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CN102365370A - 多发性硬化症严重程度的遗传标志 - Google Patents

多发性硬化症严重程度的遗传标志 Download PDF

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CN102365370A CN2010800135314A CN201080013531A CN102365370A CN 102365370 A CN102365370 A CN 102365370A CN 2010800135314 A CN2010800135314 A CN 2010800135314A CN 201080013531 A CN201080013531 A CN 201080013531A CN 102365370 A CN102365370 A CN 102365370A
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severity
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J·武伊齐克
F·艾斯普斯托
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Abstract

本发明涉及利用SNP来预测个体多发性硬化症的易感性和/或严重程度。所述SNP位于糖基化酶MGAT5和XYLT1的内含子中、HIF1AN(基因)3’端、MEGF11、FGF14、PDE9A和CDH13的内含子中及(染色体)4q34和17p13的遗弃区中。

Description

多发性硬化症严重程度的遗传标志
发明领域
本发明涉及利用SNP来鉴定其与受试者多发性硬化症(MS)严重程度的关联性。
发明背景
多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的慢性炎症和脱髓鞘疾病，常始于成年早期。MS被为是一种复杂的疾病，因为很可能有多种遗传和非遗传因素结合起来影响患此病的风险性。遗传因素作用的证据是令人注目的，它得到双胞胎、半同胞和收养子女研究的支持。虽然MS发病起始时通常即呈现为复发-缓解过程(RR)，但大多数患者发病后进入继发性渐进期(SP)，而其他患者(常常是后来发病的)可能直接进入原发渐进期(PP)。
基因组扫描排除了远离HLAII类区中存在MS主要易感基因座的推断，但未能揭示是否存在几个以上推测的易感基因座1-3。已显示在HLA基因复合体中有几个HLA-DRB1等位基因与此病相关4，而一些证据也提示HLA I类区域中存在独立的MS风险因子5-7。最近，支持IL7Ra基因在MS上至关重要的证据越来越多8-10。然而，显然其他遗传风险因子仍待鉴定。
已明确MS易感性是一种复杂的遗传性状。MS的临床病程和结局大相径庭，看来某些基因可能参与诱生该病，而其他基因可能在影响此病严重性上起作用11，12。评估MS严重性是评估随疾病进程是否发展为残疾，但可能因以下事实而复杂化，即此病的进程随时间而不同，患者也可能出现改善期。临床评估MS严重程度应用最广泛的方法是残疾状态扩展等级表(EDSS13)。传统上广泛采用进展指数(PI＝EDSS评分/持续时间(年))，但受到上述原因的阻碍。最近，提出MS严重性评分(MSSS)可作为一种新方法，涉及对有相当病程患者的残疾分布进行EDSS评分，部分弥补了PI的弱点14。
已测试了可能与MS严重性相关的几种候选基因(参见综述15)，它们大多数没有显示与MS进程遗传相关的证据。这些候选基因是：载脂蛋白ε(APOE，参见综述16)、脊髓小脑性共济失调2(SCA217)、脑源性神经营养因子(BDNF18)、Toll样受体4(TLR419)、骨桥蛋白20、细胞毒T淋巴细胞相关因子4(CD152或CTLA4)和CD2821、趋化因子CC受体5(CCR5)和HLA-DRB1*150122。已报导的与MS临床结局相关的只有少数基因座：位于染色体2q12-14上的白介素1基因座，含有3个基因(IL-1，IL-1和IL-1受体拮抗剂IL-1RN)，其中6个位点、5个单核苷酸多态性(SNP)和一个数目可变串联重复(variable number tandem repeat，VNTR)序列据报导与在三类严重等级上用EDSS测定的严重程度相关23；在白介素10启动子中，两个微卫星标记在轻度(PI＜0.5)与严重(PI＞0.5)疾病进程类别之间有差异24；已发现ADAMTS14基因中两个SNP与MS分类(复发缓解-RR与原发渐进-PP)有关，但与用MSSS测得的预后无关25；在CD59a缺陷的MOG-EAE小鼠模型上已证明此病发病率和严重性升高26。然而，这些研究依据的个体数目有限并且没有进行重复研究。此外，所有这些研究都采用检测与严重程度相关性的分类方法：通过按病损范围、EDSS、PI或MSSS的等级划分选择截取域值，将病人分成轻度/中度/严重或轻度/严重MS类型，并比较各类别之间的等位基因和基因型频率。
鉴于MS的重要性，对用于MS患者的鉴定标志特别是遗传标志存在需求。特别是，需要鉴定用于预测MS易感性、特别是疾病严重程度的基因标志。
发明概述
