方法来确定，例如，通过对CDR与骨架残基的相互作用做出建模以确定对抗原结合重要的骨架残基，并通过序列比较以确定特定位置上不寻常的骨架残基。(参见，例如，Queen等的美国专利第5,585,089号；Riechmann等，Nature332：323(1988)，上述文献通过引用全部并入本文。)可使用本领域已知的许多方法将抗体人源化，例如，CDR-嫁接(EP 239,400、PCT国际公开WO91/09967、美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)，镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106、EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和链改组(美国专利第5,565,332号，所述文献通过引用全部并入本文)。
完全人类的抗体尤其适合治疗人类患者。人类抗体可通过本领域已知的许多方法来制备，包括使用人类免疫球蛋白序列抗体文库的噬菌体展示法。参见，美国专利第4,444,887号和第4,716,111号，和PCT国际公开WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO96/33735和WO 91/10741，上述文献各自通过引用全部并入本文。
人类抗体还可使用转基因小鼠生产，所述小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可表达人类免疫球蛋白基因。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源性重组导入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人重链和轻链基因外，可将人可变区、恒定区和多样性区导入小鼠胚胎干细胞。随着通过同源性重组的人类免疫球蛋白位点的引入，小鼠轻链和重链免疫球蛋白基因可分别地或同步地失去功能。具体而言，JH区的纯合性缺失防止内源性抗体的产生。扩增修饰的胚胎干细胞并将其显微注射至胚泡中产生嵌合小鼠。随后繁殖嵌合小鼠产生表达人类抗体的纯合后代。以常规方式用选定抗原(例如，预期靶多肽的全部或一部分)免疫转基因小鼠，使用传统杂交瘤技术可从免疫接种的、转基因的小鼠获取抗抗原的单克隆抗体。转基因小鼠含有的人类免疫球蛋白转基因在B-细胞分化中重排，并随后经历类别转换和体细胞突变。因此，通过这样一种技术，可生产治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于该技术用于生产人类抗体的概述，参见Lonberg和HuszarInt.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。关于该技术生产人类抗体和人类单克隆抗体的详细讨论及生产这些抗体的实验方案，参见例如，PCT国际公开WO98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735，美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号，上述专利文献通过引用全部并入本文。另外，诸如Abgenix公司(加州，弗里蒙特)和GenPharm公司(加州，圣何塞)之类的公司可使用类似上述技术提供抗选定抗原的人类抗体。
本发明的人类或基本人类的抗原结合多肽的生成可产生于无法产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)中(参见例如，美国专利第6,075,181号、第5,939,598号、第5,591,669号和第5,589,369号，上述专利文献中的每一个通过引用全部并入本文)。例如，已描述嵌合的且胚系突变的小鼠的抗体重链连接区的纯合性缺失导致完全抑制内源抗体的产生。将人类免疫球蛋白基因芯片转移至这种胚系突变小鼠导致产生应答抗原刺激的人类抗体。使用SCID小鼠产生人类抗体的另一优选的方式在美国专利第5,811,524中公开，该美国专利通过引用并入本文。可理解的是，与这些人类抗体相关的遗传物质也可如本发明所述分离并操作。
识别选定表位的完全人类抗体还可使用一种叫做“定向选择”的技术产生。这种方法使用选定的非人类单克隆抗体(例如，小鼠抗体)指导选择识别同一表位的完全人类抗体。(Jespers等，Bio/Technology 72：899-903(1988)。亦参见，美国专利第5,565,332号，该美国专利通过引用全部并入本文。)
在另一实施方式中，编码预期单克隆抗体的DNA可直接通过常规程序分离和测序(例如，通过使用能特异性结合于编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离且亚克隆的杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。DNA一旦分离，便可置于表达载体中，随后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞中(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)。更具体而言，可用分离的DNA(如本发明所述可为合成的)克隆恒定区和可变区序列以制造在1995年1月25日提交的Newman等的美国专利第5,658,570号中描述的抗体，该美国专利通过引用并入本文。基本上，这需要从所选细胞中提取RNA，转化至cDNA并使用Ig特异引物进行PCR扩增。为此，合适的引物在美国专利第5,658,570号中也有描述。如下文将详述的，表达预期抗体的转化细胞可增长到相对大的数量以提供临床及商业用途的免疫球蛋白供应。
另外，使用普通重组DNA技术，可将本发明的抗原结合多肽的CDR中的一个或一个以上插入骨架区，例如插入人骨架区使非人类抗体人源化。骨架区可为自然产生的或共有的骨架区，且优选人类骨架区(参见例如Chothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人类骨架区列表)。优选地，骨架区与CDR组合产生的多核苷酸编码特异性结合于期望的多肽(如LIGHT)的至少一个表位的抗体。优选地，一个或一个以上氨基酸取代可在骨架区内进行，并且，优选地，该氨基酸取代提高抗体和抗原的结合。另外，这些方法可用于制造参与链内二硫键的一个或一个以上可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺少一个或一个以上链内二硫键的抗体。多核苷酸的其他改变包含在本发明和本领域技术的范围内。
另外，可使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等，Nature 372：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))，所述技术通过剪接来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人类抗体的基因来实现。如本发明所使用的嵌合抗体是不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有来自鼠单克隆抗体的可变区与来自人类免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体。
Newman在Biotechnology 10：1455-1460(1992)中公开了另一产生重组抗体的高效方法。具体而言，这种技术导致产生包含猴可变结构域和人恒定序列的灵长类源化抗体。上述文献通过引用全部并入本文。此外，此技术还在美国专利第5,658,570号、第5,693,780号和第5,756,096号中描述，所述文献各自通过引用全部并入本文。
可选地，产生抗体的细胞系可由本领域技术人员熟知的技术筛选并培养。这些技术在许多实验手册和基础出版物中有描述。在这方面，如下文描述的适合本发明所用的技术在Current Protocols in Immunology，Coligan等(编辑)，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，NewYork(1991)中有描述，上述文献(包括其补充)通过引用全部并入本文。
本发明公开的用于诊断和治疗方法的抗体可通过本领域已知的合成抗体的任何方法生产，具体而言，使用化学合成，或优选地使用本发明描述的重组表达技术来生产。
另外，可使用本领域技术人员已知的标准技术，在编码本发明的抗原结合多肽的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，引起氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。优选地，相对于所涉及的重链可变区、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、轻链可变区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。可选地，突变可沿着所有或部分编码序列随机引入(例如通过饱和突变引入)，并筛选所得的突变子用于生物活性筛选以确定保留了活性(例如，结合于LIGHT多肽上的能力)的突变子。
例如，可仅在抗体分子的骨架区或仅在抗体分子的CDR区引入突变。引入的突变可为沉默的或中性的错义突变，即，对抗体结合抗原的能力没有或只有很少影响的突变。这些类型的突变可对优化密码子的使用或提高杂交瘤的抗体产生有用。可选地，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。虽然不是绝对的要求，但大部分沉默和中性错义突变的位点可能在骨架区中，大部分非中性错义突变的位点可能在CDR中。本领域技术人员将有能力设计和测试具有期望特性的突变分子，所述特性例如抗原结合活性不改变或抗原结合活性改变(例如，抗原结合活性提高或抗体特异性改变)。突变产生后，所编码的蛋白通常可被表达，并且可使用本发明描述的技术或由本领域已知的常规修饰技术测定所述蛋白的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性地结合LIGHT多肽的至少一个表位的能力)。
在操作分离的遗传物质以提供本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物之后，将编码本发明抗原多肽的多核苷酸插入到表达载体上，并导入可用于产生预期数量的抗原结合多肽的宿主细胞内。
