CN102357180B - 一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法和用途，该组合物主要由贝母制备而成，包括贝母粉碎成粉，其他中药加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至浸膏；在浸膏中加入贝母粉，混匀，得本发明中药组合物；本发明组合物毒性小，治疗癌症效果显著。

Description

一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法，特别涉及一种治疗癌症的中药组合物及其制备方法。

背景技术

川贝母为百合科植物川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母或梭砂贝母的干燥鳞茎，具有清热润肺，化痰止咳的功效，可用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、咯痰带血、治虚劳咳嗽、吐痰咯血、心胸郁结、肺痿、肺痈、喉痹、乳痈，现代化学研究其还含有多种生物碱，如川贝碱、青贝碱、白炉贝碱、炉贝碱、松贝碱甲和乙、西贝母碱、西贝素、岷贝碱甲、岷贝碱乙、川贝酮等成分，具有镇咳、祛痰、抗菌、抗炎，解痉，升高血糖，降压的药理作用。

知母为单子叶植物百合科植物知母的干燥根茎，具有清热泻火，生津润燥的功效，可用于治疗温热病、高热烦渴、咳嗽气喘、燥咳、便秘、骨蒸潮热、虚烦不眠、消渴淋浊等相应病症，现代研究其主要含有知母皂甙A-I、A-II、A-III、A-IV，B-I和B-II等成分，尚含有黄酮类的芒果甙、异芒果甙，生物碱类的胆碱、尼克酰胺，有机酸类的鞣酸、烟酸以及知母多糖等成分，现代药理表明其具有抗病原微生物、抗菌、降脂、抗动脉粥样硬化、解热、降血糖、抗辐射的作用。

即至今未见有川贝母和知母配伍能有效治疗肿瘤，有效抗癌的报道。

发明内容

本发明的目的在于公开一种治疗癌症的中药组合物。

本发明的目的还在于公开一种治疗癌症的中药组合物的制备方法。

本发明的目的还在于公开一种中药组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

本发明的目的还在于公开一种中药组合物在制备抑制血管生成药物中的应用。

本发明的目的还在于公开一种中药组合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明的目的还在于公开一种中药组合物在制备具有治疗肝癌药物中的应用。

本发明的目的还在于公开一种药物组合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明的目的还在于公开一种药物组合物在制备具有治疗肝癌药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种治疗癌症的中药组合物，其原料药主要由如下中药组成(按重量比计)：

知母1-10重量份  川贝母2-9重量份。

优选的，所述中药组合物，其原料药主要由如下中药组成：

知母3-8重量份  川贝母4-7重量份。

优选的，所述中药组合物，其原料药主要由如下中药组成：

知母5重量份  川贝母5重量份。

优选的，所述中药组合物，其原料药主要由如下中药组成：

知母3重量份  川贝母8重量份。

优选的，所述中药组合物，其原料药主要由如下中药组成：

知母7重量份  川贝母6重量份。

优选的，所述中药组合物，其原料药主要由如下中药组成：

知母8重量份  川贝母4重量份。

一种治疗癌症的中药组合物的制备方法，所述制备方法包括但不限于如下方法：

步骤1：取川贝母，粉碎成粉；

步骤2：取知母加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至浸膏；

步骤3：取浸膏，在浸膏中加入川贝母粉，混匀，得本发明中药组合物；

优选的，川贝母粉碎成最细粉，更优选过过8号筛；

优选的，知母加4-8重量倍量水煎煮2-4次，每次20-60分钟，合并煎液，滤过，取滤液；

优选的，上述滤液减压浓缩至相对密度1.25-1.35(60℃)的浸膏；

本发明在上述所得的中药组合物中加入药学上可接受的常规剂型辅料，按照常规剂型制备方法，制成临床接受的剂型，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液制剂、丸剂、蜜丸、缓释制剂、冻干粉针剂等。

