CN102399306B - 一种肝素衍生的多糖混合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝素衍生的多糖混合物的制备方法。该制备方法包括步骤：提供一溶于惰性介质中的肝素季铵盐的溶液；向所述溶液分批加入氢氧化季铵碱进行降解反应；分离或纯化出重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素。本发明还提供了通过本发明方法制备的肝素衍生的多糖混合物。本发明方法可简便、高效和稳定地制备低分子量肝素。

Description

一种肝素衍生的多糖混合物的制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地，涉及肝素衍生的多糖混合物的制备方法。

背景技术

肝素是动物来源(猪或牛)的硫酸多糖混合物，由于它们具有良好的抗血栓形成性质，因而得到了广泛应用，例如制备抗血栓形成药物、治疗心血管疾病的药物、和治疗脑血管疾病的药物等。

然而，肝素有许多缺陷，这些缺陷限制肝素的应用。一个主要缺陷是肝素用药过多可致自发性出血，故每次注射前应测定凝血时间。此外，肝素还可引起过敏反应、血小板减少、骨质疏松和自发性骨折。

肝素自发性出血危险很大，临床使用中必须监测凝血时间，这给医生和患者均带来很大不便。同时，血小板减少和骨质疏松等不良反应也让医生在使用中有所顾忌。低分子肝素使用过程中无须监测凝血时间，并且大大降低了肝素长期使用产生的上述不良反应。目前，上市的低分子肝素有依诺肝素钠、达肝素钠、帕肝素钠、亭扎肝素钠及贝米肝素钠等，而贝米肝素钠更以其高效低毒的特点，被称为第二代低分子肝素。

贝米肝素钠是由西班牙LaboratoriosFarmaceuticosRovi公司开发，其重均分子量为3000～4200道尔顿，分子量小于2000道尔顿的含量不高于35％，分子量为2000～6000道尔顿的含量为50％～75％，分子量大于6000道尔顿的含量不高于15％。

有文献报道，通过用苄基三甲基氢氧化铵对肝素苄乙氧铵盐进行降解而制备贝米肝素钠。然而，其制备方法存在以下缺陷：工艺繁锁，需要多个分离步骤，和/或得率低。

因此，本领域迫切需要开发高效的、操作简便的制备低分子量肝素的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的、操作简便的制备低分子量肝素的方法以及用该方法制备的高纯度肝素衍生的多糖混合物的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种制备低分子量肝素的方法，所述方法包括：

(a)提供一溶于惰性介质中的肝素季铵盐的溶液；

(b)向所述溶液分批加入氢氧化季铵碱进行降解反应，形成重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素，其中在各分批加入之间不包括分离肝素的步骤，并且步骤(b)的总时间为48-240小时；和

(c)从步骤(b)所述的溶液中分离或纯化出所述的重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素。

在另一优选例中，所述肝素季铵盐是肝素苄乙氧铵盐。

在另一优选例中，所述氢氧化季铵碱包括苄基三甲基氢氧化铵。

在另一优选例中，在步骤(b)中，将反应温度维持在10～80℃，较佳地20～60℃，更佳地25～50℃。

在另一优选例中，步骤(b)的总时间为60-180小时，更佳地为80-160小时。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的肝素季铵盐与氢氧化季铵碱的总投料的重量比为1.2∶1～6∶1，较佳地1.8∶1～4∶1，更佳地2∶1～3∶1。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述肝素苄乙氧铵盐与苄基三甲基氢氧化铵的投料重量比为1.2∶1～6∶1，较佳地1.8∶1～4∶1，更佳地2∶1～3∶1。

在另一优选例中，氢氧化季铵碱分2～8次加入，更佳地为分3～6次加入。

在另一优选例中，当步骤(b)中将反应温度维持在≤35℃时，氢氧化季铵碱分4-8次加入；当步骤(b)中将反应温度维持在＞35℃时，氢氧化季铵碱分3-6次加入。

在另一优选例中，各分批加入氢氧化季铵碱的量基本相同，即各分批加入量为0.25F-2F(较佳地为0.5F-1.5F)之间，其中F＝T/n，式中F为氢氧化季铵碱的平均加入量，T为氢氧化季铵碱的总加料量，n为分批次数。

