CN102382191A - 一种新型脑肠肽激动剂分子的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型脑肠肽激动剂分子制备方法及其应用，本发明用生物信息学软件计算得出新型脑肠肽激动剂分子的合理构象，并完成了其与脑肠肽的分子对接，进一步利用PCR技术扩增了新型脑肠肽激动剂分子基因。该脑肠肽激动剂分子可作为长效药物用于2型糖尿病的治疗。

Description

一种新型脑肠肽激动剂分子的制备方法及其应用

技术领域

一种新型脑肠肽激动剂分子制备方法及其应用，属于蛋白质药物技术领域。

背景技术

在人体内，有些肽类在胃肠和神经系统双重分布，称为脑肠肽(braingutpeptide)。脑肠肽不仅在外周广泛地调节着胃肠道的各种功能，而且在中枢也参与对胃肠道生理活动的调节。

脑肠肽类蛋白质可作为药物用于治疗多种疾病，如糖尿病等。药代动力学研究表明，多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除，其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过，通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而多肽因子的半衰期短。为了达到治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。因此寻找新型长效的蛋白质/肽分子一直是药物邻域研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型脑肠肽激动剂分子，其核苷酸序列如附图1所示，简称GGH。

本发明的目的还在于提供一种GGH的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.4892，保藏日期为2011年5月24日。

本发明的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)的制备方法。

为了实现上述目的，本申请人做了如下工作。用生物信息学软件InsightII、ICMpro、Amber计算得出新型脑肠肽激动剂分子的合理构象，并完成了其与脑肠肽的分子对接，进一步利用PCR技术扩增了新型脑肠肽激动剂分子基因。首先利用DNA合成仪合成了将GLP-1的N末端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸的核苷酸序列(GLP-1_A2G)₂，然后选择(GLP-1_A2G)₂作为目标分子与人白蛋白融合表达，即采用蛋白质融合技术。利用白蛋白分子质量大的性状将药物的易致机体产生过敏的部分包裹，使药物蛋白的活性部分暴露。利用重叠PCR技术，在体外成功拼接(GLP-1_A2G)₂基因和HSA基因，得到融合基因(GLP-1_A2G)₂-HSA，简称GGH。

由于大肠杆菌表达系统的不足，本申请人还构建了毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)，使GGH可以高效表达，并实现产业上的应用。本申请人将GGH与毕赤酵母的分泌型多拷贝质粒pPIC9K连接，线性化之后通过电转到毕赤酵母KM71中，通过G418筛选，经G418抗性筛选得到能耐受3mg/mL G418重组菌12株，耐受4mg/mLG418重组菌5株，进行甲醇诱导表达，筛选得到1株表达量高的重组菌KM71(pPIC9K-GGH)，表达量为162mg/L。

此外，申请人将获得的GGH进行了一系列的小鼠实验显示了该目标蛋白的具有良好的生物活性和较长的半衰期。GGH在体外对胰岛原代细胞有较好的刺激作用，在浓度45nmoL时增殖率为35.4％，与单体的GLP-1相差不大。在糖耐量实验中，GGH可以较好的控制小鼠的血糖水平，并且在给药72h后中、高剂量组仍然有生物活性，而单体的GLP-1在给药4h后就检测不到生物活性。

附图说明

附图1GGH融合基因序列

附图2在含4mg/mLG418的MD平板上长出的菌落表达情况

附图3PCR验证pPIC9K-GGH的KM71阳性转化子

附图4GGH的Western blot鉴定

附图5GGH对胰岛细胞的增殖作用

附图6不同时间小鼠的血糖增量

附图7GGH与其他类似物药效比较

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1重组表达质粒pPIC9K-GGH的构建

本实施例中所使用的培养基配方如下：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10mmol/L，pH 7.0。需要时使用前加入100μg/mL氨苄青霉素，固体培养基添加15g/L琼脂，用于大肠杆菌培养。

SOC培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10mmol/L，氯化钾2.5mmol/L，氯化镁10mmol/L，硫酸镁20mmol/L，葡萄糖20mmol/L，pH 7.0。