本发明所述剂型优选为颗粒剂，可以选择常规颗粒制备方法，优选如下制备方法：

步骤1：取知母1-10重量份、川贝母2-9重量份；

步骤2：川贝母粉碎成细粉；

步骤3：知母：水煎煮，滤过，滤液浓缩至浸膏；

步骤4：步骤3浸膏中加入川贝母细粉及适量辅料，混匀，制粒，干燥，即得。

步骤4中的辅料选自可溶性淀粉、糊精、乳糖及糖粉等；优选乳糖或糊精。

上述颗粒剂的制备方法中水煎煮的方法优选为：知母加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液；

上述颗粒剂的制备方法中步骤3中浓缩为减压浓缩；

上述颗粒剂的制备方法中步骤3中滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的浸膏；

上述颗粒剂的制备方法中加入65％乙醇制粒。

本发明药物组合物的原料药为知母、川贝母组成，经试验证明对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用，对Lewis肺癌有明显的抑制肿瘤瘤体生长的作用，对Lewis肺癌的肺转移数目也有显著的抑制作用，对小鼠H22肿瘤具有良好的抑瘤作用，对人原发性肝癌细胞QGY-7703瘤株有明显的抑制作用，故可以抑制肿瘤生长，对癌症有治疗作用；且本发明中药组合物也能抑制血管生成，抑制肿瘤继续生长的基础，阻断肿瘤细胞的营养供给，致使肿瘤不再继续长大，直至肿瘤细胞坏死，肿块缩小乃至消失，达到治疗癌症的目的，本发明也为纯天然中药，毒性小，不仅可以消灭肿瘤细胞还能保护正常细胞，能够增加免疫细胞和细胞活性，提高疗效。

本发明药物组合物中川贝母属贵细药材类，传统即以打粉入药，知母属根茎类药材，有效成分主要为知母多糖及知母皂苷类，综合考虑传统用药习惯及日服剂量，所治疗疾病的临床需要，优先选择具有汤剂之优点又携带、服用方便的颗粒剂为优选剂型。

本发明进一步还提供一种治疗癌症的药物组合物，其活性成分组成及配比如下：

知母皂苷A-III 0.5-2重量份、芒果苷0.5-2重量份、贝母甲素2-7重量份、贝母乙素3-8重量份。

所述治疗肿瘤的药物组合物，优选为：

知母皂苷A-III∶芒果苷∶贝母甲素∶贝母乙素＝1∶1∶4∶5.5。

知母皂苷A-III、芒果苷、贝母甲素和贝母乙素均可通过常规方法制备或通过市场购买获得。

本发明在上述所述的药物组合物中加入药学上可接受的常规剂型辅料，按照常规剂型制备方法，制成临床接受的剂型，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液制剂、丸剂、蜜丸、缓释制剂、冻干粉针剂等。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。

实验例1制备工艺研究

1.1药材来源

川贝母药材：购于成都荷花池中药材专业批发市场肖草药中药行，经四川大学华西药学院王曙教授鉴定为川贝母，来源于川贝母Fritillariacirrhosa D.Don。

知母(生)饮片：购于成都国嘉集团新荷花饮片公司，批号：1002021，1003006，1009047，1008161。

1.2知母饮片水提工艺的考察

1.2.1知母饮片吸水率的考察

取知母饮片50g，3份，各加水300ml，每隔30min观察一次浸透心情况，直至药材全部浸透，滤出全部未被吸收的水液，量取滤液的体积，计算其吸水率约为180％。

1.2.2知母饮片提取工艺的考察

水煎提的主要因素为溶媒用量、浸润时间、提取时间及提取次数等，每个因素选择三个水平，按L9(34)正交表安排试验。每份试验取知母饮片30g，共计9份进行回流提取。由于知母中知母皂苷B II是其主要有效成分，故以知母皂苷B II含量、干膏收得率为指标进行综合评分，根据实际情况并参照常用比例将知母皂苷B II含量和干膏收得率的权重系数分别定为0.6、0.4，从而筛选出最佳提取工艺，正交试验的因素水平见表1。

表1正交试验因素水平

知母皂苷B II的测定参照《中国药典》2010年版一部P197页知母药材项下的含量测定条件进行测定。

色谱条件及系统适用性：岛津LC-10AT高效液相色谱仪，C18 WelchromTM HPLC column(4.6*250mm，5μl)型色谱柱，以乙腈-水(25∶75)为流动相，低温型蒸发光散射检测器(SEDEX 75LT-ELSD)检测，柱温30℃，漂移管温度设为40℃，理论板数按知母皂苷B II峰计算应不低于10000。