在另一优选例中，在步骤(b)中，氢氧化季铵碱(较佳地为苄基三甲基氢氧化铵)分批加入的时间间隔为8～48小时，较佳地为分12～40小时，更佳地为分18～32小时。

在另一优选例中，所述的低分子量肝素是贝米肝素钠。

在另一优选例中，所述的低分子量肝素是具有下述特性的贝米肝素钠：

分子量低于2000道尔顿的含量低于总重量的35％；

分子量位于2000-6000道尔顿的含量为总重量的50％-75％；

分子量高于6000道尔顿的含量低于总重量的15％；

在另一优选例中，所述的低分子量肝素的抗凝血因子Xa与抗凝血因子IIa的活性比值为6-10(较佳地约为7-9，最佳地7.5-8.5)。

在本发明的第二方面，提供了一种低分子量肝素，所述的低分子量肝素是具有下述特性的贝米肝素钠：

重均分子量为3000-4200道尔顿；

分子量低于2000道尔顿的含量低于总重量的35％；

分子量位于2000-6000道尔顿的含量为总重量的50％-75％；

分子量高于6000道尔顿的含量低于总重量的15％；

抗凝血因子Xa与抗凝血因子IIa的活性比值为6-10；

并且所述的低分子肝素是用本发明第一方面中所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进肝素衍生多糖混合物的制备方法，意外地发现，在同一体系中通过分批添加氢氧化季铵碱进行降解反应，可以高效、简便、稳定地制备重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素，并且在各分批加入之间不必包括分离肝素的步骤。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“本发明的混合物”和“本发明的肝素衍生的多糖混合物”可互换使用。而术语“肝素”是指分子量范围2000～30000道尔顿的多糖。

制备方法

本发明提供了一种肝素衍生的多糖混合物的制备方法，包括步骤：

(a)提供一溶于惰性介质中的肝素季铵盐的溶液；

(b)在合适的降解反应温度下，分批加入季铵碱，使得肝素季铵盐在季铵碱作用下被降解，从而形成降解的肝素衍生的多糖；和

(c)从反应体系中分离或纯化出本发明所述的肝素衍生的多糖混合物。

该方法的一个主要特点是在同一反应体系中进行反应，因此各批次之间不包括分离肝素衍生多糖的步骤。

适用于本发明的惰性溶剂没有特别限制，较佳地是非羟基化惰性溶剂，代表性例子包括(但并不限于)：指二氯甲烷、甲酰胺、二甲基甲酰胺或其它非羟基极性溶剂，优选二氯甲烷。

在另一优选例中，所述的肝素季铵盐优先选用长链铵如三氯、双氯甲铵盐及联苯胺等，更佳地为肝素苄乙氧铵盐。

在另一优选例中，所述的季铵碱优选以苄基三甲基氢氧化铵的溶液形式加入，如溶于甲醇、乙醇或异丙醇等溶剂或醇/水混合溶剂所形成的溶液(浓度通常为20-60％(w/v))，如苄基三甲基氢氧化铵甲醇溶液(如25％、40％或50％浓度等，w/v)。

在步骤(c)中，可以通过本领域常规的已知方法分离纯化，代表性的方法包括(但并不限于)：醇沉、活性炭吸附、凝胶过滤和超滤等，从而分离获得符合要求的肝素衍生的多糖混合物。

在另一优选例中，在步骤(c)中还可包括对制得的所述的肝素衍生的多糖混合物用硼氢化钠或过氧化氢进行除杂质及脱色处理。

在本发明的一个优选例中，所述的制备方法包括步骤：

1、在惰性溶剂(如二氯甲烷)中，分批次加入季铵碱(如苄基三甲基氢氧化铵)，对肝素季铵盐(如肝素苄乙氧铵盐)进行降解。

其中，降解反应的温度和时间没有特别限制，通常反应温度可以为10～80℃；反应时间通常为2～10天。

2、对于制得的肝素衍生多糖，可以用常规方法进行分离和纯化，如醇沉、活性炭吸附、凝胶过滤和超滤等，并可通过硼氢化钠或双氧水除去杂质及脱色。

肝素衍生的多糖混合物

本发明还提供了用本发明的方法制备的肝素衍生的多糖混合物(也称为低分子量肝素)。通过本方法制备的低分子肝素，具有如下特征：

重均分子量为3000～4200道尔顿，特征值约为3600道尔顿；分子量低于2000道尔顿的含量低于35％，分子量在2000-6000道尔顿的含量为50％-75％，分子量高于6000道尔顿的含量低于15％；和