抗原结合多肽、其衍生物或变体(例如，结合于本发明描述的目标分子(例如LIGHT)的抗体的重链或轻链)的重组表达需要构建包含编码抗原结合多肽的多核苷酸的表达载体。一旦获取编码本发明的抗原结合多肽的多核苷酸或编码抗原结合多肽的重链或轻链或编码部分抗原结合多肽的重链或轻链(优选地包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生。因此，本文描述了通过表达包含编码抗体核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。可用本领域技术人员熟知的方法构建包含抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供可复制的载体，所述载体包含可操作地连接于启动子的编码本发明抗体分子或其重链或轻链或者重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，PCT国际公开WO 86/05807、PCT国际公开WO 89/01036号和美国专利第5,122,464号)，并可将抗体的可变结构域克隆到这样的载体中以表达完整的重链或轻链。
可用本发明的两个表达载体共转染宿主细胞，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可包含相同的可选标记，所述标记使重链和轻链多肽能平等表达。可选地，可使用编码重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况下，有利地，将轻链置于重链之前以避免有毒的游离重链过剩(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
本发明使用术语“载体”或“表达载体”指根据本发明用作将期望的基因导入宿主并在宿主中进行表达的媒介物的载体。本领域技术人员已知，易从质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒中选择这种载体。一般而言，符合本发明的载体将包含选择性标记、有利于克隆期望基因的合适的限制性酶切位点以及进入真核或原核细胞的能力和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
就本发明的目的而言，可采用多种表达载体系统。例如，一类载体使用来自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，已将DNA整合于染色体的细胞可通过引入一个或一个以上能够选择转染宿主细胞的标记来选择。所述标记可为营养缺陷型宿主提供原养型特征，并可提供杀生剂抗性(例如抗生素)或重金属(例如铜)抗性。可选的标记基因可直接连接到DNA序列上表达，或通过共转化导入同一细胞。mRNA合成的优化还可需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号和转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，将所克隆的可变区基因随同上面讨论的重链和轻链恒定区基因(优选人类的)插入表达载体中。可在本发明中使用能在真核细胞中得到表达的表达载体。合适的载体例子包括但不限于：质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF I/His、pEMD/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(来自Invitrogen，San Diego，CA)和质粒pCI(来自Promega，Madison，WI)。一般而言，大规模筛选相对高水平表达免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是常规试验能实现的(例如，使用机器人系统)。载体系统还在美国专利第5,736,137号和第5,658,570号中教导，上述美国专利分别通过引用并入本文。该系统提供高表达水平，例如，＞30pg/细胞/日。其余典型的载体系统在例如美国专利第6,413,777号中公开。
在其他优选的实施方式中，本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物可使用多顺反子构造表达，所述多顺反子构造例如在2002年11月18日提交的美国专利申请公开2003-0157641A1中所公开的多顺反子构造，上述美国专利申请公开通过引用全部并入本文。在这些新的表达系统中，目的多基因产物(例如抗体的重链和轻链)可产自单个的多顺反子构造。这些系统优选地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供真核宿主细胞内相对高水平的抗原结合多肽。适合的IRES序列在美国专利第6,193,980号中公开，上述美国专利也并入本文。本领域技术人员将理解的是，可用这些表达系统有效生产本申请所公开的全部抗原结合多肽。
更为普遍地，一旦制备了编码抗原结合多肽单体亚基的载体或DNA序列，就可将表达载体导入合适的宿主细胞。将质粒导入宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的许多技术实现。这些技术包括但不限于：转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合技术、磷酸钙沉淀、包膜DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见，Ridgway，A.A.G.″Mammalian ExpressionVectors″Vectors，Rodriguez and Denhardt(编辑)，Butterworths，Boston，Mass.，24.2章节，第470-472页(1988)。典型地，通过电穿孔将质粒导入宿主。在适合产生轻链和重链的条件下培养包含表达构造的宿主细胞，并检测重链和/或轻链蛋白的合成。典型的检测技术包括酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分类分析(FACS)、免疫组化等等。
通过传统技术将表达载体转移至宿主细胞，并通过传统技术培养转染的细胞以产生抗体来用于本发明描述的方法。因此，本发明包括包含多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接于异源启动子上，且编码本发明的抗体、或其重链或轻链。在表达双链抗体的优选实施方式中，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞内共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如下详述。
如本发明所使用的“宿主细胞”指的是包含通过重组DNA技术构建的、编码至少一个异源基因的载体的细胞。除非另有说明，描述从重组宿主中分离抗体的过程时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体的来源。也就是说，从“细胞”回收多肽可意为离心全部细胞回收多肽，或从包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收多肽。
可用多个宿主表达载体系统表达抗原结合多肽。这些宿主表达系统代表媒介物，但也代表细胞，目的编码序列可通过所述媒介物产生并随后被纯化，当以合适的核苷酸编码序列转化或转染所述细胞时，所述细胞可原位表达本发明抗原结合多肽。这些包括但不限于，诸如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)之类的微生物，用含有抗体的编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母、毕赤酵母)，用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，用含有抗体的编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV，烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统，或包含含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)的或来自哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构造的哺乳动物细胞系统(如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，使用诸如大肠杆菌之类的细菌，更优选真核细胞，来表达重组抗体分子，尤其是表达整个重组抗体分子。例如，与载体(如含有来自人类细胞巨化病毒的主要中级早期基因启动子元件的载体)结合的哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene 5：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；认为本领域技术人员有能力优先决定特定宿主细胞系，所述特定宿主细胞系最适合于将在该细胞中表达的预期基因产物。典型的宿主细胞系包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXBII(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)、HeLa(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仑鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-Ic IBPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系典型地可来自商业服务、美国组织培养收藏机构或出版的文献。
另外，可选择宿主细胞株，所述宿主细胞株以预期的特定方式调控插入序列的表达，或修饰并加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如酶切)对蛋白功能而言可以是重要的。不同的宿主细胞具有用于翻译后加工及修饰蛋白和基因产物的典型的和特定的机制。可选择适合的细胞系或宿主系统以保证所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于正确加工基因产物的初始转录、糖基化作用和磷酸化作用的细胞机制的真核宿主细胞。
对于长期、高产地生产重组蛋白而言，稳定表达是优选的。例如，可工程改造稳定表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可用由合适的表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选标记来转化，而不使用包含复制病毒来源的表达载体。导入外源DNA后，可让工程细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的可选标记赋予所选择的细胞抗性，并使细胞将质粒稳定整合于其染色体并生长形成集落，所述集落可依次克隆和扩增为细胞系。优选地，此方法可用于工程改造稳定表达本发明抗原结合多肽的细胞系。