YPD培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。固体培养基添加15g/L琼脂，用于酵母菌培养。

MD培养基：葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮基(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L。固体培养基添加15g/L琼脂，1mol/L山梨醇，用于毕赤酵母转化物培养。也可加入适当量的G418，用于高拷贝整合的毕赤酵母基因工程菌的筛选。

BMGY培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，100mmol/L磷酸钾pH6.0YNB 13.4g/L，生物素4×10^-5g/L，甘油10g/L。用于毕赤酵母基因工程菌的培养。

BMMY培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，100mmol/L磷酸钾pH6.0YNB 13.4g/L，生物素4×10^-5g/L，甲醇5g/L。用于毕赤酵母基因工程菌的诱导表达。

本实施例中所使用的引物具体序列如下：

PL1：5’-GAGAGGTACGTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’

PL2：5’-ACCAACATTTTCCTTCCCTACGTGTGTTCTCAACTCCA-3’

PH1：5’-TGGTT GTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’

PH2：5’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’

引物PL1、PL2用于GLP-1_A2G串联体基因的PCR；引物PH1、PH2用于HSA基因的PCR；引物PL1、PH2用于GGH的重叠PCR。

1.(GLP-1A2G)2和HSA基因的PCR扩增

(1)用购自生工生物工程(上海)有限公司的质粒DNA小量制备试剂盒提取重组质粒pBlu2SKP-(GLP-1_A2G)₂和Vector-HSA，保存于-20℃备用。

(2)以质粒pBlu2SKP-(GLP-1_A2G)₂为模板，PL1和PL2为引物，PCR扩增(GLP-1_A2G)₂基因。PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu，在0.2mL薄壁管配置如下反应体系：

加ddH₂O至总体系为50μL

加入25μL矿物油后，将反应管置于PCR仪上，当体系温度升至65℃后加入pfupolymerase 1.5个单位，进行PCR反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性10min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min；10℃保温。

(3)以质粒Vector-HSA为模板，PH1和PH2为引物，PCR扩增HSA基因。PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu，在0.2mL薄壁管配置如下反应体系：

加ddH₂O至总体系为50μL

加入25μL矿物油后，将反应管置于PCR仪上，当体系温度升至65℃后加入pfupolymerase 1.5个单位，进行PCR反应，PCR反应操作如下：

95℃预变性5min；94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸3.0min，循环30次；72℃延伸10min；10℃保温。

(4)将两PCR反应产物按1∶1混合作为模板，以PL1和PH2为引物，在体外PCR拼接(GLP-1_A2G)₂和HSA基因。PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu，在0.2mL薄壁管配置如下反应体系：

加ddH20至总体系为50μL

加入40μL矿物油后，将反应管置于PCR仪上，当体系温度升至65℃后加入pfupolymerase 1.5个单位，进行PCR反应，PCR反应操作如下：

95℃充分变性5min，65℃退火1min，72℃延伸4min，94℃变性1min。循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的PL1和PH2的引物各2.5μL，继续做30个循环。

(5)0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。

2.质粒pPIC9K-GGH的构建

(1)用购自生工生物工程(上海)有限公司的质粒DNA小量纯化试剂盒纯化经PCR拼接得到的GGH融合基因。

(2)用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切纯化的GGH基因和克隆载体pPIC9K。反应体系和反应条件如下：

在20μL反应体系中加入：

37℃反应4h后，65℃灭活20min。

(3)用购自生工生物工程(上海)有限公司的DNA片段胶回收试剂盒纯化经SnaB I和Not I双酶切的GGH基因片段和克隆载体pPIC9K片段。

(4)用T4连接酶连接HSA-CNP基因片段与质粒pPIC9K片段

在20μL反应体系中加入，

加超纯水至20μL，混匀，15℃恒温反应过夜，65℃灭酶20min

(5)将连接产物采用CaCl₂化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，于37℃培养12-16h，可见相应菌落。

3.质粒pPIC9K-GGH的鉴定

(1)随机从LB琼脂平板挑取若干个菌落，分别接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，于220r/min，37℃振荡培养12-16h。