抗凝血因子Xa与抗凝血因子IIa的活性比值为6-10，较佳地为7-9，最佳地7.5-8.5。

此外，在本发明的肝素衍生的多糖混合物的构成多糖中，在其一端具有不饱和的4，5-葡萄糖醛酸2-O-硫酸酯结构单元。

这些多糖混合物可以呈碱金属盐或碱土金属盐形式，其中，优选钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。一种常用方法是对形成的低分子量肝素的钠盐进行盐置换处理。例如，用氯化钙处理可获得所需低分子量肝素钙盐。

药物组合物和施用方法

本发明的肝素衍生的多糖混合物可以用作抗血栓形成剂，预防静脉血栓栓塞性疾病(预防静脉内血栓形成)，特别是与骨科或普外手术有关的血栓形成。治疗已形成的深静脉栓塞，伴或不伴有肺栓塞。治疗不稳定心绞痛及非Q波心梗，用于血液透析体外循环中，防止血栓形成。

此外，本发明的肝素衍生的多糖混合物还可用于治疗或辅助治疗心血管疾病和脑血管疾病。

因此，本发明还提供一种药物组合物，它含有作为活性组分的本发明的肝素衍生的多糖混合物和药学上可接受的载体。通常，在药物组合物中，本发明的肝素衍生的多糖混合物的含量为0.01-50wt％，更佳地为0.1-30wt％。一种优选的药物组合物剂型为注射剂(包括溶液和冻干剂)。

本发明的药物组合物可用常规方法制备和施用。一种优选的施用方法是皮下或静脉内给药。

本发明的主要优点在于：

(a)制备方法在同一反应体系中进行，省略了多个分离步骤，操作简单；

(b)收率高；

(c)制备工艺的稳定性高；

(d)制得的低分子量肝素(如贝米肝素钠)不仅纯度高，而且完全符合质量标准。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如《欧洲药典》或《美国药典》中所述的条件)，或按照制造厂商所建议的条件。

通用测定方法

分子量与分子量分布以及抗凝血因子Xa和抗凝血因子IIa效价均采用欧洲药典或美国药典中常规的低分子肝素质量标准中所述的方法进行。

实施例1

肝素苄乙氧铵盐(原料)的制备

向苄索氯铵(250g)的水溶液(1250ml)中，加入含市售的肝素钠(100g)的水(1000ml)溶液。搅拌下放置30分钟，形成肝素苄乙氧铵盐沉淀。然后，将反应混合物在室温下过滤，获得滤饼，用水洗涤后真空干燥，获得肝素苄乙氧铵盐295克(白色)。

实施例2

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，并加热至20℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液9.6ml，加入方法为分6次加入，每次加入1.6ml，分批时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为144小时。

向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.9g)。

2、纯化

用常规方法进行纯化，方法如下：

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积3倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.6g)。以肝素钠计算，收率为76.7％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

	测量值	标准
			重均分子量(道尔顿)	3,618	3000-4200
分子量大于6000道尔顿的组分含量	12％	＜15％
			分子量小于2000道尔顿的组分含量	30％	＜35％
分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	58％	50-75％
			抗凝血因子Xa活性(IU/毫克)	101.3	80-120
抗凝血因子IIa活性(IU/毫克)	13.2
			抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	7.7	约等于8

采用本发明制备方法制备的多糖混合物，完全符合上市贝米肝素钠的质量要求。同时，该制备方法得率高，无须繁琐的后续处理步骤，有利于降低成本和能耗，大大增强了产品的竞争力。

实施例3

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，并加热至25℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液9.0ml，加入方法为分5次加入，依次加入1.8ml、1.2ml、2.8ml、1.4ml、1.8ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为120小时。

向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.8g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.5g)。以肝素钠计算，收率为73.7％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,671道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	13％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	25％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	62％
抗凝血因子Xa活性	116.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	14.8IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	7.9

实施例4

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至30℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液8.0ml，加入方法为分5次加入，每次加入1.6ml，时间间隔为20小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应20小时，故总反应时间为100小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.7g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.4g)。以肝素钠计算，收率为70.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,550道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量(Y)	11％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	33％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	56％
抗凝血因子Xa活性	99.3IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	12.1IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	8.2

实施例5

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至35℃并维持此反应温度。向此溶液中加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶7.2ml，加入方法为分4次加入，每次加入1.8ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为96小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.7g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.2。将硼氢化钠(按25g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置24个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.4g)。以肝素钠计算，收率为70.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,610道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	12％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	30％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分/含量	58％
抗凝血因子Xa活性	110.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	13.8IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	8.0