样品的处理：称取知母饮片30g，按正交表进行试验，提取液定容至1000ml，精密量取50ml，水浴挥至液体还剩约25ml时，加入硅藻土约10g，搅拌均匀，于70℃烘箱内烘至搅拌时无多余水分，且表面基本干燥，将硅藻土全部转移至具塞锥形瓶内，加入30％丙酮100ml，超声处理30min，滤过，滤液定容至100ml，过0.45μm微孔滤膜，供知母皂苷B II的含量测定用。另精密量取稀释后知母提取液25ml，置于已恒重的蒸发皿内，于水浴上烘干，在105℃烘箱内烘3个小时，取出，置于干燥器内，冷却后称定重量，计算干膏收得率。

试验结果见表2、3。

1.2.2.1知母提取的正交设计及结果

表2正交试验设计及结果

表3正交试验结果分析

结果表明：影响因素D＞C＞A＞B，其中因素D对提取的影响具有显著性。考虑到生产成本及工业化大生产的要求，故确定提取工艺条件为A₁B₁C₁D₃。即知母饮片加6倍量的水，回流提取3次，每次30min。

1.2.2.2知母饮片提取工艺的验证

为了验证上述结果的准确性，以保证提取工艺的合理可行，按上述确定的工艺条件A1B1C1D3，安排重复试验，试验结果如表4。

表4知母提取工艺的验证实验

验证试验结果表明，知母的提取工艺稳定，具有重现性和可操作性。

1.2.3知母提取液浓缩工艺的考察

通过文献查阅及目前药厂的生产现状，考虑到温度对知母皂苷类成分的破坏和影响，故将知母提取液采用减压浓缩的方式进行浓缩，浓缩的温度约为70℃，真空度为-0.07～-0.1Mpa。

1.4本发明成型工艺的考察

1.4.1川贝母粉末粒度的筛选

根据本发明优选的颗粒剂制备工艺设计，川贝母为打粉入药，故所制得的颗粒属于混悬性颗粒剂。根据混悬性颗粒剂的制备要求，对川贝母的粉末粒度进行了考察，结合预试验结果，按照川贝母粉末6g，知母浸膏(相对密度1.35，60℃)4g，糊精4g的配比制粒，参照《中国药典》2010年版一部附录IC颗粒剂制剂通则，对制得的颗粒进行溶化性的考察，结果如表5。

表5川贝母粉末粒度的考察结果

试验结果表明，川贝母过八号筛(150目筛)的粉末制成的颗粒在溶化性检查过程中，混悬情况较优，基本无肉眼可见的沉淀，故最终选择川贝母入药粒度为过八号筛(150目筛)的粉末。

1.4.2知母浸膏相对密度的单因素考察

采用减压浓缩的方式，将知母提取液进行浓缩至相对密度1.1(60℃)，再置于水浴上继续浓缩，结合预试验结果，按照川贝母粉末6g，知母浸膏(不同相对密度，60℃，知母浸膏的用量＝浓缩至一定相对密度后浸膏的总重量/知母药材量×6)，糊精4g的配比制粒，。考察相对密度1.20(60℃)，1.25(60℃)，1.30(60℃)，1.35(60℃)，1.40(60℃)五个相对密度对成型情况的影响，结果如表6。