(2)用购自生工生物工程(上海)有限公司的质粒DNA小量制备试剂盒提取重组菌中的质粒。

(3)将提取的质粒和空载体pPIC9K的进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。

(4)取其中电泳结果判断有片段插入的质粒进行限制性酶切和PCR分析。用限制性内切酶Sna B I和Not I双酶切。

(5)将酶切反应产物和PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，保存含有插入片段的阳性克隆菌。

4.表达质粒pPIC9K-GGH序列的测定

提取阳性克隆菌带有的质粒测序，测序采用T7通用引物，单向测通SnaB I位点和Not I位点之间的区域。利用序列对齐软件对测序结果进行分析。结果显示克隆得到的GGH融合基因序列与预期序列完全一致，如附图1所示。

实施例2重组表达菌株KM71(pPIC9K-GGH)的构建及筛选

1.线性化表达载体pPIC9K-GGH片段的制备

(1)用购自生工生物工程(上海)有限公司的质粒DNA小量制备试剂盒提取重组菌DH5α(pPIC9K-GGH)中的质粒。

(2)用限制性内切酶Sal I消化提取的重组表达载体pPIC9K-GGH。反应体系和反应条件如下：

在50μL反应体系中加入：

37℃反应4h，65℃灭酶20min。

(3)用购自生工生物工程(上海)有限公司的DNA片段胶回收试剂盒纯化线性化的表达载体pPIC9K-GGH片段。

(4)用分光光度计法，测定回收的pPIC9K-GGH片段浓度。

2.毕赤酵母KM71感受态细胞的制备

(1)实验前两天，将转化用的毕赤酵母KM71菌株的单菌落接种于5mL YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和。

(2)转化前一天晚上，在装有100mL YPD培养基的500mL无菌三角瓶接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈振摇培养过夜，直至细胞密度达1×10⁸细胞/mL(OD600值在1.3-1.5左右。)

(3)将培养物平均分装到两个50mL无菌、一次性使用的聚苯烯管中，5000r/min离心5min收获细胞。倒出培养液，将离心管倒置1min，以使残留的培养液流尽。每管加入8mL无菌水重悬细胞，合并到一个聚苯烯管。

(4)加入2mL 10×TE缓冲液，pH 7.5。摇动混匀，再加入2mL 10×氯化锂，旋转混匀，于30℃，50r/min摇动45min。

(5)加入0.5mL 1mol/L DTT，旋转混匀，于30℃，50r/min摇动15min。

(6)将KM71菌悬液稀释在50mL水中，5000r/min离心5min沉淀细胞。倒出上清液，将离心管倒置1min，以使残留的液体流尽。

(7)将得到的细胞沉淀洗涤2次，5000r/min离心5min沉淀细胞。依次洗涤所用溶液如下：

第一次沉淀：50mL冰冷的水；

第二次沉淀：10mL冰冷的1mol/L山梨醇；

每次重悬细胞时应用剧烈吹打沉淀，使细胞完全分散。

(8)用适量冰冷的1mol/L山梨醇重悬，使KM71菌悬液稀的最终OD₆₀₀值约为200。

(9)按每份40μL分装于无菌，冰冷的1.5mL Ep管中，直接用于转化或于-80℃保存备用。

3.毕赤酵母KM71感受态细胞的转化

(1)取1份KM71感受态细胞加入100ng(小于5μL)线性化的表达载体pPIC9K-GGH片段，混匀。

(2)将酵母和转化DNA混合物转移到冰冷的0.2cm间隙的电击池中。

(3)按一般真菌转化的设置(1.5kV、25μF、200Ω、时间常数4.2ms)，进行电击转化。

(4)电击后，立即向电击池中加入600μL冰冷的1mol/L山梨醇，用移液枪吹吸混匀，回收酵母菌液到一无菌的1.5mLEp管中。

(5)将回收的酵母菌液平均涂布于3块含1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃培养3～6天，直到平板上长出菌落。

