CN102272575A - 荧光检测装置和荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，为了除去测量对象物发出的自发荧光，首先按照测量对象物受到强度调制的激光照射后所发出的荧光强度高于受到激光照射后测量对象物发出的自发荧光强度的方式在第一波段接收测量对象物发出的荧光，而且在与第一波段不同的第二波段接收自发荧光，然后使所生成的第一荧光信号和自发荧光的荧光信号与激光的调制信号进行混合，由此生成第一荧光数据和自发荧光的荧光数据，然后从第一荧光数据中减去将该自发荧光的荧光数据与预先规定的常数相乘而得到的结果，由此生成第三荧光数据，利用该第三荧光数据计算出荧光强度。

Description

荧光检测装置和荧光检测方法

技术领域

本发明涉及一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对此时所得到的多个荧光信号进行信号处理。

背景技术

在医疗、生物领域广泛应用下述的流式细胞仪：该流式细胞仪采用光电倍增管或雪崩光电二极管等光电转换器接收测量对象物被激光照射后发出的荧光，由此分析出细胞或基因等测量对象物的种类、频率和特性。

具体来说，流式细胞仪中，采用荧光试剂使悬浮液中含有细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等活体物质等的测量对象物标签化，然后施加压力以使测量对象物流动在以每秒10m以下程度的速度在管道内进行流动的鞘液中，由此形成分层鞘流。流式细胞仪通过朝向该流动中的测量对象物照射激光，接收附着在测量对象物上的荧光色素所发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定活体物质等。

在该流式细胞仪中，例如能够测量出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等在细胞内的相对量，且在短时间内能够对这些物质的作用进行分析。另外，可使用通过荧光对特定类型的细胞或染色体进行特定、并仅在特定的细胞或染色体以活着的状态下短时间内进行分选收集的细胞分类器等。

在上述仪器的使用中，要求在短时间内根据荧光信息对更多的测量对象物进行正确地特定。

例如，对细胞或人工制造的微球等样品进行测量时，需要测量的信息即为标记于样品上的荧光色素的荧光信息(荧光色或荧光强度)。然而，被照射的激光而发出的荧光不仅仅是用以标记的荧光色素所发出的荧光，还包括细胞或微球等样品自身所发出的荧光，或者用以悬浮这些样品的缓冲液自身所发出的荧光。这些样品自身或缓冲液所发出的荧光波段较宽，且多数情况下该荧光波段与荧光色素发出的荧光波段相重叠，因此样品自身或缓冲液所发出的荧光是需要除去的自发荧光。

自发荧光与荧光色素发出的荧光相比，其荧光强度通常极其弱，但根据不同情况具有较强的荧光强度。此时，如果自发荧光的荧光强度仍然十分弱于荧光色素发出的荧光，则能够用充分的SN比测量出荧光色素发出的荧光。然而，当荧光色素所发出的荧光的荧光强度不足够强时，SN比下降，导致难以对该荧光进行测量。即使在自发荧光较弱的情况下，若荧光色素发出的荧光同样较弱，则发生相同的问题。

下述专利文献1中记载有以下的荧光强度计算方法。

即，朝向标记样品照射以规定频率对激光强度进行时间调制的激光，并用具有不同接收波段的多个检测传感器来接收此时标记样品所发出的荧光，由此从各个检测传感器中收集含有相位信息的检测值。然后，利用标记样品被激光照射后发出的荧光做出一次滞后系统的弛豫响应时的传递函数参数制作出校正变换矩阵。将从各检测传感器收集到的、包括相位信息的检测值的组作为矢量，且使根据所制成的校正变换矩阵而制成的逆矩阵作用在该矢量上，以便求出标记样品发出的荧光的荧光强度。

专利文献1：日本特开2007-127415号公报

在上述方法中，虽然能够计算出正确的荧光强度，但由于必须根据所制作出的校正转换矩阵计算出该矩阵的逆矩阵，因此难以迅速且容易地求出荧光强度。

发明内容

因此，本发明为了解决上述问题点，其目的在于：提供一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，接收测量对象通过激光照射而发出的荧光并对此时所得到的荧光信号进行信号处理时，能够迅速且容易地求出荧光强度。

本发明实施方式的荧光检测装置，其接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对所接收的荧光的荧光信号进行信号处理，该荧光检测装置包括：

