CN102426180A - 一种检测血糖的电化学酶传感器装置及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测血糖的电化学酶传感器装置及其制备方法，该装置由四电极体系组成，网状玻璃碳(Reticulated VitreousCardon，RVC)电极作为第一工作电极，金电极为第二工作电极，玻碳电极为对电极，银/氯化银为参比电极。本发明以RVC材料作为第一工作电极，利用其高电解性能，将血糖中多种电活性干扰物质电解，有效避免它们对葡萄糖电化学传感器干扰。这种葡萄糖传感器稳定性好，检测速度快检测限低，且受氧及血液中有机和无机物的干扰少。特别是本发明与现有的葡萄糖传感器相比，具有更低的检测极限，成本低廉，操作简单。

Description

一种检测血糖的电化学酶传感器装置及其制备方法

技术领域

本发明为一种电化学酶传感器装置，具体涉及一种能消除电活性物质干扰的检测血糖的电化学酶传感器装置，本发明还涉及该的检测血糖的电化学酶传感器装置的制备方法。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的重大疾病，其病因是由于胰岛素的缺乏或高血糖引起的。诊断和控制糖尿病的有效方法是实时、可靠检测血糖的浓度。自从Clark和Lyons首次提出葡萄糖酶电极概念以来，人们针对酶电极展开了广泛的研究。最早的葡萄糖传感器主要是检测酶催化反应所产生的H₂O₂，通过检测释放的H₂O₂在阳极发生的电化学反应产生的电流信号对血糖进行检测。这类传感器主要受溶液中溶解氧浓度的影响。同时由于H₂O₂的氧化需要在较高的电位下氧化，受许多电活性物质的干扰。而后，人们开发了以介体为基础的第二代葡萄糖生物传感器。由于引入二茂铁衍生物、铁氰化物等具有良好电化学性质的电子传递介体，传感器具有较好的化学稳定性，因而得到了广泛的应用。但由于介体的氧化电位较高，血液中的一些电活性物质如抗坏血酸(AA)，尿酸(UA)和对乙酰基氨酚(ACP)等易在高电位下氧化，对检测结果产生干扰。通常的方法是在酶电极表面修饰一层选择性渗透膜，这种渗透膜能根据检测物与干扰物在粒径、电荷和极性等的区别，选择性地消除电活性物质的干扰。例如：UA和AA带负电荷，常选择Nafion阳离子交换膜来消除它们的影响。但由于选择性渗透膜在排除干扰物质的同时，葡萄糖的扩散也受到影响；且在检测实际样品时，常常需要采用多种高分子膜组合才能完全排除干扰，使得电极的制备很繁复。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能有效消除血糖中电活性物质的干扰，且稳定性好，成本低，检测极限低的检测血糖的电化学酶传感器装置。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供该检测血糖的电化学酶传感器装置的制备方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供的检测血糖的电化学酶传感器装置，由四电极体系组成，由网状玻璃碳(RVC)电极作为第一工作电极，金电极为第二工作电极，玻碳电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，所述的网状玻璃碳电极通过铂丝与电化学工作站联接，所述的金电极的表面组装有11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/葡萄糖氧化酶的混单分子膜作为酶电极。

在制备RVC电极时，将RVC泡沫材料压缩为原体积的1/10后作为电极材料，以减少RVC电极的死体积，然后置入聚四氟乙烯圆筒中。两节聚四氟乙烯圆筒用O型环密封，用螺杆固定，以方便RVC材料的更换和冲洗。RVC电极通过铂丝与电化学工作站联接。

为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的检测血糖的电化学酶传感器装置的方法，包括金电极(2)的制备，金电极表面组装11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇(FcC₁₁SH)/葡萄糖氧化酶(GOD)的混单分子膜作为酶电极，具体通过以下步骤来完成：

(1)FcC₁₁SH/巯基丙酸(MPA)的组装：将金电极打磨干净，二次水冲洗，并用氮气吹干。然后将电极浸泡在60μL含有0.83mmol·L^-1FcC₁₁SH和4.mmol·L^-1MPA的DMSO中1h，然后转移到含有2.5mmol·L^-1MPA中的DMSO溶液中调整FcC₁₁SH在电极表面的比例为7-15％，用乙醇和二次水清洗，防止MPA的非特异性吸附；