4.重组表达菌株KM71(pPIC9K-GGH)的构建及筛选

将100ng Sal I线性化处理的重组质粒pPIC9K-GGH电击法转化毕赤酵母KM71，转化后可以通过组氨酸营养缺陷型筛选重组子，或通过G418抗性筛选重组子。重组毕赤酵母对G418抗性水平依赖于整合入酵母基因组中的kan基因拷贝数。含有单拷贝kan基因的毕赤酵母能耐受G418水平约0.25mg/mL。而对于含有多拷贝kan基因毕赤酵母，其对G418的抗性水平可以在0.5mg/mL(1-2拷贝)到4mg/mL(7-12拷贝)之间。由于含有GGH基因的表达盒和kan基因在同一个载体上，kan基因在重组毕赤酵母中的拷贝数也反映了含有GGH基因的表达盒的拷贝数。因此，可以通过G418抗性水平来筛选高拷贝整合的毕赤酵母重组子。

将转化物全部涂布于3块MD平板上，于30℃培养5天，在3块MD平板长出1007个转化子菌落，电击转化率1.007×10⁴个转化子/μg DNA。

每块平板上用2mL无菌水冲洗下菌落，收集并合并菌悬液。涂布于含有1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL G418的MD平板，于30℃，培养5天，得到能耐受3mg/mL G418重组转化子12个，耐受4mg/mLG418重组转化子5个。

毕赤酵母乙醇氧化酶基因的表达在转录水平受到调控。当毕赤酵母在含葡萄糖或甘油的培养基中生长时，乙醇氧化酶启动子受到抑制，此时乙醇氧化酶基因的转录水平很低；而当毕赤酵母只含有甲醇的培养基中生长时，这种抑制被去除，此时细胞约有5％的polyA RNA来自乙醇氧化酶基因，所表达的乙醇氧化酶高达细胞总蛋白的35％。在毕赤酵母的表达载体GGH的表达盒中含有乙醇氧化酶基因启动子，它同样也受甘油的抑制及甲醇的诱导。因此可以通过在含有甘油的培养基中进行菌的预培养，当重组毕赤酵母生长到一定浓度后，将培养基更为成含有甲醇的培养基，进行目的基因的诱导表达，以筛选表达量较高的重组毕赤酵母。

挑取含4mg/mL G418的MD平板上长出的全部菌落，分别接种到BMGY培养基中，培养至OD₆₀₀值为20左右后，离心后将培养基更换为0.2倍体积的BMMY培养基，进行诱导表达3天，SDS-PAGE分析发酵液上清中的目的蛋白GGH的表达情况，如附图2，条带1为蛋白质分子量标准，条带2～6为不同重组菌KM71(pPIC9K-GGH)的诱导培养上清。

从附图2上可以看出，不同的重组子经诱导培养后的离心上清液中，都含有分子量为73kDa左右的蛋白条带，73kDa左右的条带与理论计算不含糖基化的GGH分子量(73.2kDa)相近，初步认为是表达的目的蛋白。4号表达量较其它重组子略高，命名为KM71(PPIC9K-GGH)，经尿微量白蛋白试剂盒测定其表达量为162mg/L。

5.重组毕赤酵母KM71(PPIC9K-GGH)鉴定

将重组毕赤酵母KM71(PPIC9K-GGH)进行培养，提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果见附图3，条带1为DNA mark，条带2为KM71阴性对照菌，条带3为KM71(PPIC9K-GGH)。

从附图3可以看出，以重组子基因组DNA模板，均扩增出了约1.9kb特异DNA片段，阴性对照菌KM71/pPIC9K基因组DNA由于不含GGH基因，上、下游引物无相应靶序列，故无扩增片段。从此可以判断出这些重组子均被有效转化。

6.GGH的western blot鉴定

GGH既含有GLP-1肽序列，又含有HSA肽序列，这使得GGH可以同时和GLP-1与HSA抗体发生交叉反应，可以使用Western-blot来鉴定发酵液中表达的蛋白，泳道2使用GLP-1的单抗进行杂交，泳道3用HSA的抗体进行杂交，结果附图4所示，条带1为低分子量的蛋白质标准，条带2为用GLP-1抗体杂交发酵液上清，条带3为用HAS抗体杂交发酵液上清。。

