CN102312002A

CN102312002A - 一种快速检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒

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Publication number: CN102312002A
Application number: CN201110279225A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 童永清
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明涉及一种快速检测BRCA1基因mRNA的荧光定量PCR诊断试剂盒，包BRCA1基因引物，内参基因GAPDH引物和Taqman荧光探针。BRCA1是重要的抑癌基因，它编码的蛋白在DNA损伤和修复中扮演重要角色。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测BRCA1mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。该试剂盒为临床恶性肿瘤患者是否使用铂类化疗药物以及抗微管类药物提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

Description

一种快速检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用荧光定量PCR技术快速检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

铂类化合物是最常使用的肿瘤化疗药物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等，具有抗癌谱广、作用强等特点。由于铂类药物通过广泛结合DNA，导致DNA链间交链或链内交链，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡而实现抗癌目的。临床运用表明铂类药物的疗效存在显著的个体差异，铂类细胞毒性化疗药物对肿瘤损伤后，肿瘤细胞的DNA修复机制启动，具有较高修复能力的肿瘤细胞易于对化疗耐药。BRCA1在DNA修复中起重要作用，与铂类耐药关系密切，即BRCA1基因表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。研究发现BRCA1基因表达水平的高低与乳腺癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌的发病、生物学特性以及预后均有关。有文献报告，在接受铂类药物化疗较晚期的非小细胞肺癌患者中，BRCA1阳性表达者较阴性表达者预后差，BRCA1的高表达是导致肿瘤细胞对铂类药物耐药的最重要的机制之一。

微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类化疗药。目前常用的抗微管类药物主要有：紫杉醇、多西紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨等。抗微管类药物的抗癌谱很广，是使用最为广泛的抗肿瘤药物。但在临床应用中，却时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。

BRCA1的mRNA低表达的患者接受铂类化疗后的生存期比高表达患者显著增长，而在BRCA1 mRNA高表达的患者中，接受紫杉醇/铂类化疗的比只接受铂类化疗的患者生存期延长。因此，BRCA1基因表达的检测适应了肿瘤个体化治疗这种要求，对化疗药物选择具有指导意义。而荧光定量PCR检测BRCA1的mRNA水平比应用免疫组化定量检测BRCA1蛋白含量其敏感性及特异性均较高。

目前尚无文献报告有关检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测BRCA1基因mRNA表达量的试剂盒。

本发明的试剂盒利用荧光定量PCR技术，包含BRCA1基因引物、内参基因(GAPDH)引物和Taqman荧光探针：

BRCA1基因上游引物序列为：5’-ATGGGCCCTTCACCAACA-3’；

BRCA1基因下游引物序列为：5’-CACAGAAGCACCACACAGCTGTA-3’；

Taqman荧光探针：6FAM 5’-ATCAACTGGAATGGATG-3’TAMRA；

GAPDH基因上游引物序列为：5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’；

GAPDH基因下游引物序列为：5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’；

Taqman荧光探针：6FAM 5’-CAGGAGCGAGATCC-3’TAMRA。

所述的试剂盒还包括进行荧光定量PCR所需的试剂，具体包括：第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。

其中的第一链cDNA合成试剂为：25mmol/L MgCl₂ 4μl，10×逆转录酶缓冲液2μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂0.5μl，Oligo(dT)₁₅ 0.5μg，AMV逆转录酶15U，无RNase去离子水。

其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有BRCA1总RNA样品为阳性对照。

其中的PCR反应液包括：10×PCR反应混合液、0.25pmol/μl的引物(BRCA1基因引物和内参基因引物)、0.3pmol/μl的荧光探针、2.5～4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2～0.4mM的dNTPs、0.2～1U的UNG酶、0.3～0.6mM dUTP、通常取1～2μl的模板。

用本发明的试剂盒检测BRCA1基因mRNA表达量：首先获取临床肿瘤组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成第一链cDNA；然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。分别计算BRCA1及GAPDH基因的CT值，两者之差即为ΔCt值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。

本发明试剂盒的优点和有益效果如下：

(1)敏感：荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。

(2)特异：使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。

(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。

(4)快速：速度快、高通量，可在3～4小时完成。

附图说明

图1为荧光实时定量PCR检测BRCA1基因标准品的荧光曲线图，纵坐标为荧光强度，横坐标为循环次数。

图2为根据BRCA1基因标准品的荧光曲线图得到的标准曲线，纵坐标为循环次数，横坐标为荧光强度的对数值。

图3为荧光实时定量PCR检测GAPDH标准品的荧光曲线图，纵坐标为荧光强度，横坐标为循环次数。

图4为根据GAPDH标准品的荧光曲线图得到的标准曲线，纵坐标为循环次数，横坐标为荧光强度的对数值。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1.本发明试剂盒的制备

(1)本发明试剂盒组成如下：

①Trizol：快速提取癌组织RNA；

②第一链cDNA合成试剂盒(RT-PCR)；包括25mmol/L MgCl₂ 4μl，10×逆转录酶缓冲液2μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂0.5μl，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶15U，无RNase去离子水；

③引物：包括目的基因BRCA1、内参基因GAPDH及荧光探针，具体如下：

BRCA1基因引物序列：

BRCA1基因上游引物序列为：5’-ATGGGCCCTTCACCAACA-3’；(SEQ ID No.1)

BRCA1基因下游引物序列为：5’-CACAGAAGCACCACACAGCTGTA-3’；(SEQID No.2)

Taqman荧光探针：6FAM 5’-ATCAACTGGAATGGATG-3’TAMRA；(SEQ ID No.3)

GAPDH基因引物序列：

GAPDH基因上游引物序列为：5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’；(SEQ IDNo.4)