可使用许多选择系统，包括但不限于，在tk-、hgprt-或aprt-细胞中，可分别采用单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22：8171980)基因。此外，可用抗代谢物抗性作为选择下列基因的基础：赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：1527(1981))、赋予霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：2072(1981))、赋予氨基糖苷G-418抗性的neo(Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)和赋予潮霉素抗性的hygro(Santerre等，Gene 30：147(1984)。可使用重组DNA技术的本领域所熟知的方法，在Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression， A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及在12和13章，Dracopoli等(编辑)，Current Prolocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)中描述，上述文献通过引用全部并入本文。
可通过载体扩增来增加抗原结合多肽的表达水平(综述参见Bebbingtonand Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。若表达抗体的载体系统中的标记可扩增，那么，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将增加标记基因的拷贝数。因为扩增区与抗体基因有关，抗体的产量也将提高(Grouse等，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
编码本发明的抗原结合多肽或其变体、或衍生物的基因还可在诸如细菌或酵母或植物细胞之类的非哺乳动物细胞中表达。易于吸收核酸的细菌包括肠杆菌科(如埃希氏大肠杆菌或沙门氏菌菌株)、芽孢杆菌科(如枯草芽孢杆菌)、肺炎球菌、链球菌和流感嗜血杆菌。可进一步理解的是，在细菌中表达时，异源多肽典型地成为包涵体的一部分。异源多肽必须分离、纯化然后组装为功能性分子。
在细菌系统中，优选地，许多表达载体可根据所表达的抗体分子的预期使用来选择。例如，当要生产大量的这种蛋白以产生抗体分子的药物组合物时，指导表达高水平的易纯化的融合蛋白产物的载体可为理想的。这些载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791(1983))；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.73：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等等，其中，在所述大肠杆菌表达载体pUR278，可在具有lacZ编码区的框架中将抗体编码序列独立连接于载体中，从而产生融合蛋白。pGEX载体也可用于表达作为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般而言，这种融合蛋白是可溶的并易于从裂解细胞中纯化，所述纯化通过吸附并结合于基质谷胱甘肽-琼脂糖珠中，然后用游离谷胱甘肽洗脱来进行。pGEX载体被设计为包含凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶切位点，这样克隆的目标基因产物可从GST部分中释放。
除了原核生物，也可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的面包酵母是真核微生物中最为常用的，尽管通常也可用许多其他菌株，如毕赤酵母(Pichia pastoris)。
对于在酵母菌属中的表达而言，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature 252：39(1979)；Kingsman等，Gene 7：141(1979)；Tschemper等，Gene10：157(1980))。该质粒已包含了trpl基因，所述基因向不能在色氨酸中生长的酵母变异菌株提供选择标记，所述酵母变异菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))。然后作为酵母宿主细胞基因组的特性的trpl损伤的出现为检测转化提供有效的环境，所述检测通过在缺乏色氨酸的条件中生长来进行。
在昆虫系统中，典型地用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可单独克隆到病毒的非必需区域(如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦本发明的抗原结合多肽被重组表达，所得到的表达产物可用纯化免疫球蛋白分子的任何本领域已知的方法纯化，例如，通过层析法(例如，离子交换层析，亲和层析(尤其是通过蛋白A后的特定抗原的亲和层析)和定型柱层析)、离心法、差别溶解法或通过任何纯化蛋白的其他标准技术。可选地，增加本发明抗体亲和性的优选方法在2001年11月14日提交的Zauderer等人的US 2002-0123057A1中公开。
治疗和诊断方法
如本发明描述，本发明抗原结合多肽、变体或衍生物可用于一些与炎性的、免疫性的或恶性疾病或病症有关的治疗和诊断方法。具体地，本发明的一些抗原结合多肽可为LIGHT活性的拮抗剂。例如，一些抗原结合多肽可为LIGHT活性的拮抗剂，所述LIGHT活性例如，T-细胞刺激、诸如如IFN-γ和IL-8之类的致炎性细胞因子的刺激以及通过CD3和Th17细胞产生IL-17的刺激。此外，本发明的LIGHT抗原结合多肽可干扰LIGHT结合LTβ受体、HVEM受体和诱骗受体3/TR6还有其他LIGHT结合的受体的能力。
本发明进一步涉及基于抗原结合多肽的治疗方法，所述方法包括将本发明的抗原结合多肽给药于诸如动物、哺乳动物和人之类的患者，从而治疗一种或一种以上本发明描述的失调或病症。本发明的治疗化合物包括但不限于，本发明的抗原结合多肽(包括本发明描述的其变体及衍生物)和编码本发明的抗原结合多肽(包括本发明描述的其变体及衍生物)的核酸或多核苷酸。
本发明的抗原结合多肽可用于治疗、抑制或预防疾病、失调和病症，所述疾病、失调和病症包括但不限于本发明描述的疾病、失调或病症当中的任何一中或一种以上，例如，免疫或炎症性疾病、失调或与这类疾病或失调相关的病症(包括但不限于，自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性新生儿血小板减少症、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫血细胞减少症、溶血性贫血、抗磷脂综合征、皮炎、过敏性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、肾小球肾炎(如IgA肾病)、多发性硬化、神经炎、葡萄膜炎眼炎、多发内分泌病、紫癜(如Henloch-Scoenlein紫癜)、莱特尔氏病、僵人综合征、自身免疫性肺部炎症、格林-巴利综合征、胰岛素依赖型糖尿病、和自身免疫性眼炎、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺功能减退症(即桥本甲状腺炎)、系统性红斑狼疮、古德帕斯丘肺出血-肾炎综合征、天疱疮，诸如(a)格雷夫斯氏病、(b)重症肌无力、(c)胰岛素耐受之类的受体自身免疫、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、类风湿关节炎、抗-胶原抗体硬皮病、混合性结缔组织病、多发性肌炎/皮肌炎、恶性贫血、特发性阿狄森氏病、不孕症、诸如原发性肾小球肾炎和IgA肾病的肾小球肾炎、大疱性类天疱疮、干燥综合征、糖尿病、和肾上腺素药物抗性(包括具有哮喘或囊性纤维化的肾上腺素药物抗性)、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、其他内分泌腺衰竭、白癜风、血管炎、心肌梗死后、心切开术综合征、荨麻疹、过敏性皮炎、哮喘、炎性肌病和其他炎症性、肉芽肿性、退化性和萎缩性失调)和与这些疾病或失调相关的免疫缺陷或病症(包括但不限于，X连锁的重症联合免疫缺陷病(SCID)、常染色体SCID、腺苷脱氨酶缺乏症(ADA缺陷)、X-连锁的无丙种球蛋白血症(XLA)、布鲁顿氏症、先天性无丙种球蛋白血症、X-连锁的婴儿无丙种球蛋白血症、获得性无丙种球蛋白血症、成年发病型无丙种球蛋白血症、迟发性无丙种球蛋白血症、异常丙种球蛋白血症、低丙球蛋白血症、婴儿临时性低丙球蛋白血症、不明低丙球蛋白血症、无丙种球蛋白血症、常见多样性免疫缺陷(CVID)(获得性)、威斯科特-奥尔德奇免疫缺陷综合征(WAS)、高IgM X-连锁的免疫缺陷、高IgM非X-连锁的免疫缺陷、选择性IgA缺陷症、IgG亚类缺乏症(具有或不具有IgA缺陷)、具有正常或升高的Igs的抗体缺乏症、伴随胸腺瘤的免疫缺陷、免疫球蛋白重链缺失症、κ链缺乏症、B细胞淋巴增生失调(BLPD)、选择性IgM免疫缺陷、隐性无丙种球蛋白血症(瑞士型(Swiss type))、网状组织发育不良、新生儿中性粒细胞减少症、重度先天性白细胞减少症、伴随免疫缺陷的胸腺淋巴发育不全或发育异常、共济失调毛细血管扩张症、短肢侏儒症、X-连锁的淋巴增生综合征(XLP)、内泽洛夫综合征结合的Igs免疫缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症(PNP)、MHC II类缺乏症(巴尔淋巴球症候群)、重症联合免疫缺陷、DiGeorge异常、胸腺发育不全、慢性皮肤粘膜念珠菌病、自然杀伤细胞缺乏症、特发性CD4+T淋巴细胞减少症和伴随显著T-细胞缺陷的免疫缺陷)。
本发明的抗原结合多肽也可用于治疗、抑制或预防疾病、失调或病症，所述疾病、失调或病症包括与如细胞存活增加或凋亡抑制的疾病或失调相关的恶性疾病、失调或病症，例如癌症(滤泡性淋巴瘤、伴随p53基因突变的癌症和激素依赖性肿瘤，包括但不限于：结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经母细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、骨母细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤和卵巢癌)、自身免疫失调(如多发性硬化症、干燥综合征、凸眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬化、白塞病、克罗恩病、多发性肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关性肾小球性肾炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板减少性紫癜和类风湿关节炎)和病毒感染(如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植排斥和慢性移植排斥。本发明的抗原结合多肽、其变体、或衍生物用于阻止肿瘤的生长、发展和/或转移，尤其是以上列举的或以下段落中的肿瘤。