本发明的一个方面涉及一种基因分型方法，包括a)使用分离自个体样品的核酸；和b)测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中SNP rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922和/或rs4315313的核苷酸类型，和/或与一个或多个这些SNP连锁不平衡(LD)的SNP中的核苷酸类型。
本发明的一个方面涉及选自SNP rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922、rs4315313中的一个或多个SNP，与这些SNP的一个或多个连锁不平衡(LD)的SNP，用于预测个体MS疾病的严重程度。
在另一方面，本发明涉及在需要治疗的个体上治疗MS的方法，该方法包括步骤a)将上述方法体外应用于个体的样品；b)治疗经鉴定显示有上述一种或多种标志并经鉴定显示MS疾病严重性达到某种水平的个体。
发明详述
以下更详细地描述本发明，其中实施例旨在说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。
表格和附图的简要说明
图1.MSSS分布：1,040个MS患者的MS严重性评分分布直方图。
图2.严重程度相关性的FDR(假发现率)评估：用10,000轮MSSS慢慢移动估计FDR，并对所选阳性数R作图，R≤100(粗线)。此曲线给出了估计的给定阳性数中的假阳性比例(如40个最可能相关的SNP的90％(R≤40)评估为假阳性)，或给定的假发现率中的阳性数(例如40％FDR域值只选出一个SNP)。虚线代表95％估计置信区间边界。
图3.与疾病严重程度相关的SNP举例：左侧分布图代表全体人群(黑色：(1)最左侧柱)、多数纯合子个体(红色：(2)左侧第2柱)、杂合子个体(蓝色：左侧第3柱)和少数纯合子个体(绿色：最右侧柱)中所考虑的SNP的MSSS分布。水平线(各个方框)表示各类别MSSS的平均值(各自的标准差)。右侧图提供累积分布函数。
图3.1：SNP 1遗弃染色体4，rs6552511
图3.2：SNP 2遗弃染色体17，rs7221818
图3.3：SNPs 3和4.XYLT1，rs12927173和rs2059283
图3.4：SNPs 5，7和11.HIF1AN，rs1343522，rs4573623和rs2495725
图3.5：SNPs 6和12.MGAT5，rs4953911和rs3814022
图3.6：SNP 8.MEGF11，rs333548
图3.7：SNP 9.FGF14，rs10508075
图3.8：SNP 10.PDE9A，rs2839580
图3.9：SNP 13.MTPN，rs1078922
图3.10：SNP 14.CDH13，rs4315313
图4.XYLT1和MGAT5中的SNP重复：
873份独立样品重复数据组的3个SNP相关性分布图(图例与图3相同)。上面两个SNP位于MGAT5基因内，第三个SNP位于XYLT1基因内。
以下描述SNP及其序列
Figure BDA0000094258030000041
SNP的IUPAC代码：
  IUPAC代码   SNP
  R   G或A
  IUPAC代码   SNP
  Y   T或C
  M   A或C
  K   G或T
  S   G或C
  W   A或T
本发明一方面涉及基因分型的方法，包括步骤：a)使用分离自个体样品的核酸；和b)测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中SNP rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922和/或rs4315313的核苷酸类型，和/或与这些SNP的一个或多个连锁不平衡(LD)的SNP中的核苷酸类型。
特别感兴趣的SNP优选选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522和/或rs4573623。
在一个实施方式中，按照本发明和用于本发明方法和应用的SNP也是与一个或多个所鉴定的SNP连锁不平衡(LD)的那些SNP，表示为至少包括100名个体的至少一群患者的LD相关系数r2＞0.8，优选LD相关系数r2＞0.95。
一种标志(如SNP)与按照本发明的多发性硬化症患者的严重性“相关”，表示MS严重程度不同的两群患者之间该标志的频率有统计学显著差异。
多发性硬化症(MS)的“严重程度”，按照本发明可用MS领域已知的任何方法表示，例如残疾状态扩展等级表(Expanded Disease Status Scale，EDSS)，或用该领域其它常用的技术或衡量方法或定义表示。在这种情况下及在本领域中常用的术语“疾病残余活动”应理解为表示MS疾病活动的某种程度，例如，出现用MS领域常用的衡量方法或定义所限定的临床症状。“疾病残余活动”的一种指征或衡量标准，可以是如用残疾状态扩展等级表(EDSS)或磁共振成像(MRI)所测得的经历疾病复发或病情发展。作为时间框架的一个例子是两年治疗期间的评估。应理解其它时间框架也可被定义和采用，如一年、三年或临床研究方案中常用的、技术人员熟知的其它时间框架。可选择参比时间框架，以利于衡量和适当的读出。可采用同样适用的、其它已被接受的疾病状态衡量方法，例如多发性硬化症剑桥基础评分(CAMBS)和技术人员使用的其它方法。MS领域及如本领域技术人员所知道的，MS攻击有各种定义，它们可用于本发明。因此，当实施本发明时，技术人员可采用各种可能的方法。评估或诊断MS方法的例子可参见以下出版文献：Kurzke J.F，Neuroepidemiology，1991，10：1-8；Kurzke J.F，Neurology，1983，33：1444-1452；McDonald W.I et al.，Ann.Neurol.，2001，50：121-127；Polman C.H.et al.，Ann.Neurol.2005，58：840-846。因此，严重程度标志或SNP可以是表明一个患者与MS人群相比其疾病严重程度高或低的标志。