(A)光源部，以设定好的频率对具有使测量对象物激发后发出荧光的波长的激光进行强度调制，并将其作为测量对象物的照射光进行发射；

(B)受光部，包括：第一受光元件，在与第一荧光相对应的方式进行设定的第一波段接收所述第一荧光，且输出第一荧光信号；第二受光元件，在与所述第一波段不同的第二波段接收测量对象物所发出的第二荧光并输出第二荧光信号，以按照测量对象物被照射光照射后发出的第一荧光强度高于测量对象物被激光照射后发出的第二荧光强度；

(C)第一处理部，使输出的所述第一荧光信号与以所述频率对激光进行强度调制的调制信号进行混合，由此生成包括相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的所述第一荧光信号的第一荧光数据，同时对输出的所述第二荧光信号和所述调制信号进行混合，由此生成包括相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的所述第二荧光信号的第二荧光数据；

(D)第二处理部，包括：荧光除去部，从所述第一荧光数据中减去将生成的所述第二荧光数据与预先规定的常数相乘后得到的结果，由此生成第三荧光数据；荧光强度计算部，利用所生成的所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光强度。

另外，本发明的另一实施方式的荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对所接收的荧光的荧光信号进行信号处理，该荧光检测方法包括下述步骤：

(E)以设定好的频率对具有使测量对象物激发后发出荧光的波长的激光进行强度调制，并将其作为测量对象物的照射光进行发射；

(F)按照使测量对象物被照射光照射后发出的第一荧光强度高于测量对象物被激光照射后发出的第二荧光强度的方式在与所述第一荧光相对应的方式进行设定的第一波段接收所述第一荧光，并生成第一荧光信号，同时在与所述第一波段不同的第二波段接收测量对象物发出的第二荧光并生成第二荧光信号；

(G)使生成的所述第一荧光信号与以所述频率对激光进行强度调制的调制信号进行混合，由此生成包括相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的所述第一荧光信号的第一荧光数据，且对生成的所述第二荧光信号和所述调制信号进行混合，由此生成包括相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的所述第二荧光信号的第二荧光数据；

(H)从所述第一荧光数据中减去将生成的所述第二荧光数据与预先规定的常数相乘后得到的结果，由此生成第三荧光数据，利用所生成的所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光强度。

上述的荧光检测装置和荧光检测方法与以往的荧光检测装置和荧光检测方法相比，能够迅速且容易地计算出第一荧光的荧光强度。

附图说明

图1为使用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；

图2为表示用于图1所示的流式细胞仪的光源部的一例的概略构成图；

图3为表示用于图1所示的流式细胞仪的受光部的一例的概略构成图；

图4为表示荧光蛋白发出的荧光光谱S、激光L的波长、第一波段和第二波段之间关系的图；

图5为重点表示用于图1所示的流式细胞仪的控制和处理部的流式细胞仪的主要部分的概略构成图；

图6为表示用于图1所示的流式细胞仪的分析装置的一例的概略构成图；

图7为说明自发荧光除去方法的示意图。

附图标记说明

10流式细胞仪

12样品

20信号处理装置

22激光光源部

22a光源

23a、26b分色镜

23b、26a透镜系统

24、26受光部

26c₁、26c₂带通滤波器

27a、27b光电转换器

28控制和处理部

30管道

32回收容器

34激光驱动器

48a、48b功率分配器

40信号生成部

42信号处理部

44系统控制器

46振荡器

50、52、54a、54b、64放大器

58a、58b IQ混频器

62低通滤波器

66A/D转换器

80分析装置

81CPU

82存储器

83分析部

86自发荧光除去部

90荧光强度计算部

92相位滞后计算部

94荧光弛豫时间计算部

具体实施方式

以下，基于适合使用本发明强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪，进行详细说明。

图1为使用本发明强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。

流式细胞仪10包括：信号处理装置20，朝向作为测量对象的样品12照射激光以检测出样品12发出荧光的荧光信号并对该荧光信号进行信号处理；分析装置(计算机)80，根据通过信号处理装置20所得到的处理结果计算出荧光强度和荧光弛豫时间。