由附图4可知，在约73kDa的地方出现与GLP-1和HSA抗体发生特异性反应的条带，表明表达的目的蛋白同时具有GLP-1和HSA的抗原性，为GLP-1和HSA的杂合分子，同时说明GGH在毕赤酵母中成功的得到表达。

实施例3GGH的生物活性检测

1.GGH的体外生物活性

(1)胰腺原代细胞的制备

(a)成年雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g，乙醚适量麻醉。

(b)固定四肢成仰卧位，嘴巴上套上乙醚口罩。

(c)胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，用棉签翻找十二指肠，显露胰管及胆总管。

(d)1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，胆总管内插入套管针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/mL胶原酶p溶液10mL，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置5mL Hank’s液的消化瓶中。

(e)38℃水浴中静止消化10min，再加入3mL预冷的胶原酶，继续消化5min，不断观察消化程度，呈细砂状时置于冰盒中，在超净台内加满4℃5％FBS Hank’s液，终止消化。

(f)细胞悬液1500r/min 4℃离心2min，弃去上清液，沉淀物加入4℃Hank’s液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank’s液重悬后，把大块的细胞团去掉，细胞悬液加到15mL离心管内，1500r/min 4℃离心2，弃去上清液。

(g)沉淀物加25％Ficoll 4mL混匀，其上依次分别加入23％、20％、11％Ficoll溶液各2mL，3000r/min，4℃离心20min，吸出23％-20％及20％-11％界面的胰岛，用4℃Hank’s液于15mL离心管内离心洗涤1次。

(h)加入15％FBS 1640培养液，加入EGF，重悬，37℃培养。

(2)对胰岛原代细胞的增殖作用

培养至所需细胞量时，倾去培养液，加入5mL 0.25％胰酶溶液消化，37℃保温至细胞开始从瓶壁脱落前，倾去胰酶溶液，加入适量以上培养基，用玻璃吸管吹打至细胞全部从瓶壁脱落；血球计数板计数细胞，用培养基稀释细胞浓度至0.8～1.0×10⁵cell/mL；铺于96孔细胞培养板，每孔加100μL细胞悬液，将GGH以培养基稀释至系列浓度，加入以上96孔细胞培养板，每浓度点设4个复孔，同时设置空白点及阴性参照点，每实验孔均以培养基补至300μL，于37℃，5％CO₂培养箱中常规培养。实验结束前，小心吸去上清，每孔加入180μL新鲜培养基，再加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值(OD570nm)。

用GLP-1作为阳性对照，用生理盐水作为阴性对照，结果如附图5所示。

由附图5可知，GGH与单体GLP-1对胰岛原代细胞的增殖作用的影响趋势基本相同，从5nmol到45nmol GGH对胰岛原代细胞的增殖作用逐渐增加，在浓度为45nmol时增殖作用达到最大，增殖率为35.4％。而对照组在30nmol时增殖作用最大，增殖率为31.3％，这说明采用突变体串联体的形式与白蛋白直接融合的体外生物活性相差不大。

2GGH的体内活性实验

取体重22-25g雄性小鼠50只，随机分为：正常组，GLP-1组(0.125mg/Kg)、GGH高剂量组(3.0mg/kg)、中剂量组(1.25mg/Kg)和低剂量组(0.25mg/kg)。小鼠禁食(不禁水)过夜后，各组灌胃给药，正常组给生理盐水。各组小鼠灌胃给予1.5g/kg葡萄糖溶液后立刻尾静脉注射GLP-1和不同剂量的GGH。注射后30、60、120min采集血样，测定血糖值。然后在4、8、24、48、72、96h分别再次罐胃，测定罐胃后30min的血糖值。

通过对空腹给药及葡萄糖(1.5g/kg)后不同时间的血糖值判定其活性。其结果见表1。

表1GGH对正常小鼠口服葡萄糖后血糖的影响(

n＝10)