按本发明治疗的个体会对治疗有“反应”。诊断为有MS、罹患MS的个体或本发明意义上的MS患者对干扰素治疗“有反应”或“有反应者”应理解为MS患者经干扰素治疗，特别是用干扰素1a或1b(具体是
Figure BDA0000094258030000061
Figure BDA0000094258030000062
和
Figure BDA0000094258030000063
)治疗后，按下面设置的标准所表现的疾病残余活动。有反应可被定义和/或衡量为疾病进程延迟，例如，可采用疾病状态扩展等级表(EDSS)或本领域常用的其它技术或衡量方法或定义来衡量。具体说，有反应应理解为MS无发展或无恶化、或临床病情/疾病活动稳定、或MS改善，例如在临床症状上的改善，或用MRI或脑脊液(CSF)分析等其它方法测量的MS改善。特别是，可理解为复发/发作/恶化频率减少，或复发/发作/恶化程度减轻。
本说明书和权利要求书中所用的“一个”或“一种”指一个或多个，除非另有说明。
“等位基因”是特定形式的基因、遗传标志或其它遗传基因座，它可与其它形式的基因、遗传标志或其它遗传基因座区分，例如但不限于其特定的核苷酸序列。术语等位基因包括例如(但不限于)一种形式的单核苷酸多态性(SNP)。个体的二倍体细胞可以是某等位基因的纯合子，即两个配对染色体上的等位基因相同；或是所述等位基因的杂合子，即两个配对染色体上的等位基因不同。
“遗传标志”是一种可鉴定的多态性遗传基因座。一个例子(但不限于遗传标志)是单核苷酸多态性(SNP)。本发明所用的“标志”可以是遗传标志或任何其他标志，例如特定基因在核苷酸水平如mRNA上的表达水平，在本发明中可用作对干扰素治疗有反应的指标。
本文所用的“基因型”指一个个体的配对(同源)染色体上一个遗传基因座的基因标志的两个等位基因的联合遗传标志，例如但不限于SNP。本文所用的“基因型”也指一个个体的一对或一对以上同源染色体上一个以上遗传基因座的等位基因组合，例如但不限于SNP。
“基因分型”是测定个体基因型的方法。
“基因座”或“遗传基因座”指基因在染色体或其他遗传物质上的具体位置。
“寡核苷酸”指核酸或核酸衍生物，包括但不限于：连锁核酸(locked nucleicacie，LNA)、肽核酸(PNA)或桥连核酸(BNA)；通常长度为5-100个毗连碱基，最常见长度为5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30或20-25个毗连碱基。可设计能与遗传标志的任何形式等位基因特异性杂交的寡核苷酸序列，这种寡核苷酸序列称为等位基因的特异性探针。如果所述遗传标志是一个SNP，该SNP的互补等位基因可位于等位基因特异性探针的任何位置。实施本发明可用的其他寡核苷酸是能与3’末端相距遗传标志基因座1个或少于或等于10个核苷酸、优选≤约5个核苷酸的SNP毗邻靶区域杂交的寡核苷酸。这类能与SNP毗邻区杂交的寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中，本文称为“引物延伸寡核苷酸”。在一个优选的实施方式中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与紧靠SNP的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
“多态性”指人群某遗传基因座核苷酸序列不同或含有不同数目重复核苷酸单位的两种或多种替换形式(等位基因)。多态性见于基因的编码区(外显子)、非编码区或基因外侧。人群中不同等位基因多态性出现的频率不同，在选定人群中最常见的等位基因有时称为“主要”等位基因。二倍体生物可以存在不同等位基因的纯合子或杂合子。双等位基因多态性有两个等位基因。
在所述方法中，所述双等位基因标志的核苷酸的鉴定较佳为测定所述个体基因组中存在的所述双等位基因标志的两个拷贝。可采用技术人员已知的任何方法，优选用微测序试验进行所述测定。此外，可以用例如PCR先扩增含双等位基因标志的序列的一部分，再进行所述测定步骤。然而，也可采用任何可利用的方法。
按照本发明，优选的方法还包括将基因分型步骤的结果与多发性硬化症严重程度的结果相关联。
本发明人在一个按照本发明的优选方法中发现，存在可表明严重程度的特征等位基因，它们是：rs3814022中的G，rs4953911中的T，rs2059283中的A，rs12927173中的A，rs2495725中的A，rs1343522中的G，rs4573623中的G，rs333548中的T，rs10508075中的G，rs2839580中的A，rs2495725中的A，rs3814022中的G，rs1078922中的G和/或rs4315313中的C；这些等位基因是多发性硬化症严重程度的指标。在按照本发明的一个特定SNP中，在一个等位基因或优选两个等位基因中存在各自的碱基A、T、C、G，是表示MS严重程度的指征。特别是，与MS人群的平均值相比，本发明的SNP可表示受MS影响更严重的个体，或可提供表示受MS影响较不严重的标志。