可使用本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物治疗、预防、诊断和/或预测与细胞成活增加相关的其他疾病或病症，所述疾病或病症包括但不限于：恶性肿瘤的进展和/或转移以及相关失调，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病和急性红血球性白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，所述实体瘤包括但不仅限于：肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可使用本发明的抗原结合多肽或其变体或衍生物治疗、预防、诊断和/或预测与细胞凋亡增加相关的疾病，包括但不限于：艾滋病，神经退行性疾病(如，阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、视网膜色素变性、小脑退化和脑瘤或与前述相关的疾病)，自身免疫性失调(如，多发性硬化症、干燥综合征、凸眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬化、白塞氏病、克罗恩病、多发性肌炎、系统性红斑狼疮、免疫相关性肾小球肾炎、自身免疫性胃炎、血小板减少性紫癜和类风湿关节炎)、骨髓增生异常综合征(如再生障碍性贫血)、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、缺血性损伤(如心肌梗塞、中风和再灌注损伤引起的)、肝损伤或疾病(例如，肝炎相关的肝损伤、肝硬化、缺血/再灌注损伤、胆汁淤积症(胆管损伤)和肝癌)，毒素引起的肝脏疾病(如酒精引起的)、感染性休克、溃疡性结肠炎、恶病质和厌食症。
在治疗和诊断方法中，本发明的抗原结合多肽对其有益的的疾病、失调或病症的例子包括但不限于：自身免疫性疾病、炎症性肠病(IBD)，慢性阻塞性肺病(COPD)，关节炎，类风湿关节炎、多发性硬化症，移植排斥，移植物抗宿主病(GVHD)，中枢神经系统损伤，Th1介导的肠道疾病，克罗恩病，银屑病，白血病，淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，动脉粥样硬化，肺癌，结肠癌和肝炎。
用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于一系列因素，包括使用的特定抗原结合多肽、其变体或衍生物、患者年龄、体重、大致健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄率、药物组合、治疗的特定疾病的严重程度。医护人员对这些因素的判断在本领域普通技术的范围之内。用量还将取决于待治疗的个别患者、给药途经、剂型、使用的化合物的特性、疾病严重程度和预期疗效。用量可由本领域熟知的药理学和药代动力学原则确定。
抗原结合多肽、其变体或衍生物的给药方法包括但不限于：皮内给药、肌肉内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、鼻内给药、硬膜外给药和口服给药途径。抗原结合多肽或组合物可通过任何方便的途径给药，例如通过灌注或弹丸式注射给药，通过上皮或粘膜内层(如口腔黏膜、直肠和小肠粘膜等)吸收给药并可与其他生物活性剂一起给药。因此，包含本发明的抗原结合多肽的药物组合物可通过口服给药、直肠给药、肠外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹膜内给药、局部(如用粉末、软膏、滴剂或贴剂)给药、颊部给药或口服给药或喷鼻剂给药。
如本发明所使用的术语“肠外”指的是包括静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、胸骨内注射、皮下注射及关节内注射和输注的给药模式。
给药可为全身的或局部的。另外，理想的是通过任何适当途径在中枢神经系统中引入本发明的药物化合物或组合物，包括心室或鞘内注射；心室内的导管可便于心室注射，例如，连接于诸如奥马耶储液囊之类的储存器的心室内导管。也可采用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器和雾化试剂剂型。
理想的是用本发明的抗原结合多肽或组合物对需要治疗的部位局部给药；例如，这可通过但不限于以下方法实现：手术中局部输注，局部应用(例如结合术后使用创伤敷料)、注射、导管方式、栓剂方式、植入物方式，所述植入物是多孔状的、非多孔的或凝胶状物质，包括诸如硅橡胶膜或纤维。优选地，当用本发明的蛋白质(包括抗体)给药时，必须注意使用蛋白质不吸附的材料。
在另一实施方式中，抗原结合多肽或组合物可在小泡(特别是脂质体)内递送，(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer中，Lopez-Berestein and Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；参见基本同上)。
在又一实施方式中，抗原结合多肽或组合物可在控制释放系统中递送。在一种实施方式中，可使用泵(参见Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一种实施方式中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；see also Levy等，1985，Science228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在又一实施方式中，控制释放系统可放置在接近治疗对象的位置(即脑)，因此只需全身剂量的一小部分(参见例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，supra，第2卷，第115-138页(1984))。其他控制释放系统在Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中讨论。
在特定的实施方式中，本发明的组合物包含编码蛋白的核酸或多核苷酸，所述核酸通过构建成为合适的核酸表达载体的部分并进行给药可在体内进行给药以促进所述核酸的编码的蛋白的表达，这样所述核酸通过以下方式成为细胞内的，例如，通过使用逆转录载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击法(例，基因枪，Biolistic、Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包裹，或通过连接到已知进入核内的同源框样多肽进行给药(参见Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等)。可选地，核酸可通过胞内引入并通过同源重组整合到宿主细胞DNA内表达。
标准临床技术可测定有效治疗、阻止和预防炎症、免疫或恶性疾病、失调或病症的本发明抗原结合多肽的量。另外，可选择性应用体外检测协助确定最佳剂量范围。剂型中使用的准确剂量还将取决于给药途径、疾病、失调或病症的严重性，并应根据医生的判断和每位患者的情况作出决定。有效剂量可由来自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线推测。
通常建议，给药于患者的本发明的抗原结合多肽的剂量典型地是0.1mg/kg患者体重至100mg/kg患者体重、0.1mg/kg患者体重至20mg/kg患者体重或1mg/kg患者体重至10mg/kg患者体重。通常，由于外源多肽的免疫反应，人类抗体比来自其他物种的抗体在人体内具有更长的半衰期。因此，通常可用更低剂量的人类抗体和更低的给药频率。另外，通过修饰(如脂化)提高抗体的吸收和组织渗透(如进入脑部)可减少本发明抗体的给药剂量和频率。
在治疗类风湿关节炎中，本发明的抗原结合多肽的给药模式包括皮内、皮下及关节内注射和输注。关节内或皮下给药的抗原结合多肽的每个剂量可为大约0.1mg/kg患者体重至大约100mg/kg患者体重。
本发明的组合物可单独给药或与其他治疗试剂(如共刺激分子)联合给药。治疗剂可与本发明的组合物联合给药，所述治疗剂包括但不限于：TNF家族的其他成员、化学疗法药剂、抗体、类固醇和非类固醇类消炎药、传统免疫治疗剂、细胞因子和/或生长因子。组合物可伴随(如作为混合物)、分别但同时或共同地给药，或顺序给药。这包括所联合的药剂作为治疗混合物一起给药的情况，也包括所联合的药剂分别但同时给药的过程，例如，通过分开的静脉置管进入同一个体中。“联合”给药还包括先给药一种化合物或药剂随后给药第二个化合物或药剂的分别给药方式。因此，实际上，治疗剂可同时或不同时地对给药于个体。大多数情况下，当治疗试剂不同时对个体进行给药时，通常以使这些试剂的疗效重叠一段时间的方式进行给药。本领域普通技术人员将知道如何将本发明的抗原结合多肽用于诊断、监控或治疗目的。
包含给药本发明的抗原结合多肽、其变体、或衍生物的治疗炎症、免疫或恶性疾病、病症或失调的方法，在应用于人体中之前，典型地在可接受的动物模型中先进行体外测试，然后进行体内测试以预测治疗或预防活性。本领域普通技术人员熟知合适的动物模型，包括转基因动物。例如，说明本发明描述的抗原结合多肽治疗效果的体外检测包括抗原结合多肽在细胞系或患者组织样本中的效果。可使用本领域技术人员熟知的技术测定抗原结合多肽在细胞系和/或患者组织样本中的效果，例如本发明其他部分公开的检测。依照本发明，体外检测可用于测定特定抗原结合多肽的给药是否被显示，包括，体外细胞培养检测，在所述检测中，在培养基中培养患者组织样本，并且将患者组织样本暴露于化合物或别的给药的化合物，并观察该化合物对组织样本的效果。
组合物
已知许多递送系统并可将所述递送系统用于给药本发明的抗原结合多肽或编码本发明的抗原结合多肽的多核苷酸，所述递送系统例如，封包在脂质体中、微粒、微囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如，Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)、构建核酸为逆转录病毒或其他载体的部分，等。
在另外的实施方式中，本发明的组合物与抗病毒剂、抗菌剂或抗生素剂或抗真菌剂联合给药。本领域已知的任何这些试剂都可在本发明的组合物中给药。
在另外的实施方式中，本发明的组合物单独给药或与抗炎症药剂联合给药。可伴随本发明的组合物给药的抗炎症药剂，包括但不限于：糖皮质激素和非甾体类消炎药、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸酸衍生物、芳基羧酸衍生物、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪甲酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基-丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。