(2)FcC₁₁SH/GOD在金电极表面的组装：将含7-15％FcC₁₁SH的Fc-C₁₁SH/MPA电极浸泡在含有75mmol·L^-11-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和15mmol·L^-1N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的磷酸缓冲溶液(PBS)中，反应0.5h后；二次水清洗电极，氮气吹干后，将电极浸泡在2mg·L^-1GOD的PBS缓冲溶液(pH 5.5)中反应12h，用PBS溶液清洗，置于PBS的缓冲溶液(pH 7.40)中，室温保存。

上述的FcC₁₁SH/GOD电极在葡萄糖浓度为0.05-40.0mmol·L^-1范围内具有良好的线性关系，检测极限为3.6μmol·L^-1。由于正常人的血糖浓度为3.5-6.1mmol·L^-1，且该装置所需样品的最小体积仅为20μL，因此，在测定实际样品时可以通过稀释的方法，减少血液样品的用量。

网状玻璃碳(RVC)，是一种由玻璃态碳泡沫组成的三维网状(蜂窝状)微孔材料。该材料微孔密度为100ppi(即150个微孔/cm²)，孔隙率为70％。具有良好的化学稳定性和导电率，较大的孔比表面积，对流体的流动阻力小等特点。网状玻璃碳(RVC)具有较低的电阻，高电流密度和高机械强度；同时还具有很高的孔比表面积，因此已广泛应用于流动电解体系中。本发明利用多孔、高比表面积的RVC电极作为第一工作电极，使血样中的电活性物质在流经RVC电极时完全被电解，同时联用薄层流动池作为酶电化学传感器检测葡萄糖，从而实现在线实时检测血液中的葡萄糖浓度。

本发明涉及的检测血糖的电化学传感器装置，由于RVC电极具有较高的电解性能，能够将电活性物质在进入下游酶电极之前完全电解，因而在下游电极上没有电化学信号，而葡萄糖为非电活性物质，不会在RVC中受到影响。进入下游电极的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下催化氧化，而介体二茂铁将电子转移到电极表面，实现信号的放大。技术的关键是通过RVC电极对电活性物质的氧化作用，消除其对葡萄糖检测的干扰。

本发明涉及的装置能有效的消除电活性物质的干扰。RVC电极具有良好的电解性能，低的电阻，高的化学稳定性，高的比表面积等特点，采用压缩的RVC材料作为第一工作电极，当血清样品流经电极时，通过调整RVC的电位和样品的流速，在样品进入下游金电极之前，RVC将具有电活性的物质完全电解，从而避免这些物质在下游电极上对葡萄糖电化学检测产生的干扰；另一方面，由于葡萄糖为非电活性物质，在流经RVC电极时不发生变化，在流经下游FcC₁₁SH/GOD酶电极时，在GOD的催化作用下氧化，电子通过介体FcC₁₁SH转移到电极表面，FcC₁₁SH/GOD酶电极所产生的信号为GOD催化葡萄糖氧化的电流，通过检测其电流实现对血液样品中葡萄糖的定量检测。

本发明在使用前分别用二次水和PBS缓冲溶液(pH 7.4)冲洗10min。测试完后，传感装置保存在PBS缓冲溶液(pH 7.4)中。

综上所述，本发明涉及的检测血糖的电化学酶传感器装置具有操作方便，化学稳定性好，使用安全，电极可以重复利用等特点；特别是能有效去除电活性等物质和氧的干扰，实现对血液中葡萄糖的有效准确、灵敏检测。

附图说明

图1是本发明设计的检测血糖的电化学酶传感器装置的俯视图；

图2是样品流速与电解效率关系图，图中：RVC电极电位为0.8V，金电极电位为0.5V；

图3是葡萄糖与不同干扰物混合溶液在FcC₁₁SH/GOD酶电极的电化学响应图，图中：葡萄糖与不同干扰物混合溶液在FcC₁₁SH/GOD酶电极的电化学响应图(1含5.0mmol·L^-1葡萄糖的PBS溶液；2含5.0mmol·L^-1葡萄糖和0.1mmol·L^-1乙酰基氨酚的PBS缓冲溶液；3含5.0mmol·L^-1葡萄糖，0.1mmol·L^-1抗坏血酸，0.5mmol·L^-1尿酸，0.1mmol·L^-1乙酰基氨酚的PBS缓冲溶液。流速为0.1mL·min^-1，RVC电极电位为0.8V，FcC₁₁SH/GOD酶电极电位为0.5V；