表6知母浸膏相对密度单因素考察结果

试验结果表明，知母浸膏相对密度1.20(60℃)较稀，成型困难；1.40(60℃)太稠，成型效果亦不佳，能够成型的相对密度在1.25～1.35(60℃)。

实验例2对S180肿瘤的影响实验

1实验材料

1.1药物

照实施例1制备的本发明颗粒剂，使用时以生理盐水配成不同浓度的混悬液。

氟尿嘧啶(5-FU)注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0503271。

无菌生理盐水：四川科伦大药厂有限责任公司，批号B050502-07。

1.2实验动物

昆明种小鼠，体重18-22g，单一性别。由四川省抗菌素研究所实验动物中心提供，符合健康一级动物，动物生产合格证：川实动质第99-31号。

1.3肿瘤细胞

小鼠肉瘤S180细胞，由华西医科大学肿瘤研究所提供。经小鼠腹腔接种传代，液氮冻存。

2实验方法

取冻存S180细胞，复苏后用生理盐水制成细胞悬液，台盼兰排斥法计数活细胞数目，按1～2×10⁶细胞接种于小鼠腹腔内，约7～10天后，小鼠出现明显腹水。取上述腹腔接种肿瘤细胞的小鼠，消毒腹部，无菌抽取腹腔液，1000转离心5分钟，弃去上清，生理盐水洗两次，台盼兰排斥法计数活细胞数目。以生理盐水配成1×10⁷细胞/ml细胞悬液，小鼠右侧腋下皮下注射0.2ml/只。小鼠皮下接种第二天，将其按体重随机分为5组，本发明高中低剂量组分别按4.1g/kg，2.1g/kg，1.05g/kg灌胃给予相应浓度的本发明混悬液。每天1次，连续10天；氟尿嘧啶(5-FU)组按20mg/kg剂量腹腔注射，每天1次，连续7天。对照组连续10天灌胃给予相同体积的生理盐水。末次给药后第二天，分离肿瘤块，称重，计算抑瘤率。

采用SPSS10.0统计软件对瘤重进行单因素方差分析(ONEWAY ANOVA)，并选用双尾Dunnett t检验对各药物组与对照组之间进行比较。

3实验结果

表7本发明对小鼠S180肉瘤的影响

**P＜0.001 vs生理盐水组

如表7所示，本发明各剂量对小鼠肉瘤S180均有较好的抑制效果，其中，低剂量组的抑瘤率甚至超过了常规化疗药5-FU。

4结论：本发明对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用。

实验例3对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生抑制作用研究

1材料与仪器

注射用生理盐水；蒸馏水；种蛋(成都奇强养鸡场)；显微镜(Leica公司)；中性滤纸片；本发明中药组合物(实施例3制备)。

2实验方法

2.1鸡胚孵育

种蛋先用1‰新吉尔灭液擦去表面污渍，再用75％酒精消毒。种蛋应大头(气室端)朝上，与蛋托呈45°角倾斜，孵育于电热培养箱中，温度在37.8℃，培养箱中放一水盘保持相对湿度在40％-70％，留一通气孔，以保证氧气的供应。孵育过程中每天转蛋4次，防止胚胎粘连，促进羊膜运动。

2.2CAM模型制备

2.2.1开窗

孵育第7天，75％的酒精棉球消毒蛋气室(大头端)表面约2cm×3cm区域，再用牙科砂轮磨切蛋壳。待磨出一凹痕后，用眼科弯镊小心夹去蛋壳及壳膜。窗口大小由气室大小决定，一般距气室底边约0.5cm。

2.2.2暴露CAM

开窗后，先用一次性注射器在气室膜上滴一小滴生理盐水，待生理盐水慢慢扩散开时，紧贴在气室膜下面的CAM血管就显现出来，并且在滴生理盐水处下层的CAM与上层的气室膜分离并向下凹陷，此时用注射器针头将此处的气室膜小心推开并挑起，另一只手持眼科弯镊顺势将挑起的气室膜夹住，夹紧，同时在注射器针头的协助下，轻轻将气室膜一点点揭去，使CAM完全暴露。制备假气室时切勿损伤CAM，以免导致微血管出血而影响鸡胚的存活。

2.2.3加药

暴露CAM后，将事先预备好的载体置于CAM中央血管稀少区，以便待测药物充分发挥作用。各组分别用微量加样器滴加药品10μl，然后用透明胶带封贴假气室，形成透明观察窗，观察鸡胚的存活情况。封窗后继续孵育，封窗一定要严密，整个操作过程应尽量保证无菌。

2.4.4制作CAM标本

加药孵育3d，剪开透明胶带纸，由观察窗加入甲醇∶丙酮＝1∶1的固定液5-10滴，预固定15-20min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科弯镊小心地去掉CAM平面以上的卵壳及卵壳膜，并用眼科剪以待测物为中心完整地剪下CAM，将其置于盛有生理盐水的平皿中，用镊子抖展后平铺于载波片上。HE染色，光镜下观察CAM血管结构和观察肿瘤细胞的生长情况、形态学变化及肿瘤区内部新生血管的分布、数量及与周围宿主血管的关系。

2.5血管计数

解剖显微镜下以1×10倍计数新生毛细血管，以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管，凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45°。者均予计数，而穿行、绕行的血管则不算在内。一、二级血管分别观察计数。