经核磁测定，在所述混合物中的构成多糖中，在其一端具有不饱和的4，5-葡糖醛酸2-O-硫酸酯结构单元。

实施例6

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至35℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶7.6ml，加入方法为分4次加入，每次加入1.9ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为96小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.9g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.2。将硼氢化钠(按25g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置24个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达5％，然后加入溶液体积3倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.5g)。以肝素钠计算，收率为73.7％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,530道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	11％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	33％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	56％
抗凝血因子Xa活性	92.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	10.9IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	8.5

经核磁测定，在所述混合物中的构成多糖中，在其一端具有不饱和的4，5-葡糖醛酸2-O-硫酸酯结构单元。

实施例7

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至35℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶6.8ml，加入方法为分4次加入，每次加入1.7ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为96小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.7g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.2。将硼氢化钠(按25g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置24个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积5倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.4g)。以肝素钠计算，收率为70.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,680道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	14％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	25％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	61％
抗凝血因子Xa活性	118.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	15.3IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	7.7

实施例8

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至40℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶6.4ml，加入方法为分4次加入，每次加入1.6ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为96小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.7g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.2。将硼氢化钠(按25g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置24个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.4g)。以肝素钠计算，收率为70.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,610道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	11％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	29％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	60％
抗凝血因子Xa活性	109.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	13.8IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	7.9

此外，在所述多糖混合物中未检测到甲醇和二氯甲烷的残留，表明该多糖混合物的安全性好。

实施例9

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，并加热至50℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液4.8ml，加入方法为分3次加入，每次加入1.6ml，时间间隔为24小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后，再反应24小时，故总反应时间为72小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入70ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.6g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至9～10。加入230微升33％过氧化氢溶液到该溶液中，搅拌2小时，然后用1M盐酸将pH调节至7.0。静置30分钟，加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积3倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.3g)。以肝素钠计算，收率为67.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,565道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	11％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	27％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	62％
抗凝血因子Xa活性	101.5IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	12.8IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	7.9

实施例10

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至30℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液8.0ml，加入方法为分5次加入，每次加入1.6ml，第一次加入后开始计时，分别于第12小时、36小时、72小时、96小时各加入一次，从而使肝素逐渐降解。最后一次加入24小时后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.7g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积3倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.4g)。以肝素钠计算，收率为70.8％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	3,620道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	12％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	27％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	61％
抗凝血因子Xa活性	108.3IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	13.2IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	8.2

实施例2-10汇总于下表，结果表明，本发明方法制备的肝素衍生的多糖混合物均具有如下特征：

重均分子量为3000～4200道尔顿，特征值约为3600道尔顿；

分子量低于2000道尔顿的含量低于35％；

分子量在2000-6000道尔顿的含量为50％-75％；

分子量高于6000道尔顿的含量低于15％；

均符合贝米肝素钠的质量特征。此外，该肝素衍生的多糖混合物中的杂质(如苄基三甲基氯化铵)含量均低于0.05％。

对比例1

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至30℃并维持此反应温度。向此溶液中一次性加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液1.6ml，反应144小时，从而使肝素降解。然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，3.1g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.8g)。以肝素钠计算，收率为82.6％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

	测量值	标准
			重均分子量	8,580道尔顿	3000-4200
分子量大于6000道尔顿的组分含量	61％	＜15％
			分子量小于2000道尔顿的组分含量	9％	＜35％
分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	30％	50-75％
			抗凝血因子Xa活性	139.3IU/毫克	80-120
抗凝血因子IIa活性	92.1IU/毫克
			抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	1.5	约等于8

对比例2

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至30℃并维持此反应温度。向此溶液中共加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液3.2ml，加入方法为分2次加入，每次加入1.6ml，时间间隔为18小时，从而使肝素逐渐降解。其中最后一次加入后再反应18小时，故总反应时间为36小时。

然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，3.0g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.8g)。以肝素钠计算，收率为82.6％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	7,120道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	52％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	12％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	36％
抗凝血因子Xa活性	131.9IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	72.8IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	1.8

