CN102337276B - 水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因OsFIE2，其具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。该基因在水稻花，根和叶等生殖，营养器官普遍表达。该基因编码376个氨基酸大小的蛋白，其中含有6个WD40功能域，是Polycomb家族蛋白成员之一。该基因参与抑制水稻胚乳的自主发生，对种子的形成也有重要的调控作用；与此同时，它也参与控制水稻叶形态和根系建成。本发明克隆的基因可通过基因工程技术改善植物根，叶，花及种子发育和生长情况。最终实现创造基因工程产量改良新品系及促进水稻雄性不育系选育的目的。

Description

水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因OsFIE2的克隆和应用。通过克隆，RNA干涉和转基因技术，将其应用于研究基因在调控种子中胚乳发育及根叶的形态建成中的功能和作用，达到创造基因工程产量改良新品系及促进水稻雄性不育系选育的目的。

背景技术

水稻是当前研究的模式植物，也是世界上最重要的两大粮食作物之一。水稻营养价值高，我国有60％以上的人口，亚洲有4/5以上的人口以稻米为主食。随着我国人口的不断增加，与此同时，人均耕地却不断减少，如何保证中国的粮食安全已成为当前水稻生产中的热点难点问题。利用水稻的杂种优势及现代分子生物学技术，培育高产、抗病良种水稻是解决这一问题的主要途径。

水稻产量高低直接取决于种子的生长发育情况，研究有关调控种子生长发育的基因有助于解决水稻产量问题。胚乳是水稻种子中的主要组成成分，对胚乳生长发育起调节作用功能的基因可能是影响种子发育的关键因素。在水稻中，我们对这些基因却知之甚少。1999年，有关调控胚乳发育的基因在拟南芥中首次被发现，它抑制胚乳的自主发育。该基因属于Polycomb大家族的一个成员，Polycomb家族(PcG)是一类广泛存在于植物和动物中的表观遗传抑制基因，它们对维持发育相关基因的阻遏状态、 细胞增殖调控及细胞特性维持等许多发育，除了拟南芥以外，目前在小表，玉米和水稻中均发现了该家族的同源基因，但没有报道出这些基因有在拟南芥中类似的调控胚乳发育作用的功能及应用前景。由于其在拟南芥中对胚乳发育有着特殊的调控作用，故研究者将该基因命名为拟南芥不依赖于受精的胚乳自主发生基因（AtFIE），它在拟南芥中只有一个成员，但在玉米和水稻中却有两个成员，分别为ZmFIE1,ZmFIE2和OsFIE1,OsFIE2。

本发明分离并鉴定了一个水稻不依赖于受精的胚乳自主发生基因OsFIE2。该基因在水稻花，根和叶等生殖，营养器官普遍表达，同时也在胚乳中表达。通过RNA干涉及转基因技术，研究发现该基因参与控制水稻叶形态和根系建成，同时也参与抑制水稻胚乳的自主发生。OsFIE2对种子的形成有重要的调控作用，可将其应用于产量改良品系的开发。另外，OsFIE2影响花粉活力，也可将其应用于选育水稻不育系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不依赖于受精的胚乳自主发生基因及其功能应用。

本发明从水稻中分离得到OsFIE2基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，序列全长1601bp。基因含有13个外显子，编码含376个氨基酸的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，且该蛋白含有6个保守的WD40功能域。

本领域技术人员可以将本发明基因结合RNAi技术构建该基因的RANi载体，进一步可将该载体导入植物表达载体，获得靶向OsFIE2基因的RANi重组表达载体（特异性抑制OsFIE2的表达），进而获取含有此载体的转基因植株。因此，本发明还包括由上述基因构建的RANi重组表达载体（图2），以及含有上述重组载体转基因植株。

实验验证含有RANi重组载体转基因植株中OsFIE2基因表达确实被下调（图3a,b），达到了抑制OsFIE2基因的目的，且转基因植株表型与目的基因的表达量具相关性(图3c,d)。通过观察T0及T1代RANi重组载体转基因植株表型，结果表明OsFIE2基因影响开花时间及花器官正常发生（图4），参与控制水稻叶形态和根系建成（图5，6），尤其在种子胚乳中有重要作用，RNAi株系种子可自主发育，且发育成比正常子粒更大的子粒（图4G）。我们同时还发现OsFIE2基因影响着花粉的活性（花粉败育率高达25%，正常不超过5%）。总之，OsFIE2基因控制着水稻营养和生殖两方面的生长和发育，尤其在生殖生长方面（花粉育性和种子发育）的调控作用有着较大的应用前景和实用价值。