2.6药物制备

取本发明中药组合物(实施例3制备)5g，实验前用无菌生理盐水配制成7mg原生药/ml浓度后一次性针头式滤器过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。临用时再用生理盐水在无菌条件下稀释为响应的浓度。以定性滤纸为样品载体，用打孔器制成5mm直径大小的纸片，灭菌冷却后于超净台内，将滤纸排列于无菌铝箔上，分别加入150μl共试液，空白对照组只加入稀释用的蒸馏水。滤纸样品均在超净台内风干。

3实验结果

3.1鸡胚尿囊膜血管面积值和面积比值测定

3.1.1形态学观察：空白组CAM膜与载体盘融合，部分大血管贯穿。低、中、高剂量组均出现大小血管相对分布较少的浅色斑点。低剂量组中，盘周有小血管的密集的现象，中剂量和高剂量组盘周仅有少数细小血管，以点样处为中心呈包绕或放射状分布，血管向载体生长的很少，血管分支明显减少，不呈放射状分布，血管生成明显受抑，各组鸡胚灰度值结果如图1-图7所示。

3.1.2血管面积值和面积比值测定，结果见表8

表8各组鸡胚血管面积值/面积比值比较

注：与空白组比较，**P＜0.01时

结论：由表8可以看出，空白组血管面积值和面积比值较低，而本发明各剂量组该比值均较空白组显著增高，有显著的统计学意义(P＜0.01)，与阳性药物反应停相比没有统计学意义。提示本发明对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生有显著的抑制作用，且呈现出一定的量效关系趋势。

实验例4对小鼠肺癌Lewis肿瘤抑制作用试验及其肺转移的影响实验

1实验材料

1.1药物

本发明由按照实施例1方法制备，使用时以生理盐水配成不同浓度的混悬液。

氟尿嘧啶(5-FU)注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0503271。

无菌生理盐水：四川科伦大药厂有限责任公司，批号B030502-07。

1.2实验动物

C57BL/6小鼠，体重18-22g，雌性，购于上海实验动物中心，符合健康一级动物。

1.3肿瘤细胞：

小鼠Lewis肺癌，由华西医科大学肿瘤研究所提供。以C57BL/6小鼠体内传代，液氮冻存。

2实验方法

取荷瘤Lewis肺癌小鼠，无菌剥离肿瘤块，用小剪刀剪成小块，以生理盐水在100目不锈钢筛网上研磨成细胞悬液，C57BL/6小鼠右侧腋下皮下注射0.2ml/只。接种后第二天，将动物按体重随机分为5组，本发明高中低剂量组分别按4.2g/kg，2.1g/kg，1.05g/kg原生药材灌胃给药。每天1次，连续14天；氟尿嘧啶(5-FU)组按20mg/kg剂量腹腔注射，隔天一次，连续7次。对照组连续12天灌胃给予相同体积的生理盐水。末次给药后第二天，分离肿瘤块，称重，计算抑瘤率；同时分离肺脏，称重，计数肿瘤肺转移的所形成的结节数目

采用SPSS10.0统计软件对瘤重进行单因素方差分析(ONEWAY ANOVA)，并选用双尾Dunnett t检验对各药物组与对照组之间进行比较。

3实验结果

实验结果表明，连续给药12天后，本发明高，中，低剂量组对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用，抑瘤率为31.8％，34.9％，45.7％，与生理盐水对照组相比有显著性差异。同时，本发明各剂量均能够降低肺重，并明显减少肿瘤在肺脏的转移数目。与生理盐水对照组有显著性差异。