由表1可知，与正常组相比较，在给药和葡萄糖灌胃后30min后血糖的水平差异最大，正常组的血糖水平为13.5mmol/L，而GGH的高、中、低三个剂量组分别为4.2mmol/L、7.0mmol/L、8.5mmol/L，阳性对照组的血糖值则为6.7mmol/L，这说明GGH与阳性对照都可以明显的控制血糖水平。同时在下一步实验中用一定时间内的血糖增量来检测其生物活性。

实验进一步考察了给药不同时间后，采用同剂量的葡萄糖灌胃后的血糖增量，来检测其体内发挥药效作用的时间，结果如附图6所示。

由附图6可知，GGH在体内的作用时间明显长于单体GLP-1，GGH的中、高剂量组在72h可以明显的检测到其对血糖的控制作用，而单体GLP-1在0h具有控制血糖的作用，但4h后就检测不到生物活性。

实施例4GGH与其他类似物的体内活性比较

取体重22-25g雄性小鼠50只，随机分为：正常组、GLP-1组(0.125mg/Kg)、GLP-1-HSA组(1.25mg/Kg)、2GLP-1-HSA组(1.25mg/Kg)、GGH组(1.25mg/Kg)。(GLP-1-HSA和2GLP-1-HAS是本实验室利用重组蛋白的方法制得的，经过测序确认氨基酸序列正确。)小鼠禁食(不禁水)过夜后，各组灌胃给药，正常组给生理盐水。各组小鼠灌胃给予1.5g/kg葡萄糖溶液后立刻尾静脉注射各药物组溶液。注射后30、60、120min采集血样，测定血糖值。然后在4、8、24、48、72、96h分别再次罐胃，测定罐胃后30min的血糖值。

通过对空腹给药及葡萄糖(1.5g/kg)后不同时间的血糖值判定其活性。其结果见表2。

表2GGH与其他类似物对正常小鼠口服葡萄糖后血糖的影响(

n＝10)

由表2可知，与正常组相比较，在给药和葡萄糖灌胃后30min后血糖的水平差异最大，正常组的血糖水平为13.5mmol/L，而GLP-1组为6.7mmol/L，GLP-1-HSA组为7.0mmol/L，2GLP-1-HSA组为6.9mmol/L，GGH组为7.0mmol/L，这说明GGH与其他类似物都可以明显的控制血糖水平。但给药后120minGGH组对血糖控制的优势开始体现。同时在下一步实验中用一定时间内的血糖增量来检测其生物活性。

实验进一步考察了给药不同时间后，采用同剂量的葡萄糖灌胃后的血糖增量，来比较各种药物在体内发挥药效作用的时间与效果，结果如附图7所示。

由附图7可知，GGH在体内的作用时间明显长于单体GLP-1、GLP-1-HAS、2GLP-1-HAS，效果也明显优于单体GLP-1、GLP-1-HAS、2GLP-1-HAS。

Claims (6)

1.一种脑肠肽激动剂分子，其特征在于，将胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)的N末端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸，修改一个GLP-1_A2G氨基酸残基R30构象，使α氨基暴露，连接两个GLP-1_A2G序列，得到GLP-1_A2G的串联体(GLP-1_A2G)₂，然后利用重叠PCR技术，选择(GLP-1_A2G)₂作为目标分子与人白蛋白融合表达，得到融合基因(GLP-1_A2G)₂-HSA，简称GGH。

2.一种核苷酸序列编码，如权利要求1所述的脑肠肽激动剂分子的序列，其特征在于，其序列为：SEQ New：1938bp；Composition 600A；376C；453G；509T；0 OTHER；Percentage：31.0％A；19.4％C；23.4％G；26.3％T；0.0％OTHER；Molecular Weight(kDa)：ssDNA：600.24dsDNA：1194.64。