GAPDH基因下游引物序列为：5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’；(SEQ IDNo.5)

Taqman荧光探针：6FAM 5’-CAGGAGCGAGATCC-3’TAMRA。(SEQ ID No.6)

上述引物序列、探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有BRCA1总RNA样品为阳性对照。

⑤PCR反应液：10×PCR反应混合液、0.25pmol/μl的引物、0.3pmol/μl的探针、2.5～4.0mM的Mg²⁺、2U的Taq酶、0.2～0.4mM的dNTPs、0.2～1U的UNG酶、0.3～0.6mMdUTP、通常取1～2ul的模板、反应总体积通常为20μl(以上所有的浓度都是指终浓度)

PCR扩增程序的设定：在lightcycler2.0仪器上通常是先50℃10s，95℃10min，然后95℃15s，60℃1min，循环45次。

实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测BRCA1 mRNA的表达量

以检测20例乳腺癌石蜡切片标本组织结果为例。

检测流程：

首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。获取临床乳腺癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA；配置PCR反应液进行荧光定量PCR。在LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算BRCA1及GAPDH基因的CT值，两者之差即为ΔCt值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。

具体步骤如下：

①组织总RNA的抽提：按RNA抽提纯化的方法抽提癌和癌旁组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1％(质量体积比)DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。

②反转录合成cDNA：取2μl上述RNA液在70℃保温10min随后加入25mmol/L MgCl₂ 4μl，10×逆转录酶缓冲液2μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂0.5μl，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U，补加DEPC处理水至总体积20μl，于42℃保温15min，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。

③反应结束后，加热至99℃5min以灭活逆转录酶。加20μl无菌水混匀置冰箱-20℃保存。

④荧光定量PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含2X PCR反应混合液10.0μl，BRCA1引物浓度0.2μmol/L，探针浓度0.3μmol/L，cDNA1.0μl，超纯水补齐。在lightcycler荧光定量PCR仪上反应：扩增条件：95℃10min预变性，95℃15s，60℃1min扩增45个循环，仪器自动收集荧光信号。

⑤数据收集处理和分析：将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分析目的基因(图1、图2)和管家基因(图3、图4)的Ct值，计算目的基因相对于管家基因(GAPDH)的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于1.50为高表达，比值小于0.50为低表达：

样品	BRCA1模板	GAPDH模板	BRCA1/GAPDH
				乳腺癌	318278725	254365787	1.25
乳腺癌	243568675	356423448	0.68
				乳腺癌	87967548	354567645	0.25
乳腺癌	235876547	289756856	0.81
				乳腺癌	335795436	202458540	1.66
乳腺癌	349898538	193235657	1.81
				乳腺癌	302568963	201468454	1.50
乳腺癌	267598466	255787518	1.05
				乳腺癌	336764684	216451513	1.56
乳腺癌	321568975	209653300	1.53
				乳腺癌	268403709	298546190	0.90
乳腺癌	277557900	327650194	0.85
				乳腺癌	167954681	356406153	0.47
乳腺癌	348569043	206487947	1.69
				乳腺癌	317598460	210215741	1.51
乳腺癌	253764385	286631489	0.89
				乳腺癌	97850645	318654321	0.31
乳腺癌	350421709	218546156	1.60
				乳腺癌	298157590	306671049	0.97
乳腺癌	189649078	328565890	0.58

(2)试剂盒检测能力评价：

根据实例1，将45例经免疫组织化学法检测BRCA1蛋白表达的患者标本采用本发明试剂盒进行检测，将二者的检测能力进行了对比，本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度与免疫组织化学法进行比较，本试剂盒更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求：

其中：

①特异性：93.3％；

②灵敏度：100.0％；

③阳性预测值：阳性预测值达到96.8％；

④阴性预测值：阴性预测值达到100.0％；

⑤重复性：多次重复实验结果一致；

⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为3～4h，耗时短。

上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测BRCA1mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床肿瘤的化疗和预后提供了一种全新的快速准确的基因诊断技术。

SEQUENCE LISTING

<110> 李, 艳

童, 永清

<120> 一种快速检测BRCA1基因 mRAN表达量的试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggccctt caccaaca 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacagaagca ccacacagct gta 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcaactgga atggatg 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaatcc catcaccatc tt 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgccccactt gattttgg 18

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggagcgag atcc 14

Claims

1.一种快速检测BRCA1基因 mRAN表达量的试剂盒，包含BRCA1基因引物，内参基因GAPDH引物和Taqman荧光探针：

BRCA1基因上游引物序列为：5’- ATGGGCCCTTCACCAACA -3’；

BRCA1基因下游引物序列为： 5’- CACAGAAGCACCACACAGCTGTA -3’；

Taqman荧光探针： 6FAM 5’- ATCAACTGGAATGGATG -3’ TAMRA；

GAPDH基因上游引物序列为：5’- ATGGAAATCCCATCACCATCTT -3’；

GAPDH基因下游引物序列为：5’- CGCCCCACTTGATTTTGG -3’ ；

Taqman荧光探针：6FAM 5’- CAGGAGCGAGATCC-3’ TAMRA；

还包含：第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中的第一链cDNA合成试剂为：25 mmol/L MgC1₂ 4μl，10×逆转录酶缓冲液2ul，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，Oligo(dT)₁₅ 0.5μg，AMV逆转录酶15U，无RNase去离子水。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有BRCA1总RNA样品为阳性对照。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的PCR反应液包括：10×PCR 反应混合液、0.25pmol/μl的引物、0.3pmol/μl的荧光探针、2.5~4.0mM的MgCl₂、2U的Taq酶、0.2~0.4mM的dNTPs、0.2~1U的UNG酶、0.3~0.6mM dUTP。