本发明的优点和效果：

本发明的基因在各组织中普遍表达，可以用于基因在种子生长，花和根叶等器官形态建成调控中的研究及产量改良，尤其该基因在花粉及胚乳中的表达影响水稻花粉育性和种子发育可将其应用于水稻不育系的选育和水稻米粒大小改进及水稻产量提升。

附图说明

图1 为OsFIE2基因结构及半定量PCR检测OsFIE2在水稻不同部位的表达量，图1a中E表示基因外显子区，其余为基因内含子区；图1b中1-7分别为水稻不同组织及器官，1为成熟种子，2为萌发后四天的叶子，3为萌发后四天的根，4为开花前的稻穗，5为开花后的稻穗，6为花药， 7为授粉三天后的子房，GADPH为内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶C基因。

图2为RANi重组表达载体构建过程，其中图2A为 pKANNIBAL上的反向重复构建简图，RNAi片段分别通过XbaI、HindIII和XhoI、EcoRI插入pKANNIBAL载体；图2B、图2C分别为pAHC17和pCAMBIA1301载体图谱；图2D为水稻过表达转化和RNAi转化载体构建简图。

图3为 OsFIE2 基因表达受到抑制的分子生物学鉴定及表达量与表型的相关性统计。A为对照(1) 和不同RNAi 株系（RNAi-8(2), 2-1(3) 和 1-9(4)）中 OsFIE2 基因在转录水平上的表达差异情况, b为对照(1) 和不同RNAi 株系（RNAi-8(2), 2-1(3) 和 1-9(4)）中 OsFIE2 基因在蛋白水平上的表达差异情况，c和d为分别不同株系转录水平表达差异的统计比较与对应株系主根长度的统计比较。

图4为转化RNAi载体后转基因水稻在生殖生长过程中的表现型。A，同时期对照株系（左）与OsFIE2RNAi转基因株系（右）株高的比较；B-D，来自对照株系（B）与OsFIE2RNAi转基因株系花粉形态的比较（D），C为B的DAPI染色图；E，F，G 分别为来自对照株系（左）与OsFIE2RNAi转基因株系（右）的花，未受精子房及受精子房形态比较。B中标尺长度为5µm，E中标尺长度为3mm。

图5转化RNAi载体后转基因水稻在叶开态建成过程中的表现型。A，为对照植株叶片；B-D均为OsFIE2RNAi转基因株系叶片；E，为对照株系叶片的横切面图F，为OsFIE2RNAi转基因株系的叶片的横切面图。A-D 中标尺长度为1cm, E–F 中标尺长度为50µm。

图6转化RNAi载体后转基因水稻在根系发育过程中的表现型。A，对照株系与OsFIE2RNAi转基因株系种子萌发情况；C，D为对照株系与OsFIE2RNAi转基因株系的根系对比；E，F为对照株系与OsFIE2RNAi转基因株系种子萌发三天后主根根尖透明观察情况；G，为野生型与OsFIE2RNAi转基因株系主根长度的统计比较；H，为野生型与OsFIE2RNAi转基因株系侧根长度的统计比较。A中标尺长度为2 cm , B中标尺长度为1 cm, C–D 中标尺长度为50µm, E, F 中标尺长度为100 µm。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1: 基因OsFIE2的分离和鉴定

发明人利用拟南芥不依赖于受精的胚乳自主发生基因AtFIE的保守区设计引物，再用RACE对其基因序列进行分段扩增，对3’RACE和5’RACE扩增片段进行拼接成cDNA，最后得到了1601bp的基因全长序列。

分别利用3'-RACE CDS Primer A：（5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N – 3'）（SEQ ID No. 4）和5'-RACE CDS Primer（5' – (T)25V N – 3'）（SEQ ID No. 5）及借助美国Clontech公司的BD SMART™ RACE cDNA Amplification试剂盒进行OsFIE2基因序列扩增（具体操作按照试剂盒说明进行），分别分离出了OsFIE2的5’端和3’端核酸序列。在RACE后，利用PCR产物回收试剂盒对RACE产物进行回收，进一步利用Promega公司pGEM®-T试剂盒进行PCR产物的克隆，最后通过转化，质粒酶切鉴定后测序得到OsFIE2序列内容。

将各个片段的序列拼接起来得到了该基因的cDNA序列全长。在NCBI megablast database上进行核酸序列比较，利用mRNA与水稻基因组序列比，结果表明该基因全长含有1601 bp，其转录本mRNA是由13个外显子组成，在起始密码子上游有两个连续的终止密码子TAG，并编码一个376氨基酸的蛋白质。OsFIE1 蛋白含有 6 个 WD40 功能域。