图4是不同的葡萄糖浓度与FcC₁₁SH/GOD酶电极电流响应的相关性，图中：不同的葡萄糖浓度(0.05，0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0，20.0，30.0和40.0mmol·L^-1)与FcC₁₁SH/GOD酶电极电流响应的相关性。流速为0.1mL·min^-1，RVC电极电位为0.8V，FcC₁₁SH/GOD酶电极电位为0.5V；

图5是检测实际样品中血糖在FcC₁₁SH/GOD酶电极的电化学响应信号图，图中：检测实际样品中血糖的电化学响应信号，实线表示FcC₁₁SH/GOD酶电极的响应电流，虚线表示金电极的响应电流。流速为0.1mL·min^-1，RVC电极电位为0.8V，金电极电位或FcC₁₁SH/GOD酶电极电位为0.5V。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

参见图1，一种检测血糖的电化学酶传感器装置，由网状玻璃碳电极1作为第一工作电极，金电极2为第二工作电极，玻碳电极3为对电极，银/氯化银电极4为参比电极，网状玻璃碳电极通过铂丝5与电化学工作站联接，金电极2的表面组装有11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/葡萄糖氧化酶的混单分子膜作为酶电极，网状玻璃碳电极1是由微孔密度为100ppi即150个微孔/cm²、孔隙率为70％的玻璃态碳泡沫组成的三维网状微孔材料压缩其体积到原来体积的1/10，制成直径为5.4mm、长为20mm的电极，置入直径为24mm、长为40mm的聚四氟乙烯圆柱中组成。

在制备RVC电极时，将RVC泡沫材料压缩为原体积的1/10后作为电极材料，以减少RVC电极的死体积，然后置入聚四氟乙烯圆筒中。两节聚四氟乙烯圆筒用O型环密封，用螺杆固定，以方便RVC材料的更换和冲洗。RVC电极通过铂丝与电化学工作站联接。

金电极2的表面修饰过程包含下列步骤：

(1)组装11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/巯基丙酸的混单分子膜电极：

将金电极打磨干净，二次水冲洗，并用氮气吹干；然后将电极浸泡在60μL含有0.83mmol·L^-111-二茂铁基十一烷基-1-硫醇和4.2mmol·L^-1巯基丙酸的二甲基亚砜溶液中1h，然后浸泡在含有2.5mmol·L^-1巯基丙酸中的二甲基亚砜溶液中，直至11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇在电极表面的比例为7-15％；

(2)组装11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/葡萄糖氧化酶电极：

将上述步骤(1)制作的含7-15％FcC₁₁SH的11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/巯基丙酸电极浸泡在含有75mmol·L^-1的1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺和15mmol·L^-1的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的磷酸缓冲溶液中，反应0.5h后；用二次水清洗电极，氮气吹干后，与pH值为5.5的2mg·mL^-1葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲溶液反应12h。

实施例1、电化学酶传感器装置的电解效率

准确称量0.23mg二茂铁甲酸溶于10mL的0.1mol·L^-1PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中。RVC电极的应用电位设为0.5V，金电极电位为0.3V，注射20μL的二茂铁甲酸溶液，通过调节流速，研究RVC电极的电解效率。如图2所示，当流速低于0.1mL·min^-1时，金电极上无明显的氧化电流出现，即溶液中没有电活性物质。表明在该条件下，该装置的电解效率为100％。

实施例2、葡萄糖与不同干扰物混合溶液在FcC₁₁SH/GOD酶电极电化学响应

分别采用以下三种溶液注射到该装置中，测定FcC₁₁SH/GOD酶电极响应电流。

溶液(1)包含5.0mmol·L^-1葡萄糖的0.1mol·L^-1PBS缓冲溶液，

溶液(2)包含5.0mmol·L^-1葡萄糖，0.1mmol·L^-1乙酰基氨酚的0.1mol·L^-1PBS缓冲溶液，

溶液(3)包含5.0mmol·L^-1葡萄糖，0.1mmol·L^-1抗坏血酸，0.5mmol·L^-1尿酸和0.1mmol·L^-1乙酰基氨酚的0.1mol·L^-1PBS缓冲溶液。