在另一实施方式中，本发明的组合物与化学治疗剂联合给药。可伴随本发明组合物给药的化学治疗剂包括但不限于：抗生素衍生物(例如，阿霉素、博莱霉素、柔红霉素和更生霉素)、抗雌激素(如他莫昔芬)、抗代谢药物(如氟脲嘧啶、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡氮芥、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀、环己亚硝脲(CCNU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲孕酮、磷酸钠雌莫司汀、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾酮、二磷酸已烯雌酚、氯烯雌醚和睾内酪)、氮芥衍生物(如米尔法兰、苯丁酸氮介、氮芥和塞替派)、类固醇和组合(如磷酸钠倍他米松)和其他(如达卡巴嗪、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。
在其他实施方式中，本发明的组合物与细胞因子联合给药。可伴随本发明组合物给药的细胞因子包括但不限于：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗-CD40、CD40L和TNF-α。
在其他的实施方式中，本发明的组合物与其他治疗或预防方案(如放射疗法)联合给药。
本发明还提供药物组合物。这样的组合物包含治疗有效量的抗原结合多肽，以及药学上可接受的载体。在特定的实施方式中，术语“药学上可接受”指由联邦或州政府批准的，或美国药典或其他公认药典列举的，用于动物(尤其是人体)中的。此外，“药学上可接受的载体”通常将为任何类型的无毒的固体、半固体或液体填料、稀释液、成胶囊物质或剂型辅剂。
术语“载体”指给药治疗剂的稀释液、佐剂、赋形剂或媒介物。这些药物载体可为无菌液体，例如，水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的那些无菌液体，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物通过静脉注射给药时，水是优选载体。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液可用作液态载体，尤其用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)。抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和张性调节剂也是理想的，所述抗菌剂例如，苯甲醇或对羧基苯甲酸甲酯，所述抗氧化剂例如，抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述螯合剂例如，乙二胺四乙酸，所述张性调节剂例如，氯化钠或葡萄糖。这些组合物可采用溶液、悬浊液、乳浊液、药片、药丸、胶囊、粉末、持续释放剂型等形式。组合物可用诸如甘油三酯之类的传统粘合剂制成栓剂。口服剂型可包括诸如药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁之类的标准载体。合适的药用载体的例子在E.W.Martin著作的Remington′s Pharmaceutical Sciences中有描述，上述文献通过引用并入本文。这些组合物将包含治疗有效量的抗原结合多肽(优选纯化形式的)与合适量的载体，以便于向患者提供合适的给药形式。剂型应适合给药模式。源制剂可装入玻璃或塑料制的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶。
在优选的实施方式中，根据常规程序，将组合物制成适用于静脉注射给药于人类的药物组合物。典型地，用于静脉给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液。如果必要，组合物还可包括增溶剂，和用于舒缓注射部位疼痛的诸如利多卡因之类的局部麻醉剂。通常成分以单位剂量的形式分开或混合提供，例如，作为在标明活性剂的量的诸如安瓿或小袋之类的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物。组合物通过输注给药时，可用包含无菌药用等级水或盐的输注瓶配药。组合物通过注射给药时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，以便在给药前可将成分混合。
本发明的化合物可配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括阴离子形成的盐，例如来自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的盐，和阳离子形成的盐，例如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
实施例
实施例1
使用杂交瘤技术制备抗-LIGHT抗体的方法
用重组LIGHT蛋白(Genbank登录号AF036581的胞外结构域片段氨基酸Leu Ile Glu至Phe Met Val)免疫BALB/c小鼠。典型过程中，对小鼠皮下注射50毫克完全弗氏佐剂(Sigma，St.Louis，MO)中的10毫克蛋白。每隔2周以非完全弗氏佐剂额外注射2到4次，然后以PBS进行末次加强。可选地，注射可在足垫中进行。最后接种后三天，处死小鼠并获取其脾或腿弯部淋巴结。从脾或淋巴结中分离淋巴细胞以融合。用PEG/DMSO(Sigma)作为融合剂将淋巴细胞以5∶1的淋巴细胞比浆细胞瘤细胞的比例与P3X63Ag8.653浆细胞瘤细胞融合。融合后，在选择性HAT培养基中重悬细胞，并以每孔106个细胞接种于96孔板中。HAT选择中存留的杂交瘤的上清液通过直接结合ELISA筛选出LIGHT结合抗体的出现。确定分泌LIGHT结合抗体的杂交瘤，并由ELISA进一步从所述杂交瘤的上清液中筛选出抗体，所述抗体抑制LIGHT结合于3个已知受体：HVEM、LTβR和DcR3。然后筛选被确定为阳性抑制LIGHT结合的杂交瘤用于抑制LIGHT介导的HT-29细胞杀伤，从而确定LIGHT拮抗抗体。
产生一板单克隆抗体并选择主要的鼠抗体(如10D11、5E10、13C7、14G8和18B1)用于人源化，所述人源化基于结合试验与对LIGHT结合HVEM、LTβR和诱骗DcR3受体的抑制(图3)。例如，鼠10D11抗体的结合数据在下表6中表示。
表6
Figure BPA00001463509700821
*LIGHT转染细胞MFC(平均荧光值)与载体对照细胞MFC的比值。
克隆并测序来自杂交瘤细胞系的鼠抗-LIGHT VH和VK结构域
吹打杂交瘤细胞，用PBS洗3次，根据厂商实验方案用Trizol试剂(Invitrogen，Cat.No.15596-026)提取RNA。根据厂商实验方案用5’RACE试剂盒(cDNA末端快速扩增，Invitrogen，Cat.No.18374-058)将总RNA转化为cDNA。简要地说，将RNA连接到随机六聚引物(Random N6)，且用superscript II RNAaseH阴性逆转录酶产生第一链cDNA。用试剂盒提供的GlassMax离心柱纯化cDNA，然后在dCTP存在的条件下与TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)反应，以将C碱基添加于cDNA的5’末端。使用dC尾的特异锚定引物和与小鼠VH的重链恒定1(CH1)结构域和VK的恒定κ结构域(CK)中的高保守DNA序列杂交的基因特异性引物PCR扩增dC-尾cDNA。通过凝胶电泳分析得到的PCR产物，然后纯化对应于完整VH或VK结构域的正确大小的产物，并根据厂商实验方案连接于TOPO TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，Cat.No.K4575-01)。转化到细菌中后，从包含正确大小的插入片段的克隆中制备DNA，并根据厂商实验方案用Big Dye终止剂测序反应混合物(Applied Biosystems，Part No.4336699)和3700ABI/Prism DNA测序仪测定DNA序列。
抗体人源化方案
人源化抗-LIGHT抗体的一个目标是获取70％-100％人源化的、保留90％-100％初始的结合亲和力和特异性的重链可变(VH)和轻链可变(VK)结构域。
人源化通过CDR嫁接、基于结构的分析和可变区重塑进行。(参见Jones等，NATURE(1986)五月29日至六月.4；321(6069)：522-5；Roguska等，PROTEINENGINEERING，1996，9(10)：895-904；和Studnicka等，Humanizing MouseAntibody Frameworks While Preserving 3-D Structure.PROTEIN ENGINEERING，1994，卷7，第805页。)使用主要抗体序列和三维结构数据来确定维持结合亲和力和特异性所需的关键骨架残基。用美国生物技术信息中心(NCBI)赞助的“免疫球蛋白序列搜索工具”(“Blast for Ig sequences”)网站确定与研究中使用的小鼠VH和VK区最接近的匹配。选择人类胚系VH和VK基因作为小鼠序列VH和VK序列的最佳匹配。可选地，自然表达的人类抗体谱的序列可单独用作人源化模板或与最接近匹配的人类胚系基因结合用作人源化模板。
将小鼠抗-LIGHT抗体的重链可变区和轻链可变区与最接近的人类胚系基因或表达谱基因进行比对后，评估每个位点上的氨基酸对结合和免疫性的潜在影响。该信息用于确定每个位点的低突变风险值、中突变风险值或高突变风险值。
例如，为了构建人源化抗体10D11、5E10、14G8和18B1，无论低风险、中风险或高风险，大部分位点都同时突变以产生最终的人源化抗体。
人源化鼠抗-LIGHT抗体
在如上述生成的结合数据和序列数据的基础上确定鼠抗-LIGHT抗体。用当前可用的公共数据库(NCBI的免疫球蛋白IgG搜索工具(BLAST for IgG)和MRC的抗体胚系基因数据库(V-base))将来自这些抗体的VH和VK结构域的氨基酸序列与人类胚系VH和VK结构域进行比对。在小鼠序列与人类胚系不同的骨架位点上，用迭代过程对小鼠骨架进行转变或突变，以便其与相应的人类胚系骨架匹配。如果特定骨架突变引起结合亲和力损失，可由酪氨酸或其他合适的氨基酸(即亲和充分的)替代而突变VH和VK的某些CDR氨基酸残基，以补偿这些损失。亲和充分且人源化的小鼠VH和VK结构域可用一板交叠的合成DNA寡核苷酸通过聚合酶链式反应过程产生。本发明描述的人源化小鼠抗-LIGHT单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区结构域氨基酸序列在表7和表8中列出。可变结构域的CDR部分用下划线标出。
表7鼠抗-LIGHT抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