实施例 2 ： OsFIE2 基因在水稻中的表达

以水稻品种日本晴为材料，取其种子、根、叶、叶鞘以及花药。用Invitrogen的TRIzol提取总RNA，再用Fermentas的RevertAid^TM first strand cDNA synthesis kit反转合成cDNA第一链。对不同材料的OsFIE2进行PCR检测。PCR 反应条件是：94℃ 2min；94℃ 5sec，58℃ 10sec，72℃ 10 sec，40个循环。以GADPH及Ubiquitin为内参基因，相对定量结果显示，OsFIE2在营养生长及生殖生长过程中广泛表达（图1b）。在检测过程中各基因PCR引物如下：

实施例3：OsFIE2功能分析

本发明的实施方案就是构建OsFIE2基因RNAi重组表达载体并转化到水稻品种日本晴，以达到在植株体内降低该基因表达的目的，最终揭示OsFIE2在水稻中的功能。具体操作如下：

首先，将含有泛素（Ubi1）启动子的载体pAHC17 (Christensen and Quail, 1996，Ubiquitin promoter-based vectors for high level expression of selectable and or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5:213–218)用HindIII 和 EcoRI进行部分酶切。将启动子区和Nos 终止区通过以上两个酶切位点插入pCAMBIA 1301载体（Cambia，见图2B），做成pAHC17- pCAMBIA 1301载体。以水稻品种日本晴为材料，取其种子、根、叶、叶鞘以及花药。用Invitrogen的TRIzol提取总RNA，再用Fermentas的RevertAidTM first strand cDNA synthesis kit反转合成cDNA第一链。分别用引物对5’-CTCGAG GAGTACAAGGCGTGCAAC-3’和5’-GAATTC GGCCAGAATTCCTTCATT-3’及引物对5’-TCTAGA GAGTACAAGGCGTGCAAC-3’和5’-AAGCTT GGCCAGAATTCCTTCATT-3’，即扩增SEQ ID No.3所示的序列。然后，将扩增好的dsRNAi片段分别反向插入pKANNIBAL（澳大利亚CSIRO植物研究机构）中间载体内含子的两端(见图2A)。用添加了BamHI位点的引物扩增整个反向重复结构，并插入pAHC17-pCAMBIA 1301载体做成最终的RNAi重组载体。构建的简图见图2C，通过酶切验证阳性克隆后电转农杆菌EHA105。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法（Hiei 等，1994， Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6:271-282）将OsFIE2RNAi重组载体载体导入水稻粳稻(japonica)品种日本晴(Oryza sativa cv. Nipponbare)。作为对照，35S-eGFP片段在HindIII-EcoRI的酶切作用下插入到pCAMBIA 1301载体中，将这些载体进行水稻转基因。

将获得的转基因阳性植株进行表达鉴定，在确认目的基因被抑制表达后（图3）对转基因植株各阶段生长情况的表型对比观察。

观察结果表明该基因影响开花时间及花器官正常发生（图4），参与控制水稻叶形态和根系建成（图5，6），同时也参与抑制水稻胚乳的自主发生。OsFIE2对种子的形成也有重要的调控作用，RNAi株系中由于OsFIE2基因表达受到抑制，胚乳能够自主发育，其种子发育较对照要快，最终形成比正常子粒要大的种子。因此结合OsFIE2基因与RNAi技术可得到较大米粒的水稻种子（图4G），在水稻产量提高方法有较大应用前景。另外，在RNAi株系中出现花粉败育率较高情况可应用于水稻不育系选育。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 不依赖于受精的胚乳自主发生基因及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1131)

<400> 1

atg gcg aag ctg ggg ccg ggg cag ggg ctg ggg tgc gag gcg gcg gtg 48

Met Ala Lys Leu Gly Pro Gly Gln Gly Leu Gly Cys Glu Ala Ala Val

1 5 10 15

ggg ttg ctg gcg cca agc agg aag agg gag tac aag gcg tgc aac aag 96

Gly Leu Leu Ala Pro Ser Arg Lys Arg Glu Tyr Lys Ala Cys Asn Lys

20 25 30

ctc acc gag ggg aag cgg ccg ctc tac gcc atc gga ttc aac ttc ctc 144

Leu Thr Glu Gly Lys Arg Pro Leu Tyr Ala Ile Gly Phe Asn Phe Leu

35 40 45

gac ttc cac tac tac gag gtc ttc gcc acc gtc ggc ggc aac cgc gtg 192

Asp Phe His Tyr Tyr Glu Val Phe Ala Thr Val Gly Gly Asn Arg Val

50 55 60

aca acc tac agc tgc ctc aag gat ggt aat ttt gct atc ctg caa gca 240

Thr Thr Tyr Ser Cys Leu Lys Asp Gly Asn Phe Ala Ile Leu Gln Ala

65 70 75 80

tat att gat gag gat aag gat gaa tcg ttc tac aca ctg agt tgg gct 288

Tyr Ile Asp Glu Asp Lys Asp Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Ser Trp Ala