本发明人有益地提供了区分MS人群整体中不同患者、不同患者组别的方法，特别是将他们按疾病严重程度分类。这个方法中采用本领域技术人员通常知晓的分子生物学方法和装置，如PCR和PCR循环仪，及统计学算法。可按MSSS预计的MS严重程度对患者分组，例如，非常严重、中等严重、不太严重和轻微严重组。因此，本发明提供了按照患者的疾病阶段和严重程度更好地治疗患者的工具。具体说，现在有可能对各患者个体采取更好的治疗剂量和治疗方案。
本发明的一个优选方面涉及利用选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922、rs4315313的一个或多个SNP，与这些SNP的一个或多个连锁不平衡(LD)的SNP，来预测多发性硬化症个体疾病的严重程度。
本发明的另一个方面涉及预测个体多发性硬化症严重程度的方法，包括a)使用得自所述个体样品的核酸；和b)用已知方法鉴定所述个体是否存在有用的遗传标志；c)根据步骤b)的结果预测所述个体多发性硬化症的严重程度。
在所述方法中，所述遗传标志涉及选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922、rs4315313的一个或多个SNP，与一个或多个这些SNP连锁不平衡(LD)的SNP。特别感兴趣的SNP优选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522和/或rs4573623。
本发明的还有一个方面涉及治疗有需要的个体多发性硬化症的方法，该方法包括步骤a)将上述方法施用于个体的样品；b)用干扰素治疗所述个体，该个体已被上述方法中的任何一种鉴定为显示有一种或多种上述标志并处于罹患多发性硬化症或有发展成严重多发性硬化症的风险中。或者，本发明涉及干扰素在治疗多发性硬化症患者上的应用或用于治疗多发性硬化症患者的干扰素，所述患者的特征是带有或经鉴定显示有至少一个本发明的判断严重性的SNP等位基因。在另一备选方案中，本发明涉及采用本发明的SNP诊断患者MS严重程度，和根据其疾病严重程度治疗所述患者。
所述方法或应用中特别感兴趣的SNP优选选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522和/或rs4573623。
因此本发明特别有利于对干扰素治疗剂量和/或治疗时间点进行分层和调整。一种可能的措施是高剂量治疗，或者对被鉴定为MS严重程度高的患者在MS临床症状出现前进行治疗。可用MRI分析患者的疾病状况，和以上文所指出的方式根据这些结果对患者进行分组/分类。对于按照本发明鉴定为处于成为受该病严重影响的MS患者的高风险中的MS患者，在早的时间点进行治疗以早期控制该病是特别有益的。因此，可选择适当的措施，例如足量的干扰素治疗及其剂量。此外，对患者的告知也获得对该治疗的顺从性支持。提高顺从性进而可获得对治疗结果的正面作用，如提高其药效。
优选的干扰素-β(IFN)是干扰素-β1a或1b。干扰素β的例子有或
Figure BDA0000094258030000091
Figure BDA0000094258030000092
Figure BDA0000094258030000093
上述方法或应用中施用于个体的IFN剂量(采用单剂量或多剂量)，除患者分组结果外，随各种因素而有所不同，包括药物的动力学性能、给药途径、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、个头大小)、症状的程度、同时进行的治疗、治疗频率和所需达到的效果。
人IFN-β的标准剂量范围是每天80000IU/kg至200000IU/kg，或每人每天6-12MIU(百万国际单位)或每人22-44μg。按照本发明，优选的IFN给药剂量是每人每天约1-50μg，更优选约10-30μg或约10-20μg。
按照本发明的活性成分给药可通过静脉内、肌肉内或皮下途径。优选的IFN给药途径是皮下途径。
也可每天、隔天或以较低频率给予IFN。优选每周给予IFN一次、二次或三次。
优选的给药途径是皮下给药，例如每周给药三次。另一优选的给药途径是肌肉内给药，可以例如每周给药一次。
优选每周三次皮下注射给予22-44μg或6-12MIU的IFN-β。皮下给予IFN-β的剂量是每隔一天25-30μg或8-9.6MIU。也可以每周一次肌肉内给予30μg或6MIU IFN-β。
实施例
以下实施例并不意味着构成对本发明的限制，以下实施例给出了本发明的优选实施方式，这些实施方式将用于阐述本发明。
实施例以本发明优选的实施方式显示了鉴定严重性标志的方法即(i)全基因组(即无假说，hypothesis-free)和(ii)无范围(即连续)方法的结果。首先，从法国、瑞典和意大利的医院募集三组MS患者(n＝1,040)，用Affymetrix
Figure BDA0000094258030000101
500K技术，给全基因组约500,000个SNP分型。用MSSS对MS的严重程度连续评分，并通过纯合子患者每种标志的等位基因MSSS分布之间的无参数检验对最高频率多态性(约105,000SNP)的基因型相关性进行评估。用假发现率(FDR)估算法控制多重检测问题。此方法的结果鉴定到14个严重性标志，位于8个不同基因和2个遗弃区内。其次，对独立的873名MS患者重复组作某些标志的基因分型，鉴定到两个糖基化酶基因，从而支持了MS中聚糖调节的重要性。
材料和方法
数据收集