Figure BPA00001463509700841
Figure BPA00001463509700851
表8鼠抗-LIGHT抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
Figure BPA00001463509700852
密码子优化策略可用作合成基因设计过程的一部分。在VH和VK的每个位点中整合哺乳动物细胞基因表达优先使用的每个氨基酸的三联密码子。随后将合成的VH和VK结构域克隆到特定的哺乳动物表达载体上，所述载体使得相应的VH和VK结构域在完全人类的IgG1、G4或κ抗体骨架的背景下表达。人源化抗体的小规模生产根据厂商实验方案用脂质体(Invitrogen，Carlsbad，CA)通过将IgG1或G4构造与κ构造共转染于293F细胞内来实现。将瞬时转染的上清液通过蛋白A或G树脂，并且将IgG纯化至具有均一性以用于基于细胞检测的测试。
如本发明所述制备典型的人源化小鼠抗-LIGHT单克隆抗体的可变重链和可变轻链结构域的氨基酸序列在前面表2和表4中已有描述。
实施例2
该实施例描述测量LIGHT诱导的HT-29细胞杀伤的抑制的试验方案，且该实施例基于LIGHT诱导HT-29细胞凋亡的活性。用胰蛋白酶分散HT-29细胞，用RPMI 10％FBS培养基洗2次并在RPMI 1％FBS培养基中以1x106个细胞/mL的浓度重悬。37℃下用100ng/mL IFN-γ预处理细胞6小时。制备不同浓度的(4X)5倍连续稀释的LIGHT抗体、LTβR-Fc和对照-Fc，起始浓度是40g/mL。将一式三份的25μL 4X试剂转移到96孔板，加入25μL 400ng/mL(4X)LIGHT，常温下孵育15分钟。人类LIGHT和猕猴LIGHT用于独立的实验中。参见，例如，图9A和图9B。加入50μL 1x106/mL HT-29细胞(用IFN-γ预孵育)并在细胞培养箱内培养72小时。加入100μL细胞滴度glo试剂(Promega)测定细胞活性。发光度用Victor2荧光计(Perkin-Elmer，Waltham，MA)读数。不同抗-LIHGT抗体的这种检测得到的结果在图5A至图5C、图9A和图9B中表示。
实施例3
该实施例描述用流式细胞仪测定LIGHT抗体结合于在活化T-细胞表面表达的LIGHT的试验方案。37℃下用50ng/mL PMA和0.5μg/mL离子霉素过夜激活极化的Th1、Th2和Th17细胞。将一百万个活化的T-细胞转移到5mLFACS管，1200rpm离心5分钟。在FACS染色缓冲液中重悬细胞团，并在常温下用抗-LIGHT抗体或对照抗体孵育40分钟。用2mL PBS洗涤2次后，用PE结合的二级试剂孵育细胞1小时。用2mL PBS洗涤细胞3次并在0.5mLPBS中重悬，用流式细胞仪分析。该检测的结果在图10A和图10B中表示。
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本发明不限于意在单纯举例说明本发明的各个方面的上述特定实施方式的范围，任何功能相同的组合物或方法都在本发明的范围内。对本领域技术人员来说显而易见的是，各种修改和改变可通过本发明的方法和组合物制得而不背离本发明的实质或范围。因此，本发明意在覆盖所附的权利要求的范围内的本发明所提供的修改和改变及其等同范围。
本发明说明书中所涉及的所有公开出版物和专利申请以与单独且具体指明通过引用并入本发明的各个公开出版物或专利申请相同的程度通过引用并入本文。

Claims (30)

1.一种特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽含有人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：
(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含氨基酸序列X1Y X2X3X4(SEQ IDNO：18)，其中，X1为氨基酸D、S、T或N；X2为氨基酸Y、L或W；X3为氨基酸I或M；且X4为氨基酸Y、H、E或N；
(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含氨基酸序列X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17(SEQ ID NO：19)，其中，X5为氨基酸Y、M、V或W；X6为氨基酸D、N、H或F；X7为氨基酸Y、G或S；X8为氨基酸N、S、T或D；X9为氨基酸G、S或D；X10为氨基酸G、D、E或I；X11为氨基酸T或S；X12为氨基酸K或R；且X13为氨基酸Y或L；X14为氨基酸Q或E；X15为氨基酸K或N；X16为氨基酸K、I或R；且X17为氨基酸G、A或D；以及
(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：
(i)WX18X19(SEQ ID NO：20)；
(ii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28(SEQ ID NO：21)；和
(iii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF(SEQ ID NO：22)；
其中，X18为氨基酸D或N；X19为氨基酸R或Y；X20为氨基酸E、T或G；X21为氨基酸D、S或N；X22为氨基酸Y或G；X23为氨基酸G、S或V；X24为氨基酸I、S或W；X25为氨基酸S、W或A；X26为氨基酸T、F或M；X27为氨基酸Y、P或D；且X28为氨基酸S或Y。
2.一种特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：
(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：
(i)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38(SEQ ID NO：38)；
(ii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42(SEQ ID NO：39)；和
(iii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H(SEQ IDNO：40)；
其中，X29为氨基酸K或R；X30为氨基酸A或S；X31为氨基酸Q或K；X32为氨基酸D、S或N；X33为氨基酸V、I或L；X34为氨基酸G、S、V或L；X35为氨基酸T、N或H；X36为氨基酸A、N或S；X37为氨基酸V、L、N或G；X38为氨基酸A、H、G或Y；X39为氨基酸N或T；X40为氨基酸T或Y；X41为氨基酸Y或M；X42为氨基酸F或H；
(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列X43X44X45X46X47X48X49(SEQ ID NO：41)；
其中，X43为氨基酸W、Y、K或I；X44为氨基酸A、T或V；X45为氨基酸S或Y；X46为氨基酸T、Q或N；X47为氨基酸R、S或L；X48为氨基酸H、I、F或E；且X49为氨基酸T或S；以及
(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列X50X51X52X53X54X55PX56T(SEQ ID NO：42)；
其中，X50为氨基酸Q或S；X51为氨基酸Q或H；X52为氨基酸S或Y；X53为氨基酸S、N、T或R；X54为氨基酸S、R、H或E；X55为氨基酸Y、W、V或L；且X56为氨基酸L或Y。
3.一种特异性结合于LIGHT多肽的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含：
(a)人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：
(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含氨基酸序列X1Y X2X3X4(SEQ IDNO：18)，其中，X1为氨基酸D、S、T或N；X2为氨基酸Y、L或W；X3为氨基酸I或M；且X4为氨基酸Y、H、E或N；
(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含氨基酸序列X5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17(SEQ ID NO：19)，其中，X5为氨基酸Y、M、V或W；X6为氨基酸D、N、H或F；X7为氨基酸Y、G或S；X8为氨基酸N、S、T或D；X9为氨基酸G、S或D；X10为氨基酸G、D、E或I；X11为氨基酸T或S；X12为氨基酸K或R；且X13为氨基酸Y或L；X14为氨基酸Q或E；X15为氨基酸K或N；X16为氨基酸K、I或R；且X17为氨基酸G、A或D；以及
(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：
(i)WX18X19(SEQ ID NO：20)；
(ii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28(SEQ ID NO：21)；和
(iii)X20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDF(SEQ ID NO：22)；
其中，X18为氨基酸D或N；X19为氨基酸R或Y；X20为氨基酸E、T或G；X21为氨基酸D、S或N；X22为氨基酸Y或G；X23为氨基酸G、S或V；X24为氨基酸I、S或W；X25为氨基酸S、W或A；X26为氨基酸T、F或M；X27为氨基酸Y、P或D；且X28为氨基酸S或Y；以及
(b)人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：
(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：
(i)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38(SEQ ID NO：38)；
(ii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42(SEQ IDNO：39)；和
(iii)X29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42H(SEQ IDNO：40)；
其中，X29为氨基酸K或R；X30为氨基酸A或S；X31为氨基酸Q或K；X32为氨基酸D、S或N；X33为氨基酸V、I或L；X34为氨基酸G、S、V或L；X35为氨基酸T、N或H；X36为氨基酸A、N或S；X37为氨基酸V、L、N或G；X38为氨基酸A、H、G或Y；X39为氨基酸N或T；X40为氨基酸T或Y；X41为氨基酸Y或M；X42为氨基酸F或H；