图3为FcC₁₁SH/GOD酶电极的响应信号。酶电极表面组装有FcC₁₁SH和GOD的混双单分子膜。采用RVC电极的电位为0.8V，FcC₁₁SH/GOD酶电极电位为0.5V，流速为0.1mL·min^-1。1为连续三次注射葡萄糖在FcC₁₁SH/GOD酶电极的响应信号。2为连续三次注射葡萄糖和乙酰基氨酚的混合溶液在FcC₁₁SH/GOD酶电极的响应信号。3连续三次注射葡萄糖，抗坏血酸，尿酸和乙酰基氨酚的混合溶液在FcC₁₁SH/GOD酶电极的响应信号。由图可以看出，2和3的响应电流与1基本上保持一致，表明抗坏血酸、尿酸、乙酰基氨酚对FcC₁₁SH/GOD酶电极没有产生任何干扰信号，其响应信号均为FcC₁₁SH/GOD酶电极催化葡萄糖的氧化电流。

实施例3、不同的葡萄糖浓度与FcC₁₁SH/GOD酶电极电流响应的相关性

首先准确称量0.198g葡萄糖溶于10mL PBS溶液(含0.1mol·L^-1KClO₄)中，浓度为100mmol·L^-1，用PBS溶液稀释，配制0.05，0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0，20.0，30.0和40.0mmol·L^-1的葡萄糖溶液。连续三次注射不同浓度的葡萄糖溶液，FcC₁₁SH和GOD的混双单分子膜电极的电流与葡萄糖浓度关系如图4所示。酶电极在葡萄糖浓度为0.05-40mmol·L^-1的范围内，FcC₁₁SH/GOD酶电极的电流响应与葡萄糖浓度成线性关系。

实施例4、实际样品中血糖在FcC₁₁SH/GOD酶电极的电化学响应信号

将采集的1mL静脉血液置含有10μL肝素钠的试管中，混合后，在转速为3500rpm下离心10min，得到淡黄色上清液即血浆。取100μL的血浆样品，用含100mmol·L^-1KClO₄的0.2mol·L^-1PBS缓冲溶液稀释一倍。测试血浆样品，当RVC的电位设为0.8V，下游金电极的电化学信号基本上与基线保持平衡(图5虚线所示)，当金电极组装FcC₁₁SH和GOD的混双单分子膜，FcC₁₁SH/GOD酶电极表面出现明显的电流响应信号(图5实线所示)。通过计算，血液中葡萄糖的浓度为4.49±0.11mmol·L^-1。测试不同的样品，测定的结果和医院测定值比较如表1所示。电化学测定的结果与医院测定结果一致。

表1葡萄糖浓度在不同人血浆样品中的浓度

Claims (3)

1.一种检测血糖的电化学酶传感器装置，其特征是：由网状玻璃碳电极(1)作为第一工作电极，金电极(2)为第二工作电极，玻碳电极(3)为对电极，银/氯化银电极(4)为参比电极，所述的网状玻璃碳电极通过铂丝(5)与电化学工作站联接，所述的金电极(2)的表面组装有11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/葡萄糖氧化酶的混单分子膜作为酶电极。

2.根据权利要求1检测血糖的电化学酶传感器装置，其特征是：所述的网状玻璃碳电极(1)是由微孔密度为100ppi即150个微孔/cm²、孔隙率为70％的玻璃态碳泡沫组成的三维网状微孔材料压缩其体积到原来体积的1/10，制成直径为5.4mm、长为20mm的电极，置入直径为24mm、长为40mm的聚四氟乙烯圆柱中组成。

3.制备权利要求1所述的检测血糖的电化学酶传感器装置的方法，包括金电极(2)的制备，其特征是：所述的金电极(2)的表面修饰过程包含下列步骤：

(1)组装11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/巯基丙酸的混单分子膜电极：

将金电极打磨干净，二次水冲洗，并用氮气吹干；然后将电极浸泡在60μL含有0.83mmol·L^-111-二茂铁基十一烷基-1-硫醇和4.2mmol·L^-1巯基丙酸的二甲基亚砜溶液中1h，然后浸泡在含有2.5mmol·L^-1巯基丙酸中的二甲基亚砜溶液中，直至11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇在电极表面的比例为7-15％；

(2)组装11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/葡萄糖氧化酶电极：

将上述步骤(1)制作的含7-15％FcC₁₁SH的11-二茂铁基十一烷基-1-硫醇/巯基丙酸电极浸泡在含有75mmol·L^-1的1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺和15mmol·L^-1的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的磷酸缓冲溶液中，反应0.5h后；用二次水清洗电极，氮气吹干后，与pH值为5.5的2mg·mL^-1葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲溶液反应12h。

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