“筛选数据组”包括来自法国、瑞典和意大利的总数1,040名无亲缘关系的患者，“重复数据组”包括873个无亲缘关系和独立的法国和瑞典患者(表1)。所有患者都是高加索人，按麦克唐纳德标准诊断为多发性硬化症27，他们的病程分为复发-缓解型、继发进展型或原发进展型28。用Kurtzke EDSS对残疾进行评分。平均年龄43.8岁，平均EDSS评分为3.6，性别比为2∶1(女/男)。遗传分析征得所有个体同意，研究方案得到当地道德论理委员会的批准。
表2显示筛选和重复数据组MS患者的详细人口统计和临床特征。进入本项研究的大多数病例中，疾病持续时间定义为第一次出现症状那一年至最近用EDSS评估检查那一年之间的年数，发病年龄定义为第一次出现脱髓鞘病症神经功能障碍的年龄。
残疾等级划分
在MS研究中评价残疾最广泛采用的方法是Kurtzke EDSS，但它不考虑描述疾病进展速度的关键参数--病程。为此理由，我们采用MSSS14，它可从横断面上提供衡量个体的疾病严重程度。此衡量尺度涉及对具有相当病程的大数据组患者的残疾分布的EDSS评分。用参考文献14中描述的MSSS测试软件第2版对MSSS进行计算。
基因分型和质量控制
用Affymetrix公司的
Figure BDA0000094258030000111
人类图谱500K技术独立研究了筛选数据组的DNA样品。Affymetrix用B-RLMM软件程序选出每份DNA样品的497,641个SNP基因型，确保最小点名率(call rate)97％。只保留常染色体的SNP用作分析。为了避免由于基因型的极低频率所造成的偏差，过滤掉带有低频率微少等位基因(MAF＜30％)的标志或高比例丢失数据(未分型的DNA＞5％比例)的标志。我们选择把重点放在非常频繁的标志(MAF＞30％)上，保证微少纯合子的最低频率在哈地-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡下大于9％(然后微少纯合子人群的规模平均大于100名)。
用美国应用生物系统(Applied BioSystems)公司的
Figure BDA0000094258030000112
基因分型试验，对重复数据组的DNA样品独立地作所选SNP的基因分型。
严重程度扫描
对于每个SNP，对相应于纯合子患者每个标志等位基因的两组MS严重程度的评分进行Wilcoxon秩和检验29。这种非参数检验对每个SNP指派一个概率值(p-值)。对于筛选数据组，通过置换估计假发现率(FDR)：(i)慢慢移动MS严重程度评分模拟零位分布(null distribution)，重新计算Wilcoxon的p-值，重复此过程10,000次；(ii)按先前置换步骤估计的那样30，31，如下计算FDR的每个p-值的阈值：FDR＝min(1，p.m/R)，其中R是水平的阳性数(p值小于的SNP数)，m是进行的检验次数(扫描SNP的次数)，p是在零位假设下p-值小于α的概率。
基因组分析
SNP位于NCBI v36人类基因组序列上。基因结构(外显子和内含子)注释得自ENSEMBL释放4332。单倍型和LD矩阵的计算采用HaploView33，用LD法的坚实支持(solid spine)，扩展截断值＝0.8D’。
结果
全部1,040个患者的MSSS平均值为4.42(标准差2.79)，跨越0.086-9.964(参见图1的总分布)。497,641个SNP中105,035个(21％)通过过滤标准，它们用于分析，覆盖基因组的63％。
用10,000轮慢慢移动的MSSS对观察到结果的FDR进行评估，并将100个最小的p-值作成图2。FDR一开始时就高(约50％)，迅速上升到80％坪值，然后收敛慢慢趋向于1。当考虑95％置信区间的下限时，40％FDR阈值选择14个SNP(表3)。这些SNP对应于常见基因型(由最初的30％MAF过滤所确保)并且都在哈地-温伯格平衡下。选择对应于严重程度p-值的截断值为1.4e-4。基因型与MSSS之间的相关性见图3。
在经典分类方法中，MSSS尺度分不同的类别，例如，轻度和重度MS，进行经典相关性研究以检测这两个类别之间的基因型差异。当应用于我们的数据组时，例如用于501名轻度MS(MSSS＜4)和356名重度MS(MSSS＞6)患者两个组，经FDR多次测试纠正后，我们未能检测到显著相关的SNP31。例如，SNP rs7221818(在我们的连续方法中排序2，见表3)在该分类法(基因型p-值＝6.7e-4)中排序67，此选择的FDR评估为80％。只有排序第一的SNP rs6552511是采用各种MSSS阈值(数据未显示)分类方法唯一检索到的。一旦用连续扫描法选出这14个SNP，就可以分析它们的经典分类相对风险和优势比：微少基因型有9个与较高MSSS相关(相对风险范围1.5-2.3)，5个与较低MSSS相关(风险范围0.4-0.8，细节见表)。
将按照本发明的这些SNP绘制在人类基因组序列图谱中，与ENSEMBL基因注释作比较。图谱的细节见表4。两个SNP(rs6552511和rs7221818)位于遗弃区(最靠近的基因相距100kb以上)。其它12个SNP在8个基因的100kb内或相距不到100kb。这些基因的一些(XYLT1，HIF1AN和MGAT5)以确定基因内连锁不平衡(LD)严重性区的几个SNP为代表。这三个位于10号染色体上HIF1AN基因3’端的标志是在LD区内，该区不含HIF1AN基因结构的任何部分(该区离HIF1AN终止密码子50kb)或已知的任何HIF1AN基因调节区。rs1078922SNP位于离MTPN基因5’端22kb。其它SNP位于这些指定基因的内含子中：XYLT1的第一内含子(2个SNP)，MGAT5的第2内含子(2个SNP)，MEGF11的第8内含子，FGF14的第3内含子，PDE9A的第7内含子和CDH13的第2内含子。