对比例3

肝素衍生的多糖混合物的制备

1、肝素衍生的多糖混合物

将实施例1得到的肝素苄乙氧铵盐(10g)溶于二氯甲烷(50ml)中，加热至30℃并维持此反应温度。向此溶液中一次性加入苄基三甲基氢氧化铵(40％，w/v)甲醇溶液8ml，反应144小时，从而使肝素降解。然后将反应混合物冷却至约20℃，向反应混合物中加入60ml的10％醋酸钠甲醇溶液，并搅拌，析出沉淀，过滤获得滤饼，甲醇洗涤后，真空干燥，获得肝素衍生的多糖混合物(浅黄色，2.9g)。

2、纯化

将上一步骤制备的肝素衍生的多糖混合物溶于水中，形成浓度约3％～5％的水溶液。用1MNaOH调节pH至8.4±0.1。将硼氢化钠(按50g/kg肝素衍生的多糖混合物计)加入到该溶液中，静置1个小时，然后用3M盐酸将pH调节至3.5-4.0以消除过多的硼氢化物。静置30分钟，并用2MNaOH调节pH至7.0。加入氯化钠，使溶液中盐浓度达10％，然后加入溶液体积4倍体积的甲醇，析出沉淀，过滤获得滤饼，用甲醇洗涤后，真空干燥，从而得到纯化的肝素衍生的多糖混合物(类白色，2.7g)。以肝素钠计算，收率为79.6％。

经测定，所述的肝素衍生的多糖混合物的性质如下：

重均分子量	6,750道尔顿
		分子量大于6000道尔顿的组分含量	41％
分子量小于2000道尔顿的组分含量	18％
		分子量介于2000～6000道尔顿的组分含量	41％
抗凝血因子Xa活性	121.3IU/毫克
		抗凝血因子IIa活性	57.7IU/毫克
抗凝血因子Xa活性/抗凝血因子IIa活性比	2.1

对比例1、2、3与实施例4相比，说明在相同温度下，加碱量减少、反应时间缩短或一次性加碱方式等，均不能获得满意的降解效果，即不能制备符合要求的低分子量肝素多糖混合物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种制备低分子量肝素的方法，其特征在于，该方法包括步骤:

(a)提供一溶于惰性介质中的肝素季铵盐的溶液；

(b)向所述溶液分批加入氢氧化季铵碱进行降解反应，形成重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素，其中在各分批加入之间不包括分离肝素的步骤，并且步骤(b)的总时间为48-240小时；和

(c)从步骤(b)所述的溶液中分离或纯化出所述的重均分子量为3000-4200道尔顿的低分子量肝素，其中所述的低分子量肝素的抗凝血因子Xa与抗凝血因子IIa的活性比值为6-10。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝素季铵盐是肝素苄乙氧铵盐。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氢氧化季铵碱包括苄基三甲基氢氧化铵。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，将反应温度维持在10～80℃。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，将反应温度维持在20～60℃。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，将反应温度维持在25～50℃。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的肝素季铵盐与氢氧化季铵碱的总投料的重量比为1.2:1～6:1。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的肝素季铵盐与氢氧化季铵碱的总投料的重量比为1.8:1～4:1。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的肝素季铵盐与氢氧化季铵碱的总投料的重量比为2:1～3:1。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，氢氧化季铵碱分2～8次加入。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，氢氧化季铵碱分3～6次加入。

12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，氢氧化季铵碱分批加入的时间间隔为8～48小时。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，氢氧化季铵碱分批加入的时间间隔为12～40小时。

14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，氢氧化季铵碱分批加入的时间间隔为18～32小时。

15.如权利要求12-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氢氧化季铵碱为苄基三甲基氢氧化铵。

16.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的低分子量肝素是贝米肝素钠。

17.如权利要求1所述的制备方法，所述的低分子量肝素是具有下述特性的贝米肝素钠：

分子量低于2000道尔顿的含量低于总重量的35％；

分子量位于2000-6000道尔顿的含量为总重量的50％-75％；

分子量高于6000道尔顿的含量低于总重量的15％。

18.一种低分子量肝素，其特征在于，所述的低分子量肝素是具有下述特性的贝米肝素钠：

重均分子量为3000-4200道尔顿；

分子量低于2000道尔顿的含量低于总重量的35％；

分子量位于2000-6000道尔顿的含量为总重量的50％-75％；

分子量高于6000道尔顿的含量低于总重量的15％；

抗凝血因子Xa与抗凝血因子IIa的活性比值为6-10；

并且所述的低分子量肝素是用权利要求1所述的方法制备的。