CN102337328A - 一种鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于鉴别猪、牛、羊肉及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供了含有上述引物的试剂盒以及鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法。本发明方法结果准确、灵敏度高，能快速检测市场中生鲜肉类是否掺假，对个体鉴定和溯源研究也具有重要的意义。本发明的鉴别方法只需要一对PCR引物就能对生鲜猪、牛、羊进行种类鉴定，更简单、快速；本发明方法不仅可以快速且灵敏的检测市场中生鲜肉类是否掺假，而且对猪个体鉴定和溯源研究也具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪、牛、羊肉及其制品的鉴别方法，具体地说，涉及一种利用DNA分析鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法。
背景技术
目前，对于特殊动物成分的物种鉴定方法主要有三种：酶联免疫吸附测定法ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay)，显微镜结构分析方法和DNA分析方法。其中，DNA分析方法是一种较新的鉴定方法，该方法运用了PCR扩增技术(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)，这种技术可以在几个小时的时间内将微量的目的基因成百万倍的扩增，非常灵敏，而且操作简单。由于PCR技术具有以上这些优点，近年来建立了大量基于该技术的分析方法，用于鉴定食品中的物种组成。
PCR技术(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，其到达平台期(Plateau)所需的循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
琼脂糖凝胶电泳技术(Agarose gel Electrophoresis)是以琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。电泳法，是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
琼脂糖凝胶电泳的基本原理：琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链在氢键及其它力的作用下使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA(球形)不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。
凝胶电泳产物经EB溴化乙锭染色后在紫外光下观察，初步判断产物的特异性。
本发明通过PCR技术和凝胶电泳技术，利用一对检测引物鉴别生鲜猪牛羊的线粒体DNA，从而将猪、牛、山羊、绵羊区分开来。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鉴别猪、牛、羊及其制品的PCR引物。
本发明的另一目的在于提供含有上述引物的试剂盒。
本发明的目的还在于提供鉴别猪、牛、羊及其制品的方法。
为了实现本发明的目的，本发明的用于鉴别猪、牛、羊及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。
本发明根据NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)的基因组数据库中搜索到的猪、牛、羊的线粒体DNA全序列，选取Sus scrofa、Bos taurus和Ovis aries的线粒体基因组序列，经过Bioedit软件ClustalW Multiple alignment程序分析，从比对结果中找到保守区域，在保守区域设计引物，并且选择低保守高特异区为扩增区域，通过primer premier 5软件评估引物对，从而选出本发明的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。
本发明还提供含有上述引物的用于鉴别猪、牛、羊肉及其制品的试剂盒。
所述试剂盒还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
本发明的鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法，包括如下步骤：
1)提取样品DNA；
2)以样品DNA为扩增模板，用上述引物进行PCR扩增；
其中，PCR扩增体系具体为(25μL反应体系)：上述上下游引物各0.5μL(终浓度10mM)、0.125μLGo tag DNA聚合酶(Promga)、5μL5×Buffer、2μLdNTPs(2.5mM)、16.38μL无菌双蒸水、0.5μL样品DNA；
3)然后经重量体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压为150～300V；电泳结束后，将凝胶置于EB染缸，20min后在紫外光照射下成像。
其中，步骤2)中的PCR反应程序为：95℃5min、94℃30s、50℃30s、72℃30s，进行35个循环；72℃7min。
步骤1)提取样品DNA的具体步骤如下：用剪子将肉样剪碎后在研钵中研磨，取0.1g样品放入2mL离心管中，加入1mL CTAB提取液(CTAB 20g/L、NaCl 1.4mol/L、Tris 0.1mol/L、Na2EDTA0.02mol/L、PH＝8.0)和20μL 20mg/mL蛋白酶K水溶液，充分震荡，65℃水浴0.5～1h，不时震荡；降至室温后以12000g离心15min；取上清液转移至新离心管中，加入等体积的酚和氯仿/异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，充分震荡后，以12000g离心10min；取上清液并转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，充分震荡后，以12000g离心10min；取上清液并转移至新离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和2/3倍体积的异丙醇，离心管放入-20℃静置2h以上；然后以12000g离心15min，倒去液体部分留下沉淀，用70％(体积)乙醇洗涤并在空气中干燥沉淀，然后用100μL无菌水溶解。
本发明所述样品，猪肉、牛肉样品均为市售，羊肉样品采自内蒙古宝昌的屠宰场，所有样品均置于-20℃冷冻保存。
本发明选择猪、牛、羊的线粒体DNA作为检测的靶基因，其原因是：(1)线粒体DNA在动物细胞内有大量的拷贝数，在取等量的肉样DNA进行PCR检测时，线粒体基因的模板数大大高于细胞核染色体基因模板数，这就大大提高了PCR检测的敏感度；(2)许多动物线粒体基因组已被完全测序，不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域，本实验根据猪牛羊线粒体基因中高度保守的区域设计引物，而且所选引物产生的特异片段存在于低度保守区域，从而能够鉴别三种生鲜肉类，检测的灵敏度高。