XYLT1与MGAT5的信号重复，因为(i)这些信号由LD中多个SNP所代表，可认为是其本身的技术复制品，和(ii)这两个基因均编码糖基化酶，是生物学感兴趣的候选目标(参见讨论)。这两个基因中选出以下3个SNP：XYLT1基因中的rs12927173；MGAT5基因中的rs3814022和rs4953911(XYLT1基因选出第2个SNP rs2059283，但制备者不能提供其引物)。重复数据组(n＝873)中这3个SNP的p-值分别为0.42、1.31e-2和3.76e-3(图4和表5)。然后重复检测此独立数据组MGAT5SNP与MS严重程度的相关性。两个数据组的总p-值分别是2.81e-6与1.54e-7(rs3814022和rs4953911)。对于XYLT1的SNP(rs12927173)，重复数据组没能产生相关性(p＝0.42)。然而，这两个数据组的总p-值仍有显著差异(P＝1.88e-4)。
我们对超过1000名的MS患者进行了全基因组扫描分析，以鉴定与该病严重程度相关的标志。这种全基因组扫描法导致鉴定到：未标注区2个标志，靠近HIF1AN基因的LD区3个SNP，MTPN 5’区1个SNP，和其它6个基因内的8个标志。选出两个基因中的3个标志，对独立的重复人群作基因型分析，导致MGAT5与该病严重程度相关的确认。本文中我们讨论了使得到这些结果成为可能的临床和方法学选择，然后把重点放在研究所选择并复制的严重性关联基因的生物学关系上。
对于用残疾程度单一横向评估衡量MS进程，并没有一致的方法。近年开发的MSSS法是在基因相关性研究中比较疾病进程的强有力方法，它可调整已被广泛接受的用于在具有同等病程的病例中比较个体残疾程度与评分分布的疾病持续期间残疾程度的测定方法EDSS。对于统计学评价，MSSS可能优于非线性EDSS，因为它将EDSS与病程合并成一种常态分布的变量。在我们的三种人群中，MSSS的分布均不均匀。这可以用不同病程人群的组成不同来解释，也可用已知的观察者之间的差异来解释(因为搜集的数据来自三个不同的医院)。残疾衡量的评估不一致可能显著影响到相关性研究的结果，特别是在用随意MSSS截取阈值来定义类别时。
以前发表的(候选基因)严重性研究传统地进行轻度与严重MS人群之间的相关性测试。在我们的病例中，采用不同MSSS阈值的类似分类方法未能检测到任何显著相关标志。采用EDSS(或其衍生的)评分的截断值可能太武断，不足以确定严重程度相同的亚人群，因为EDSS只能部分(有时主观地)反映MS的进程。看来采用连续临床评分的方法可能更为合适。对于扫描，我们选择排除杂合子，在每个SNP均为纯合子的MS患者之间进行两样本U检验。其相对于三样本经典线性回归方法，理论上讲具有优势，首先不必假设杂合子患者MS严重性为中等程度(位于两个纯合子组的严重程度之间)，这可能是严重性风险的另一种模式。我们的方法理论上允许检测风险等位基因的显性或隐性分布模式。其次，Wilcoxon秩和检验是一种非参数检验，适用于非高斯MSSS分布。作为极相似的一种方法，本方法可能对罕见标志动力不足。然而我们把重点放在哈地-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium)下次要基因型频率大于9％的频繁标志(MAF＞30％)上，它很好地代表了我们所筛选的人群(n＞100)。这种过滤显著减少了要分析的SNP数量(减少至105,035)同时维持了对基因组的合理覆盖度(63％)。用此法可能需要较大的样本数来调查频率较低的标志(例如，频率为20％的标志要调查2500个体，频率为10％的标志要调查10,000个体)。我们可以看到，整个人群中MSSS分布是不均匀的，一般来说每个SNP基因型的MSSS分布不是高斯型(Gassian)的(图1和SNP实施例图3)。最后，重要的是要考虑多重检测问题。采用保守的家庭明智错误率估计方法(如波佛洛尼Bonferroni校正法)不用选择SNP，意味着我们不能选出我们估计不存在假阳性的一组标志。我们宁可利用FDR估测来控制这种多重检测，因为它更灵活(允许给定的假阳性比例不一定是0％)，并且考虑了标志之间的独立性31。
FDR-控制方法导致选出了14个标志。2个排序第一的SNP显示了轻度(MSSS＜2)与严重(MSSS＞8)患者临床结果之间基因型频率轻微但重要的差异(相对风险约2.2)，它们是受关注的MS严重程度标志。然而，它们位于未曾公布过的基因组区域，因此不可能就它们对该病的预后影响作出假设。其它SNP位于已公布的基因内或附近。它们中间MGAT5是生物学特别感兴趣的。MGAT5(也称为GNT-V)基因编码β-1，6N-乙酰葡糖氨基转移酶，这是一种参与结合于细胞表面的β-1，6GlcNAc-支链N-连接葡聚糖的合成和糖蛋白分泌的酶。在小鼠中，MGAT5缺陷对肿瘤生长有保护作用34，并与对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的易感性升高(与野生型相比)有关35。MGAT5缺陷增加募集到抗原递呈表面的T细胞受体数目，从而减少了对CD28协同受体整合的需求。CD28和MGAT5的功能是T细胞活化阈值的相反调节剂，对免疫疾病易感。以前曾测试过CD28与MS严重程度的相关性，显示无显著意义21。然而，β-1，6GlcNAc-支链N-连接葡聚糖的表达选择性地抑制Th1细胞分化和促进Th2细胞的极化36。