表9本发明对小鼠Lewis肺癌及其肺转移的影响

*P＜0.05 vs生理盐水组，**P＜0.01 vs生理盐水组

4结论

本发明在高剂量，中剂量和低剂量对Lewis肺癌有明显的抑制肿瘤瘤体生长的作用。在各剂量组对Lewis肺癌的肺转移数目也有显著的抑制作用。

实验例5本发明对小鼠肝癌H22的肿瘤抑制生长率和转移的影响实验

1实验材料

1.1药物

本发明由按照实施例1方法制备，使用时以生理盐水配成不同浓度的混悬液。

氟尿嘧啶(5-FU)注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0503271。

无菌生理盐水：四川科伦大药厂有限责任公司，批号B060502-07。

1.2实验动物

昆明种小鼠，体重18-22g，单一性别。由四川省抗菌素研究所实验动物中心提供，符合健康一级动物，动物生产合格证：川实动质第99-31号。

1.3肿瘤细胞

小鼠肝癌腹水型H22肿瘤细胞，由华西医科大学肿瘤研究所提供。经小鼠腹腔接种传代，液氮冻存。

2实验方法

取冻存H22细胞，复苏后用生理盐水制成细胞悬液，台盼兰排斥法计数活细胞数目，按1～2×10⁶细胞接种于小鼠腹腔内，约7～10天后，小鼠出现明显腹水。取上述腹腔接种肿瘤细胞的小鼠，消毒腹部，无菌抽取腹腔液，1000转离心5分钟，弃去上清，生理盐水洗两次，台盼兰排斥法计数活细胞数目。以生理盐水配成1×10⁷细胞/ml细胞悬液，小鼠右侧腋下皮下注射0.2ml/只。小鼠皮下接种第二天，将其按体重随机分为5组，本发明高中低剂量组分别按4.1g/kg，2.1g/kg，1.05g/kg原生药材灌胃给予相应浓度的本发明溶液。每天1次，连续10天；氟尿嘧啶(5-FU)组按20mg/kg剂量腹腔注射，每天1次，连续7天。对照组连续10天灌胃给予相同体积的生理盐水。末次给药后第二天，分离肿瘤块，称重，计算抑瘤率；

采用SPSS 10.0统计软件对瘤重进行单因素方差分析(ONEWAY ANOVA)，并选用双尾Dunnett t检验对各药物组与对照组之间进行比较。

3实验结果

如表10所示，本发明在1.8g/kg和0.9g/kg剂量连续给药10天，对小鼠H22肿瘤具有显著的抑制作用，其抑瘤率在40％以上，3.6g/kg组抑瘤率也达到36％，各给药组肿瘤重量与生理盐水对照组相比差异显著。

表10本发明对小鼠H22肿瘤的影响

*P＜0.05 vs生理盐水组，**P＜0.01 vs生理盐水组

4结论

本发明在体内对小鼠H22肿瘤具有良好的抑瘤作用

实验例6本发明对人肺癌细胞A549和原发性肝癌细胞SMMC-7721瘤株体外抑制实验

1仪器、设备及器材

1.1细胞

A549，为人肺癌细胞，购自上海细胞库；SMMC-7721，为人原发性肝癌细胞，购于华西医科大学肿瘤研究所，以RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640+10％小牛血清)，在5％CO₂、37℃传代培养。

1.2主要试剂及其配制

RPMI-1640、胰蛋白酶均为GIBCO产品；MTT、台盼蓝为Sigma产品；DMSO，成都科龙化工试剂厂。

1.3主要仪器

电子分析天平(十万分之一)：赛多利斯BP-210D

低速离心机：北京医用离心机厂。

BIORAD 550型酶联检测仪

BB5060 CO2培养箱：德国HERAEUS。

倒置显微镜：日本OLMPUS产品。

细胞计数板：上海医用光学仪器厂。

96孔细胞培养板，50ml离心管，细胞培养瓶均为FALCON产品。

2供试品和对照品

供试品：本发明中药组合物(实施例2制备)、贝母甲素、贝母乙素、芒果苷和知母皂苷A-III(均为标准品，购自四川省药检所)。上述物质均设成500g/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml 7个浓度组，药物用RPMI-1640完全培养基配成500μg/ml浓度；0.22μm滤膜过滤器过滤除菌，实验时用RPMI-1640完全培养基稀释成相应浓度。

对照品：顺铂注射液：批号：060301，批准文号：国药准字H53021740，由云南个旧生物药业有限公司生产。实验设50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml、0.78125μg/ml7个浓度，实验时用完全培养基稀释成相应浓度。

3实验方法

细胞收集：肿瘤细胞常规传代培养，融合至80％时弃去培养液，加入0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，待细胞变圆成单个时，加入完全培养基，轻吹打贴壁的细胞，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中。1000转/分离心5分钟。弃去上清，加入培养基。台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞浓度至5×10⁴细胞/ml。取96孔板，每孔用移液器加入细胞悬液200μl，使每孔细胞数为1.0×10⁴个。空白对照组只加培养液不加细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