本发明的鉴定方法只限于生鲜肉类及其生鲜制品的鉴定，不能用于肉类加工食品中复杂动物成分的鉴定。
本发明的优点在于，本发明的鉴别方法只需要一对PCR引物就能对生鲜猪、牛、羊进行种类鉴定，相对于分别用不同引物进行猪、牛、羊种类鉴定的现有鉴别方法，本发明方法更简单、快速；基于本发明方法，不仅可以快速且灵敏的检测市场中生鲜肉类是否掺假，而且对猪个体鉴定和溯源研究也具有重要的意义。
附图说明
图1为不同生鲜肉类基因组DNA的PCR扩增结果，其中1为猪肉、2为牛肉、3为山羊肉、4为绵羊肉；并以100bp ladder作为分子量标准，片段大小为：1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp。
图2为不同浓度的生猪肉基因组DNA的PCR扩增结果，其编号1～9的浓度分别为128ng/μL、12.9ng/μL、1.0ng/μL、0.5ng/μL、128pg/μL、64pg/μL、42pg/μL、32pg/μL、25pg/μL。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)提取样品DNA：取0.1g样品，用剪子将肉样剪碎后在研钵中研磨，并转移至2mL的离心管中，向离心管中加入1mL CTAB提取液(CTAB 20g/L、NaCl 1.4mol/L、Tris 0.1mol/L、Na2EDTA0.02mol/L、PH＝8.0)和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分震荡离心管后，65℃水浴1h，不时震荡；降至室温后以12000g离心15min；取上清后转移至新离心管中，加入等体积的酚和氯仿/异戊醇混合溶剂(氯仿与异戊醇的体积比为24∶1)，充分震荡离心管后，以12000g离心10min；混合液分层后取上层清液并转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合溶剂(氯仿与异戊醇的体积比为24∶1)，充分震荡离心管后，以12000g离心10min；取上层清液并转移至新离心管中，加入1/10倍体积的NaAc(浓度为3mol/L)和2/3倍体积异丙醇，离心管放入-20℃静置2h以上或过夜；以12000g离心15min后，倒去液体部分留下沉淀，用70％(体积)乙醇洗涤并在空气中干燥DNA沉淀，向沉淀中加入100μL无菌水溶解。
2)以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为上游引物；以SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列为下游引物，以步骤1)的样品DNA为扩增模板进行PCR反应；
PCR扩增体系为(25μL反应体系)：上述上下游引物各0.5μL(终浓度10mM)、0.125μL Go tag DNA聚合酶(Promga)、5μL5×Buffer、2μLdNTPs(2.5mM)、16.38μL无菌双蒸水、0.5μL样品DNA；
3)然后经重量体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压150V；电泳结束后，将凝胶置于EB染缸，20min后在凝胶成像体统的紫外光照射下成像。
实施例2PCR扩增结果
分别以猪肉、牛肉、山羊肉及绵羊肉为样品，用实施例1方法分别对上述样品进行检测，结果如图1所示。
结果表明，四种样品PCR扩增后均能得到单一的DNA条带，并且猪、牛、羊的DNA扩增条带大小不一，和期望的片段大小一致(如表1所示)。
表1用于物种线粒体特异片段扩增的寡核苷酸序列
实施例3灵敏度分析
以生猪肉样品不同稀释度的DNA为模板(浓度分别为128ng/μL、12.9ng/μL、1.0ng/μL、0.5ng/μL、128pg/μL、64pg/μL、42pg/μL、32pg/μL、25pg/μL)，按实施例1方法进行PCR扩增。结果如图2所示。
结果表明，当25μL反应体系中含有生猪肉基因组DNA25pg时，经过35个循环的扩增，电泳后EB染色能在紫外光下成像，能见到明显的目的条带。
实施例4测序验证
分别以猪肉、牛肉、山羊肉及绵羊肉为样品，按实施例1方法对其基因组DNA进行PCR扩增；PCR产物直接测序验证，得到的序列在NCBI中进行Blast比对，结果符合真实性。猪、牛、山羊及绵羊的线粒体DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3～6所示。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及试验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.用于鉴别猪、牛、羊肉及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。
2.含有如权利要求1所述引物的用于鉴别猪、牛、羊肉及其制品的试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
4.一种鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取样品DNA；
2)以样品DNA为扩增模板，用权利要求1所述引物进行PCR扩增；
3)然后经重量体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压为150～300V；电泳结束后，将凝胶置于EB染缸，20min后在紫外光照射下成像。
5.如权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，步骤2)中的PCR反应程序为：95℃5min、94℃30s、50℃30s、72℃30s，进行35个循环；72℃7min。
6.如权利要求4或5的鉴别方法，其特征在于，步骤1)的具体步骤如下：用剪子将肉样剪碎后在研钵中研磨，取0.1g样品放入2mL的离心管中，加入1mL CTAB提取液和20μL20mg/mL蛋白酶K水溶液，充分震荡，65℃水浴0.5～1h，不时震荡；降至室温后以12000g离心15min；取上清液转移至新离心管中，加入等体积的酚和氯仿/异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，充分震荡后，以12000g离心10min；取上清液并转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，充分震荡后，以12000g离心10min；取上清液并转移至新离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和2/3倍体积的异丙醇，离心管放入-20℃静置2h以上；然后以12000g离心15min，倒去液体部分留下沉淀，用70％乙醇洗涤并在空气中干燥沉淀，然后用100μL无菌水溶解。
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