在MS患者的单核细胞中也已观察到糖基化缺陷：GCNT1(另一种葡糖氨基转移酶)活性降低约25-30％与复发-缓解患者出现MS急性临床症状和存在活动性病灶相关37。因此，我们支持MGAT5和更常见的GlcNAc-支链N-连接葡聚糖与MS进程相关。像MGAT5一样，XYLT1(木糖基转移酶1，XT-1)是糖基化过程涉及的一种酶。XYLT1是参与含葡糖氨基聚糖(GAG)的蛋白聚糖生物合成的链启动酶。蛋白聚糖包括一大群糖蛋白，有两个主要类型：硫酸软骨素(CSPG)和硫酸肝素(HSPG)。大多数CSPG由细胞分泌，参与胞外基质(ECM)形成。CSPG是哺乳动物CNS中所表达的蛋白聚糖的最丰富类型，特别通过它们的GAG-链，主要起着影响轴突生长、细胞迁移和变形的屏障分子的作用。成年人的CNS病损会刺激由增殖和迁移的神经胶质细胞(主要是反应活性星状细胞、小神经胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞)组成的胶质斑痕的形成，使几种ECM分子包括CSPG的表达上调。胶质斑痕的蛋白聚糖可能有保护作用，但胶质斑痕及与其相关的CSPG是损伤的CNS神经元轴突再生的主要障碍38。已报导在MS中ECM分子发生改变，并已证明活动性MS损伤中基底膜组分的过度产生和沉积可能促使轴突损伤39。因此，由于XYLT1能引起GAG-链的延伸和CSPG的合成，两个(研究)团队开发了一种DNA酶，该酶靶向其mRNA，显示能减少CSPG40，41。除与MS相关外，还显示全身硬化症患者血清中XYLT1的活性增强，这与临床分类相关42。被确定为所选严重性标志的其它基因有：HIF1AN(缺氧诱导因子1α的抑制剂)、MEGF11(多重EGF样结构域11)、FGF14(成纤维细胞生长因子14)、PDE9A(磷酸二酯酶9A)、MTPN(重组胰岛素样生长因子)和CDH13(钙粘蛋白13)。在以前报导的与MS严重程度相关的区域中未发现重要标志23-26。
因为MGAT5和XYLT1是生物学相关候选标志，二者有类似的糖基化作用，我们决定以一个独立人群重复该实验。结果清楚地证实，MGAT5中有两个SNP，XYLT1中的一个SNP在重复数据组中未发现相关。
结论是，我们进行的第一次全基因组MS严重性标志扫描，导致该病预后相关标志的无假设鉴定。对该病病情发展分子机制的了解是与搜索易感因素平行的需要解决的关键点。鉴定到的两个主要基因MGAT5和XYLT1参与糖基化过程，从而证实聚糖调节在MS中的重要性。这两个基因中，MGAT5在独立的重复数据组中得到证实，而XYLT1重复导致我们研究中的结果更加矛盾。聚糖在调节多种生理系统(包括免疫防御系统)的分子相互作用中起着举足轻重的作用，已证明糖基化在免疫应答的总体调节中具有关键性的作用43，44。蛋白糖基化是自身免疫病发病学的重要机制，一些证据支持MS、类风湿关节炎(RA)和糖尿病的“遗留表位产生自身免疫(REGA)的模型”45。按照此模型，自身免疫过程涉及细胞因子、趋化因子和蛋白酶，蛋白酶将糖蛋白切割成遗留表位，提呈给自体反应性T淋巴细胞，维持自身免疫反应。可产生这种遗留表位的底物的例子包括MS中的髓磷脂碱性蛋白、αB-晶体蛋白和干扰素-β，和RA中的II型胶原蛋白46。已用动物模型体内测试过这种REGA模型，显示可有令人感兴趣的治疗作用，因为抑制蛋白酶，如明胶酶B，对于MS或RA来说，可导致有益效应47，48。
表1.多发性硬化症收集数据
表2.筛选和重复数据组MS患者的人口统计学和平均临床特征
表3.按40％FDR阈值下限选出的SNP
n：具有此基因型的个体数；m和sd：这些人的MSSS平均值和标准差。p-值指对纯合子类型进行的秩和检验(不用杂合子，见上文)的p-值。
表4.选出的严重性SNP在基因组中的位置
  SNP身份   排序   染色体   位置   MAF   最靠近的基因
  rs6552511   1   4q34   182,688,603   35％   (遗弃)
  rs7221818   2   17p13   5,742,055   35％   (遗弃)
  rs12927173   3   16p13.1   17,378,835   49％   XYLT1(内含子)
  rs2059283   4   16p13.1   17,377,011   49％   XYLT1(内含子)
  rs1343522   5   10q24   102,358,165   44％   距HIF1AN 3’端58kb
  rs4953911   6   2q21   134,785,280   36％   MGAT5(内含子)
  rs4573623   7   10q24   102,361,387   46％   距HIF1AN 3’端61kb
  rs333548   8   15q22   64,032,567   32％   MEGF11(内含子)
  rs10508075   9   13q32   101,237,200   46％   FGF14(内含子)
  rs2839580   10   21q22   43,030,176   40％   PDE9A(内含子)
  rs2495725   11   10q24   102,354,010   45％   距HIF1AN 3’端54kb
  rs3814022   12   2q21   134,764,405   31％   MGAT5(内含子)
  rs1078922   13   7q33   135,334,939   42％   距MTPN 5’端22kb