(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列X43X44X45X46X47X48X49(SEQ ID NO：41)，其中，X43为氨基酸W、Y、K或I；X44为氨基酸A、T或V；X45为氨基酸S或Y；X46为氨基酸T、Q或N；X47为氨基酸R、S或L；X48为氨基酸H、I、F或E；且X49为氨基酸T或S；以及
(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列X50X51X52X53X54X55PX56T(SEQ ID NO：42)，其中，X50为氨基酸Q或S；X51为氨基酸Q或H；X52为氨基酸S或Y；X53为氨基酸S、N、T或R；X54为氨基酸S、R、H或E；X55为氨基酸Y、W、V或L；且X56为氨基酸L或Y。
4.如权利要求1所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述人源化抗体重链可变区包含：
(1)CDR-H1，所述CDR-H1包含选自以下的氨基酸序列：
(i)SSYIH(SEQ ID NO：23)；
(ii)DYYIY(SEQ ID NO：26)；
(iii)TYLIE(SEQ ID NO：29)；
(iv)TYWMN(SEQ ID NO：32)；和
(v)NYLIE(SEQ ID NO：35)；
(2)CDR-H2，所述CDR-H2包含选自以下的氨基酸序列：
(i)WIFPGSDITKYNEKFKG(SEQ ID NO：24)；
(ii)YIDPYNGGTKYNQKFKD(SEQ ID NO：27)；
(iii)VINPGTGETKYNENFRA(SEQ ID NO：30)；
(iv)M1HPSDSESRLNQKFID(SEQ ID NO：33)；和
(v)VINPGSGDTKYNENFKG(SEQ ID NO：36)；以及
(3)CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的氨基酸序列：
(i)EDYGISTYSAMDF(SEQ ID NO：25)；
(ii)TSGSSWFPY(SEQ ID NO：28)；
(iii)WDR(SEQ ID NO：31)；
(iv)GNYVWAMDY(SEQ ID NO：34)；和
(v)WNY(SEQ ID NO：37)。
5.如权利要求2所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：
(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含选自以下的氨基酸序列：
(i)KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：43)；
(ii)RASQSISNNLH(SEQ ID NO：46)；
(iii)RSSQNLVHSNGNTYFH(SEQ ID NO：49)；
(iv)RASKSVSTSGYTYMH(SEQ ID NO：52)；和
(v)RSSQSLLHSNGNTYFH(SEQ ID NO：55)；
(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含选自以下的氨基酸序列：
(i)WASTRHT(SEQ ID NO：44)；
(ii)YTYQSIS(SEQ ID NO：47)；
(iii)KVSNRFS(SEQ ID NO：50)；和
(iv)ITSNLES(SEQ ID NO：53)；以及
(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的氨基酸序列：
(i)QQYSSYPLT(SEQ ID NO：45)；
(ii)QQSNRWPLT(SEQ ID NO：48)；
(iii)SQSTHVPYT(SEQ ID NO：51)；和
(iv)QHSRELPYT(SEQ ID NO：54)。
6.如权利要求4所述的抗原结合多肽，其中：
(1)所述CDR-H1包含氨基酸序列SYYIH(SEQ ID NO：23)；
(2)所述CDR-H2包含氨基酸序列WIFPGSDITKYNEKFKG(SEQ IDNO：24)；且
(3)所述CDR-H3包含氨基酸序列EDYGISTYSAMDF(SEQ ID NO：25)。
7.如权利要求5所述的抗原结合多肽，其中：
(1)所述CDR-L1包含氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO：43)；
(2)所述CDR-L2包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：44)；且
(3)所述CDR-L3包含氨基酸序列QQYSSYPLT(SEQ ID NO：45)。
8.如权利要求6所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽进一步包含人源化抗体轻链可变区，所述人源化抗体轻链可变区包含：
(1)CDR-L1，所述CDR-L1包含氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ IDNO：43)；
(2)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO：44)；以及
(3)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列QQYSSYPLT(SEQ ID NO：45)。
9.如权利要求1所述的抗原结合多肽，其中，所述人源化抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMELSX′10LRSX′11DTAVYYCARWX18X19WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)；
(2)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMELSX′10LRSX′11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)；以及
(3)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX1YX2X3X4WVRQAPGQX′1LEWX′2GX5IX6PX7X8X9X10X11X12X13NX14X15FX16X17X′3X′4TX′5TX′6DX′7SX′8STX′9YMEL SX′10LRSX′11DTAVYYCARX20X21X22X23X24X25X26X27X28AMDFWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO：3)，
其中，X1为氨基酸D、S、T或N；X2为氨基酸Y、L或W；X3为氨基酸I或M；X4为氨基酸Y、H、E或N；X5为氨基酸Y、M、V或W；X6为氨基酸D、N、H或F；X7为氨基酸Y、G或S；X8为氨基酸N、S、T或D；X9为氨基酸G、S或D；X10为氨基酸G、D、E或I；X11为氨基酸T或S；X12为氨基酸K或R；且X13为氨基酸Y或L；X14为氨基酸Q或E；X15为氨基酸K或N；X16为氨基酸K、I或R；且X17为氨基酸G、A或D；其中X18为氨基酸D或N；X19为氨基酸R或Y；X20为氨基酸E、T或G；X21为氨基酸D、S或N；X22为氨基酸Y或G；X23为氨基酸G、S或V；X24为氨基酸I、S或W；X25为氨基酸S、W或A；X26为氨基酸T、F或M；X27为氨基酸Y、P或D；X28为氨基酸S或Y；并且
其中，X′1为氨基酸R或G；X′2为氨基酸M或I；X′3为氨基酸K或R；X′4为氨基酸V或A；X′5为氨基酸M、L或I；X′6为氨基酸V或R；X′7为氨基酸T或K；X′8为氨基酸A、I或T；X′9为氨基酸V或A；X′10为氨基酸R或S；且X′11为氨基酸D或E。
10.如权利要求9所述的抗原结合多肽，其中，所述人源化抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(a)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)；
(b)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)；
(c)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIYWVRQAPGQGLEWIGYIDPYNGGTKYNQKFKDKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTSGSSWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)；
(d)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGTGETKYNENFRARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARWDRWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)；和
(e)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSESRLNQKFIDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVWAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)。
11.如权利要求2所述的抗原结合多肽，其中，所述人源化抗体轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(1)X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38WX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36PX′37X′38LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′47X′48EDX′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQID NO：9)，
(2)X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42WX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36X′37X′38LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′47X′48EDX′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQ ID NO：10)；和