85 90 95

tgt gat ctt gat ggc aca ccg ctg tta gtg gct gca gga agc aat ggg 336

Cys Asp Leu Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Ala Ala Gly Ser Asn Gly

100 105 110

atc att cgg gtc atc aac tgt gcc act gag aag tta ctc aag act ttt 384

Ile Ile Arg Val Ile Asn Cys Ala Thr Glu Lys Leu Leu Lys Thr Phe

115 120 125

gtt ggc cat ggc gat tca ata aac gag ata aga act caa gca tta aag 432

Val Gly His Gly Asp Ser Ile Asn Glu Ile Arg Thr Gln Ala Leu Lys

130 135 140

cct tcg ctc atc att tct gca agc aag gat gaa tct gtt agg ctg tgg 480

Pro Ser Leu Ile Ile Ser Ala Ser Lys Asp Glu Ser Val Arg Leu Trp

145 150 155 160

aat gtt cac aca ggg atc tgc att ttg att ttt gct gga gca gga ggt 528

Asn Val His Thr Gly Ile Cys Ile Leu Ile Phe Ala Gly Ala Gly Gly

165 170 175

cac cgg aat gaa gta ttg agt gtt gac ttc cac cca tct gat atc tac 576

His Arg Asn Glu Val Leu Ser Val Asp Phe His Pro Ser Asp Ile Tyr

180 185 190

cgc ata gca agt tgt ggc atg gat aac act gtt aaa ata tgg tca atg 624

Arg Ile Ala Ser Cys Gly Met Asp Asn Thr Val Lys Ile Trp Ser Met

195 200 205

aag gaa ttc tgg cca tat gtt gag caa tcc ttt aca tgg act gac ctt 672

Lys Glu Phe Trp Pro Tyr Val Glu Gln Ser Phe Thr Trp Thr Asp Leu

210 215 220

cca tca aaa ttt cca aca aaa tat gtg caa ttt ccg gtc ttg gtt gct 720

Pro Ser Lys Phe Pro Thr Lys Tyr Val Gln Phe Pro Val Leu Val Ala

225 230 235 240

gta gta cat tct aac tat gtt gat tgt act aga tgg ctt ggt gac ttc 768

Val Val His Ser Asn Tyr Val Asp Cys Thr Arg Trp Leu Gly Asp Phe

245 250 255

att ctg tca aag agt gtt gac aat gaa att gtg ctg tgg gag cca aaa 816

Ile Leu Ser Lys Ser Val Asp Asn Glu Ile Val Leu Trp Glu Pro Lys

260 265 270

aca aaa gaa caa agt ccc ggg gag ggt agc att gat att ctt cag aag 864

Thr Lys Glu Gln Ser Pro Gly Glu Gly Ser Ile Asp Ile Leu Gln Lys

275 280 285

tat cct gtg cca gaa tgt gat atc tgg ttt atc aaa ttc tca tgc gat 912

Tyr Pro Val Pro Glu Cys Asp Ile Trp Phe Ile Lys Phe Ser Cys Asp

290 295 300

ttt cac ttc aat caa ttg gca ata ggc aac cgt gaa gga aaa gtc ttt 960

Phe His Phe Asn Gln Leu Ala Ile Gly Asn Arg Glu Gly Lys Val Phe

305 310 315 320

gtc tgg gaa gta cag tcc agt cct cct gtt tta act gct cgg ctg act 1008

Val Trp Glu Val Gln Ser Ser Pro Pro Val Leu Thr Ala Arg Leu Thr

325 330 335

aat ccg caa tgc aaa tct gcg ata agg cag act gcc gtg tca ttt gat 1056

Asn Pro Gln Cys Lys Ser Ala Ile Arg Gln Thr Ala Val Ser Phe Asp

340 345 350

gga agc aca atc ctt gcc tgc agc gag gat ggc agc ata tgg cga tgg 1104

Gly Ser Thr Ile Leu Ala Cys Ser Glu Asp Gly Ser Ile Trp Arg Trp

355 360 365

gat gaa gtg gac cat cca aaa gca tga 1131

Asp Glu Val Asp His Pro Lys Ala

370 375

<210> 2

<211> 376

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Lys Leu Gly Pro Gly Gln Gly Leu Gly Cys Glu Ala Ala Val