  rs4315313   14   16q23   81,644,234   35％   CDH13(内含子)
表5.独立样品中严重程度标志的重复测试
Figure BDA0000094258030000191
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Figure IDA0000094258090000011
Figure IDA0000094258090000021
Figure IDA0000094258090000041
Figure IDA0000094258090000051

Claims (15)

1.一种基因分型方法，包括如下步骤：
a)使用分离自个体样品的核酸；和
b)测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中SNP rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922和/或rs4315313的核苷酸类型，和/或与一个或多个这些SNP连锁不平衡(LD)的SNP中的核苷酸类型。
2.如权利要求1所述的方法，其中测定所述个体的基因组中所存在的所述双等位基因标志的两个拷贝，进行所述双等位基因标志处的核苷酸的鉴定。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述测定采用微测序列试验进行。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的方法，还包括先扩增含有双等位基因标志的一部分序列，再进行所述测定步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述扩增用PCR法进行。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的方法，还包括将基因分型步骤的结果与多发性硬化症疾病严重程度相关联的步骤。
7.如权利要求1-6中任何一项所述的方法，其中，rs3814022中存在G，rs4953911中存在T，rs2059283中存在A，rs12927173中存在A，rs2495725中存在A，rs1343522中存在G，rs4573623中存在G，rs333548中存在T，rs10508075中存在G，rs2839580中存在A，rs2495725中存在A，rs3814022中存在G，rs1078922中存在G和/或rs4315313中存在C，表明所述个体多发性硬化症是严重的。
8.选自SNP rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922、rs4315313中的一个或多个SNP，与这些SNP的一个或多个连锁不平衡(LD)的SNP，用于预测个体的多发性硬化症的疾病严重程度。
9.一种能表明患多发性硬化症的个体疾病严重程度的方法，包括：
a)使用所述个体样品的核酸；
b)用已知方法鉴定所述个体中有用基因标志的存在；
c)根据步骤b)的结果预测所述个体多发性硬化症的疾病严重程度。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述基因标志是选自rs3814022、rs4953911、rs2059283、rs12927173、rs2495725、rs1343522、rs4573623、rs333548、rs10508075、rs2839580、rs2495725、rs3814022、rs1078922、和/或rs4315313中的一个或多个SNP，与这些SNP的一个或多个连锁不平衡(LD)的SNP。
11.如以上任何一项权利要求所述的方法，其中，与权利要求1所述的一个或多个SNP连锁不平衡(LD)的SNP的特征是，包括至少100个个体的至少一群人的LD相关系数r2大于0.8，优选LD相关系数r2大于0.95，或LD中估计的绝对平均D’等于或大于0.95。
12.一种治疗有需要的个体多发性硬化症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)采用权利要求1-7或权利要求9-11中任何一项所述的方法；
b)用干扰素β治疗所述个体，该个体已被鉴定显示有所述标志的一种或多种并且已确定所述个体的多发性硬化症病情严重。
13.干扰素β在治疗诊断患有多发性硬化症的个体中的应用，所述个体显示在至少一个等位基因中存在：rs3814022中的G，rs4953911中的T，rs2059283中的A，rs12927173中的A，rs2495725中的A，rs1343522中的G，rs4573623中的G，rs333548中的T，rs10508075中的G，rs2839580中的A，rs2495725中的A，rs3814022中的G，rs1078922中的G和/或rs4315313中的C。
14.如权利要求12所述的方法或权利要求13所述的应用，其中，所述干扰素β是干扰素β1a或1b。
15.如权利要求13所述的方法或应用，其中，所述干扰素β是
Figure FDA0000094258020000021
Figure FDA0000094258020000022
或
Figure FDA0000094258020000023
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