(3)X′12X′13X′14X′15TQX′16PX′17X′18X′19X′20X′21X′22X′23X′24X′25X′26X′27X′28X′29X′30CX29X30SX31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42HWX′31X′32QX′33PX′34X′35X′36X′37X′38LIX′39X43X44X45X46X47X48X49GX′40PX′41RFSGSGSGTX′42FTLX′43IX′44X′45X′46X′47X′48EDX′49X′50X′51YYCX50X51X52X53X54X55PX56TFGQGTX′52VEIKR(SEQ ID NO：11)，
其中，X29为氨基酸K或R；X30为氨基酸A或S；X31为氨基酸Q或K；X32为氨基酸D、S或N；X33为氨基酸V、I或L；X34为氨基酸G、S、V或L；X35为氨基酸T、N或H；X36为氨基酸A、N或S；X37为氨基酸V、L、N或G；X38为氨基酸A、H、G或Y；X39为氨基酸N或T；X40为氨基酸T或Y；X41为氨基酸Y或M；X42为氨基酸F或H；X43为氨基酸W、Y、K或I；X44为氨基酸A、T或V；X45为氨基酸S或Y；X46为氨基酸T、Q或N；X47为氨基酸R、S或L；X48为氨基酸H、I、F或E；X49为氨基酸T或S；X50为氨基酸Q或S；X51为氨基酸Q或H；X52为氨基酸S或Y；X53为氨基酸S、N、T或R；X54为氨基酸S、R、H或E；X55为氨基酸Y、W、V或L；X56为氨基酸L或Y；并且
其中，X′12为氨基酸D或E；X′13为氨基酸I或V；X′14为氨基酸V或Q；X′15为氨基酸M或L；X′16为氨基酸S或T；X′17为氨基酸S、D、A或L；X′18为氨基酸S、T或F；X′19为氨基酸L或Q；X′20为氨基酸A、S或P；X′21为氨基酸V或A；X′22为氨基酸S或T；X′23为氨基酸P、L或V；X′24为氨基酸G或K；X′25为氨基酸E、Q或D；X′26为氨基酸R、K或P；X′27为氨基酸A或V；X′28为氨基酸T或S；X′29为氨基酸I或L；X′30为氨基酸S、T或N；X′31为氨基酸F或Y；X′32为氨基酸Q或L；X′33为氨基酸K或R；X′34为氨基酸G或D；X′35为氨基酸Q或K；X′36为氨基酸A、S或P；X′37为氨基酸K、R或Q；X′38为氨基酸L或R；X′39为氨基酸Y或K；X′40为氨基酸V或I；X′41为氨基酸S、A或D；X′42为氨基酸D或E；X′43为氨基酸K或T；X′44为氨基酸S或N；X′45为氨基酸S或R；X′46为氨基酸V或L；X′47为氨基酸Q或E；X′48为氨基酸P、A或S；X′49为氨基酸F、A或V；X′50为氨基酸A或G；X′51为氨基酸T或V；且X′52为氨基酸R或K。
12.如权利要求11所述的抗原结合多肽，其中，所述人源化抗体轻链可变区包含选自以下的氨基酸序列：
(a)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：12)；
(b)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYTYQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNRWPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)；
(c)
EIVMTQSPATLSVSPGEKATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYTYQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNRWPLTFGQGTRVEIKR(SEQ ID NO：14)；
(d)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：15)；
(e)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQNLVHSNGNTYFHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：16)；和
(f)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYITSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：17).
13.一种特异性结合于LIGHT的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含权利要求9至10中任一项所述的人源化重链和权利要求11至12中任一项所述的人源化轻链。
14.如权利要求1至13任一项所述的抗原结合多肽，其中，所述抗原结合多肽选自抗体分子、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和scFv分子。
15.如权利要求14所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含：
(a)含有以下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGSDITKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYGISTYSAMDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)；和
(b)含有以下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：12)。
16.如权利要求15所述的抗原结合多肽，其中，所述抗体分子包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
17.如权利要求15至16任一项所述的抗原结合多肽，其中，所述抗体分子为IgG分子。
18.如权利要求14所述的抗原结合多肽，其中：
(a)所述抗原结合多肽为scFv分子；或
(b)所述抗原结合多肽为scFv HSA融合分子；或
(c)所述抗原结合多肽为Fab HSA融合分子。
19.如权利要求18所述的抗原结合多肽，其中：
(a)权利要求18(a)所述的scFv分子包含具有选自以下的化学式的多肽：(i)NH2-L-VH-X-VK-COOH和(ii)NH2-L-VK-X-VH-COOH；其中，L为前导序列；VH为所述人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；VK为人源化抗体轻链可变区；
(b)权利要求18(b)所述的scFv HSA融合分子的scFv部分在HSA的N-末端表达，并且所述scFv HSA融合分子多肽具有选自以下的化学式：
(i)NH2-L-VH-X-VK-HSA-COOH和(ii)NH2-L-VK-X-VH-HSA-COOH，其中，L为前导序列；VH为所述人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；HSA为人血清白蛋白；VK为所述人源化抗体轻链可变区；
(c)权利要求18(b)所述的scFv HSA融合分子的scFv部分在HSA的C-末端表达，并且所述scFv HSA融合分子多肽具有选自以下的化学式：
(i)NH2-HSA-VH-X-VK-COOH和(ii)NH2-HSA-VK-X-VH-COOH，其中，L为前导序列；VH为所述人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；HSA为人血清白蛋白；VK为所述人源化抗体轻链可变区；
(d)权利要求18(c)所述的抗原结合多肽，其中，所述Fab HSA融合分子的重链部分在HSA的N末端或C末端表达，并且所述Fab HSA融合分子多肽具有选自以下的化学式：(i)NH2-VH-CH1-HSA-COOH和(ii)NH2-HSA-VH-CH1-COOH，其中，VH为所述人源化抗体重链可变区；CH1为所述恒定的重链结构域1；HSA为人血清白蛋白；或
(e)权利要求18(c)所述的抗原结合多肽，其中，所述Fab HSA融合分子的轻链部分在HSA的N末端或C末端表达，并且所述Fab HSA融合分子多肽具有选自以下的化学式：(i)NH2-VK-CK-HSA-COOH和(ii)NH2-HSA-VK-CK-COOH，其中，VK为所述人源化抗体轻链可变区；CK为所述轻链恒定结构域；HSA为人血清白蛋白。
20.如权利要求1至19任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽与治疗剂或诊断剂联合。
21.如权利要求20所述的抗原结合多肽，其中：
(a)所述治疗剂选自细胞毒性剂、放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂及其组合；或
(b)所述诊断剂选自放射性标记物、光敏诊断剂、超声增强剂和非放射性标记物。
22.如权利要求1至21任一项所述的抗原结合多肽，其中：
(a)所述多肽为LIGHT的拮抗剂；或
(b)所述多肽不是LIGHT的激动剂。
23.如权利要求1至22任一项所述的抗原结合多肽，其中，所述多肽与LIGHT结合的Kd优选为约108M-1至约1010M-1。
24.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1至23任一项所述的抗原结合多肽和载体。
25.如权利要求24所述的药物组合物，所述组合物进一步包含额外的治疗剂或诊断剂。
26.一种治疗或诊断疾病或病症的方法，所述方法包括将权利要求24或25所述的药物组合物给药于有此需要的患者，其中，所述疾病或病症选自：炎症性疾病或病症、免疫性疾病或病症、恶性疾病或病症、自身免疫疾病；炎症性肠病(IBD)；慢性阻塞性肺病(COPD)；关节炎；类风湿关节炎；多发性硬化症；移植排斥；移植物抗宿主病(GVHD)；中枢神经系统损伤；Th1介导的肠病；克罗恩病；银屑病；白血病；淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病；动脉粥样硬化；肺癌；结肠癌；和肝炎。
27.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1至23任一项所述的抗原结合多肽。
28.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含启动子序列，所述启动子序列可操作地连接于权利要求27所述的多核苷酸。
29.一种分离的细胞，所述细胞用权利要求27或28所述的多核苷酸转化。
30.一种制备由权利要求27或28所述的多核苷酸编码的抗原结合多肽的方法，所述方法包括：
a)培养由所述多核苷酸转化的细胞，从而表达编码的抗原结合多肽；以及
b)回收由此表达的抗原结合多肽。
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