取出培养24h的96孔板，移液器小心吸去上清液，每孔分别加入用完全培养基配制的药物溶液200μl，每个浓度设三个复孔。空白对照加200μl的完全培养基，阳性对照加入顺铂200μl。置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

加入药液培养24h后取出96孔板，先在显微镜下观察细胞生长状况记录，然后小心吸去上清液，每孔用移液枪加入180μl的完全培养基和20μl的MTT(5mg/ml)，37℃、5％CO₂培养箱继续孵育4h，吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl，充分振荡10min溶解，酶标仪490nm处测定OD值。测得的OD值均应减去空白对照的OD值。

4.考察指标

光镜下观察药物作用24h、48h对细胞生长情况的影响。考察T/C＝50％的药物浓度值。即IC₅₀值(生长抑制)

4.数据处理

数据处理以T/C值表示，T/C％＝100％×处理组OD值/对照组OD值，抑制率(％)＝(1-处理组OD值/对照组OD值)×100％，通过回归计算，求出T/C＝50％的药物浓度。

5.实验结果

表11本发明对2种肿瘤细胞体外增殖的影响

对A549，本发明组合物、芒果苷、知母皂苷A-III、知母皂苷A-III∶芒果苷(1∶1)和知母皂苷A-III∶芒果苷∶贝母甲素∶贝母乙素(1∶1∶4∶5.5)抑制作用均非常明显，IC₅₀分别为7.94μg/ml、19μg/ml、17μg/ml、12.96μg/ml和9.05μg/ml；对SMMC-7721，本发明组合物、知母皂苷A-III和知母皂苷A-III∶芒果苷∶贝母甲素∶贝母乙素(1∶1∶4∶5.5)抑制作用均非常明显，IC₅₀分别为11.75μg/ml、25.94μg/ml和13.82μg/ml。

实验例7不同药组对小鼠肺癌Lewis肿瘤抑制作用试验及其肺转移的影响

1实验材料

1.1药物

川贝母组：碎成最细粉(过8号筛)；

浙贝母组：碎成最细粉(过8号筛)；

黄芩组：加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏；

知母组：加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏；

川贝母+知母组：按实施例1的方法制备

浙贝母+知母组(1∶1)：浙贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏，加浙贝母细粉；

黄芩+知母组(1∶1)：加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏；

使用时以生理盐水配成不同浓度的混悬液。

氟尿嘧啶(5-FU)注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0503271。

无菌生理盐水：四川科伦大药厂有限责任公司，批号B030502-07。

1.2实验动物

C57BL/6小鼠，体重18-22g，雌性，购于上海实验动物中心，符合健康一级动物。

1.3肿瘤细胞：

小鼠Lewis肺癌，由华西医科大学肿瘤研究所提供。以C57BL/6小鼠体内传代，液氮冻存。

2实验方法

取荷瘤Lewis肺癌小鼠，无菌剥离肿瘤块，用小剪刀剪成小块，以生理盐水在100目不锈钢筛网上研磨成细胞悬液，C57BL/6小鼠右侧腋下皮下注射0.2ml/只。接种后第二天，将动物按体重随机分为9组，即生理盐水组、5氟尿嘧啶组、川贝母组、浙贝母组、黄芩组、知母组、川贝母+知母组、浙贝母+知母组、黄芪+知母组，每只动物给药为2.1g原生药/kg，给药体积为10ml/kg原生药材灌胃给药，生理盐水组给予等体积的生理盐水，每天1次，连续14天；5氟尿嘧啶(5-FU)组按20mg/kg剂量腹腔注射，隔天一次，连续7次。末次给药后第二天，分离肿瘤块，称重，计算抑瘤率；同时分离肺脏，计数肿瘤肺转移的所形成的结节数目。

采用SPSS10.0统计软件对瘤重进行单因素方差分析(ONEWAY ANOVA)，并选用双尾Dunnett t检验对各药物组与对照组之间进行比较。

3实验结果

见表12，实验结果表明，连续给药14天后，二母颗粒高，中，低剂量组对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用，抑瘤率为31.8％34.9％，45.7％，与生理盐水对照组相比有显著性差异。同时，二母颗粒各剂量均能够降低肺重，并明显减少肿瘤在肺脏的转移数目。与生理盐水对照组有显著性差异。