1 5 10 15

Gly Leu Leu Ala Pro Ser Arg Lys Arg Glu Tyr Lys Ala Cys Asn Lys

20 25 30

Leu Thr Glu Gly Lys Arg Pro Leu Tyr Ala Ile Gly Phe Asn Phe Leu

35 40 45

Asp Phe His Tyr Tyr Glu Val Phe Ala Thr Val Gly Gly Asn Arg Val

50 55 60

Thr Thr Tyr Ser Cys Leu Lys Asp Gly Asn Phe Ala Ile Leu Gln Ala

65 70 75 80

Tyr Ile Asp Glu Asp Lys Asp Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Ser Trp Ala

85 90 95

Cys Asp Leu Asp Gly Thr Pro Leu Leu Val Ala Ala Gly Ser Asn Gly

100 105 110

Ile Ile Arg Val Ile Asn Cys Ala Thr Glu Lys Leu Leu Lys Thr Phe

115 120 125

Val Gly His Gly Asp Ser Ile Asn Glu Ile Arg Thr Gln Ala Leu Lys

130 135 140

Pro Ser Leu Ile Ile Ser Ala Ser Lys Asp Glu Ser Val Arg Leu Trp

145 150 155 160

Asn Val His Thr Gly Ile Cys Ile Leu Ile Phe Ala Gly Ala Gly Gly

165 170 175

His Arg Asn Glu Val Leu Ser Val Asp Phe His Pro Ser Asp Ile Tyr

180 185 190

Arg Ile Ala Ser Cys Gly Met Asp Asn Thr Val Lys Ile Trp Ser Met

195 200 205

Lys Glu Phe Trp Pro Tyr Val Glu Gln Ser Phe Thr Trp Thr Asp Leu

210 215 220

Pro Ser Lys Phe Pro Thr Lys Tyr Val Gln Phe Pro Val Leu Val Ala

225 230 235 240

Val Val His Ser Asn Tyr Val Asp Cys Thr Arg Trp Leu Gly Asp Phe

245 250 255

Ile Leu Ser Lys Ser Val Asp Asn Glu Ile Val Leu Trp Glu Pro Lys

260 265 270

Thr Lys Glu Gln Ser Pro Gly Glu Gly Ser Ile Asp Ile Leu Gln Lys

275 280 285

Tyr Pro Val Pro Glu Cys Asp Ile Trp Phe Ile Lys Phe Ser Cys Asp

290 295 300

Phe His Phe Asn Gln Leu Ala Ile Gly Asn Arg Glu Gly Lys Val Phe

305 310 315 320

Val Trp Glu Val Gln Ser Ser Pro Pro Val Leu Thr Ala Arg Leu Thr

325 330 335

Asn Pro Gln Cys Lys Ser Ala Ile Arg Gln Thr Ala Val Ser Phe Asp

340 345 350

Gly Ser Thr Ile Leu Ala Cys Ser Glu Asp Gly Ser Ile Trp Arg Trp

355 360 365

Asp Glu Val Asp His Pro Lys Ala

370 375

<210> 3

<211> 563

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

gagtacaagg cgtgcaacaa gctcaccgag gggaagcggc cgctctacgc catcggattc 60

aacttcctcg acttccacta ctacgaggtc ttcgccaccg tcggcggcaa ccgcgtgaca 120

acctacagct gcctcaagga tggtaatttt gctatcctgc aagcatatat tgatgaggat 180

aaggatgaat cgttctacac actgagttgg gcttgtgatc ttgatggcac accgctgtta 240

gtggctgcag gaagcaatgg gatcattcgg gtcatcaact gtgccactga gaagttactc 300

aagacttttg ttggccatgg cgattcaata aacgagataa gaactcaagc attaaagcct 360

tcgctcatca tttctgcaag caaggatgaa tctgttaggc tgtggaatgt tcacacaggg 420

atctgcattt tgatttttgc tggagcagga ggtcaccgga atgaagtatt gagtgttgac 480

ttccacccat ctgatatcta ccgcatagca agttgtggca tggataacac tgttaaaata 540

tggtcaatga aggaattctg gcc 563

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> v is A, G, or C

<222> (57)..(57)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttvn 57

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> v is A, G, or C

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tttttttttt tttttttttt tttttvn 27

Claims (2)

1.序列如SEQ ID No.3所示的RNAi片段在促进水稻侧根发育中的应用，其是采用RNAi技术使OsFIE2基因沉默，所述OsFIE2基因编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsFIE2基因的核苷酸序列为1）SEQ ID No.1所示的序列；或，2）由SEQ ID No.1所示序列产生的cDNA序列。

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