1    CACGGTGAAG GTACTTTCAC TTCTGATGTT TCTTCTTACT TGGAAGGTCA AGCTGCTAAG

61   GAATTCATTG CTTGGTTGGT TAAGGGTAGA CATGGAGAGG GAACATTTAC ATCAGACGTC

121  TCATCATATT TAGAGGGACA GGCAGCAAAA GAGTTTATAG CATGGTTAGT AAAAGGAAGG

181  GATGCACACA AGAGTGAGGT TGCTCATCGA TTTAAAGATT TGGGAGAAGA AAATTTCAAA

241  GCCTTGGTGT TGATTGCCTT TGCTCAGTAT CTTCAGCAGT GTCCATTTGA AGATCATGTA

301  AAATTAGTGA ATGAAGTAAC TGAATTTGCA AAAACATGTG TTGCTGATGA GTCAGCTGAA

361  AATTGTGACA AATCACTTCA TACCCTTTTT GGAGACAAAT TATGCACAGT TGCAACTCTT

421  CGTGAAACCT ATGGTGAAAT GGCTGACTGC TGTGCAAAAC AAGAACCTGA GAGAAATGAA

481  TGCTTCTTGC AACACAAAGA TGACAACCCA AACCTCCCCC GATTGGTGAG ACCAGAGGTT

541  GATGTGATGT GCACTGCTTT TCATGACAAT GAAGAGACAT TTTTGAAAAA ATACTTATAT

601  GAAATTGCCA GAAGACATCC TTACTTTTAT GCCCCGGAAC TCCTTTTCTT TGCTAAAAGG

661  TATAAAGCTG CTTTTACAGA ATGTTGCCAA GCTGCTGATA AAGCTGCCTG CCTGTTGCCA

721  AAGCTCGATG AACTTCGGGA TGAAGGGAAG GCTTCGTCTG CCAAACAGAG ACTCAAGTGT

781  GCCAGTCTCC AAAAATTTGG AGAAAGAGCT TTCAAAGCAT GGGCAGTAGC TCGCCTGAGC

841  CAGAGATTTC CCAAAGCTGA GTTTGCAGAA GTTTCCAAGT TAGTGACAGA TCTTACCAAA

901  GTCCACACGG AATGCTGCCA TGGAGATCTG CTTGAATGTG CTGATGACAG GGCGGACCTT

961  GCCAAGTATA TCTGTGAAAA TCAAGATTCG ATCTCCAGTA AACTGAAGGA ATGCTGTGAA

1021 AAACCTCTGT TGGAAAAATC CCACTGCATT GCCGAAGTGG AAAATGATGA GATGCCTGCT

1081 GACTTGCCTT CATTAGCTGC TGATTTTGTT GAAAGTAAGG ATGTTTGCAA AAACTATGCT

1141 GAGGCAAAGG ATGTCTTCCT GGGCATGTTT TTGTATGAAT ATGCAAGAAG GCATCCTGAT

1201 TACTCTGTCG TGCTGCTGCT GAGACTTGCC AAGACATATG AAACCACTCT AGAGAAGTGC

1261 TGTGCCGCTG CAGATCCTCA TGAATGCTAT GCCAAAGTGT TCGATGAATT TAAACCTCTT。

3.根据权利要求1所述的脑肠肽激动剂分子的制备方法，其特征在于：将GLP-1的N末端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸，修改一个GLP-1_A2G氨基酸残基R30构象，使α氨基暴露，连接两个GLP-1_A2G序列，得到GLP-1_A2G的串联体(GLP-1_A2G)₂，然后利用重叠PCR技术，选择(GLP-1_A2G)₂作为目标分子与人白蛋白融合表达，得到融合基因(GLP-1_A2G)₂-HSA，简称GGH。 

4.根据权利要求1所述的脑肠肽激动剂分子的表达载体，一种毕赤酵母，其特征在于，该毕赤酵母为毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.4892，保藏日期为2011年5月24日。

5.根据权利要求4所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的GGH与毕赤酵母的分泌型多拷贝质粒pPIC9K连接，线性化之后通过电转到毕赤酵母KM71中，通过G418筛选，经G418抗性筛选得到能耐受3mg/mL G418重组菌12株，耐受4mg/mLG418重组菌5株，进行甲醇诱导表达，筛选得到权利要求4所述的表达量高的重组菌KM71(pPIC9K-GGH)，表达量为162mg/L。

6.根据权利要求1所述的脑肠肽激动剂分子在制备治疗糖尿病药物中的应用。 

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