表12不同药物组合对小鼠Lewis肺癌及其肺转移的影响

与生理盐水组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

与川贝+知母组比较，^△P＜0.05；^△△P＜0.01；^△△△P＜0.001

4结论

川贝母+知母配伍对Lewis肺癌模型有明显的抑制肿瘤瘤体生长和肺转移的作用，二者配伍具有协同作用。且肿瘤生长和转移抑制做强显著优于浙贝+知母和黄芩+知母。

附图说明

图1：阴性对照(空白)鸡胚灰度值；

图2：阳性对照(反应停)鸡胚灰度值；

图3：本发明I组鸡胚灰度值；

图4：本发明II组鸡胚灰度值；

图5：本发明III组鸡胚灰度值；

图6：本发明IV组鸡胚灰度值；

图7：本发明V组鸡胚灰度值；

具体实施方式

下述实施例均可实现本发明的技术效果。

实施例1颗粒剂

川贝母500g    知母500g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉及292g糊精，混匀，加入65％乙醇调整软材湿度后制成颗粒，干燥，即得颗粒剂。

实施例2片剂

川贝母500g    知母300g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加7倍量水煎煮3次，每次40min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.34(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉，混匀，加入片剂常规辅料，按照片剂常规制法即得片剂。

实施例3胶囊剂

川贝母400g    知母700g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮4次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.31(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉，混匀，加入胶囊剂常规辅料，按照胶囊剂常规制法，即得胶囊剂。

实施例4丸剂

川贝母500g    知母750g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加8倍量水煎煮2次，每次60min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.28(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉，混匀，加入丸剂常规辅料，按照丸剂常规制法，即得丸剂。

实施例5口服液

川贝母200g    知母800g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮2次，每次50min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.32(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉，混匀，加入口服液常规辅料，按照口服液常规制法，即得口服液剂型。

实施例6颗粒剂

川贝母800g    知母400g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉及糊精360g，混匀，加入65％乙醇调整软材湿度后制成颗粒，干燥，即得颗粒剂。

实施例7颗粒剂

川贝母500g    知母200g

以上两味，川贝母粉碎成最细粉(过8号筛)，知母饮片加6倍量水煎煮3次，每次30min，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠膏，加入川贝母细粉及糊精210g，混匀，加入65％乙醇调整软材湿度后制成颗粒，干燥，即得颗粒剂。

实施例8片剂

知母皂苷A-III 1g、芒果苷1g、贝母甲素4g、贝母乙素5.5g；

采用常规工艺制成片剂。

Claims (10)

1.一种中药组合物在制备治疗肺癌药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

知母1-10重量份  川贝母2-9重量份。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

知母3-8重量份  川贝母4-7重量份。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

步骤a：取川贝母，粉碎成粉；

步骤b：取知母加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至浸膏；

步骤c：取浸膏，在浸膏中加入川贝母粉，混匀，加入药学辅料制成临床接受的剂型。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

步骤a：川贝母粉碎成最细粉；

步骤b：取知母加4-8重量倍量水煎煮2-4次，每次20-60分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至60℃测相对密度1.25-1.35的浸膏；

步骤c：取浸膏，在浸膏中加入川贝母粉，混匀，加入药学辅料制成临床接受的剂型。

6.一种中药组合物在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

知母1-10重量份  川贝母2-9重量份。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

知母3-8重量份  川贝母4-7重量份。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的原料药由如下中药组成：

9.如权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

步骤a：取川贝母，粉碎成粉；

步骤b：取知母加水煎煮，煎液滤过，滤液浓缩至浸膏；

步骤c：取浸膏，在浸膏中加入川贝母粉，混匀，加入药学辅料制成临床接受的剂型。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：

步骤a：川贝母粉碎成最细粉；

步骤b：取知母加4-8重量倍量水煎煮2-4次，每次20-60分钟，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至60℃测相对密度1.25-1.35的浸膏；

步骤c：取浸膏，在浸膏中加入川贝母粉，混匀，加入药学辅料制成临床接受的剂型。

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