以下，在下述说明中作为样品12使用细胞上附着有荧光蛋白X的样品。样品12以浸泡于缓冲液的状态与鞘液一起流动以形成分层鞘流，该鞘流流动在流动池中，且被激光照射。然而，在本发明中，替代样品12，也可以相对于两个以上的荧光色素发出的荧光除去附着有这些荧光色素的各细胞或缓冲液等发出的自发荧光。

信号处理装置20包括：激光光源部22、受光部24、26、控制和处理部28和管道30。

控制和处理部28包括：控制部，以规定频率对来自激光光源部22的激光进行强度调制；以及信号处理部，对来自样品12的荧光信号进行处理。在管道30中，使样品12包括在形成高速流的鞘液中以形成分层鞘流。

管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10的构成中也可以配置用来通过激光照射在短时间内分离出样品12中的特定细胞等活体物质的细胞分类器，以将其分离于各自的回收容器。

激光光源部22是发射规定波长的激光的部分，例如发射λ＝408nm的激光。透镜系统按照使激光聚焦在管道30中的规定位置的方式进行设置，在该聚焦位置上形成有样品12的测量点。

图2为表示激光光源部22构成一例的图。

激光光源部22是将具有可视光带波长、且进行强度调制的激光发射出去的部分。

激光光源部22包括光源(激光二极管)22a。光源22a将波长为408nm的激光L作为CW(连续波)激光射出，且射出时以规定频率对该CW(连续波)激光L进行强度调制。另外，激光光源部22还包括透镜系统23和激光驱动器34。

透镜系统23使激光L聚焦在管道30中的测量点上。激光驱动器34用于驱动激光光源部22。

作为发射出激光L的光源，例如可以使用半导体激光器。

激光L是例如以5～100mW的输出功率输出的激光。对于用来调制激光L强度的频率(调制频率)，其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如为10～200MHz。

激光光源部22在预先规定好的波段进行振荡，以使荧光色素通过激光L被激发后发射出特定波段的荧光。被激光L所激发的荧光蛋白X被附着(结合)在细胞上。当该样品12通过管道30的测量点时，在测量点受到激光L的照射后，荧光蛋白X发出具有特定波长的荧光。

受光部24按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置，且受光部24具有光电转换器。光电转换器通过因在测量点上通过的样品12而激光发生前向散射来输出样品12正通过测量点的内容的检测信号。输出自该受光部24的检测信号被供给到控制和处理部28和分析装置80，并作为通知样品12正通过管道30中的测量点的时间的触发信号、处理开始的ON信号和OFF信号来使用。

另一方面，受光部26按照垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向且垂直于管道30中的样品12的移动方向的方式进行配置，该受光部26包括用来接收样品12在测量点被照射后所发出的荧光的多个光电转换器。

图3为表示受光部26的一例的概略构成的概略构成图。

图3所示的受光部26包括：对来自样品12的荧光信号进行聚焦的透镜系统26a、分色镜26b、带通滤波器26c₁、26c₂和光电倍增管等的光电转换器(受光元件)27a、27b。

透镜系统26a按照将入射到受光部26的荧光聚焦在光电转换器27a、27b的受光面的方式构成。

分色镜26b是对规定范围波段的荧光进行反射而对其它荧光进行透射的分色镜。对分色镜26b的反射波段和带通滤波器26c₁、26c₂的透射波段进行设定，以使荧光在带通滤波器26c₁、26c₂处进行滤波后通过光电转换器27a、27b获取具有规定波段的荧光。

带通滤波器26c₁、26c₂被设置在各光电转换器27a、27b的受光面的前面，其为仅使具有规定波段的荧光透射的滤波器。透射的荧光波段按照与荧光蛋白X发出的荧光相对应的方式进行设定。对于波段，例如波长为494nm～535nm的第一波段FL₁是用以主要接收荧光蛋白X通过射出自激光光源部22的408nm激光L的照射而发出的荧光的波段。另一个波段是波长为415nm～440nm的第二波段FL_b。第一波段FL₁按照与荧光蛋白X相对应的方式进行设定，以使被激光L照射的样品12中荧光蛋白X所发出的荧光的荧光强度能够高于细胞或缓冲液自身发出的自发荧光的荧光强度。同样，第二波段FL_b按照被激光照射的样品12中自发荧光的荧光强度能够高于荧光蛋白X发出的荧光的荧光强度的方式进行设定。其中，优选第二波段FL_b被设定在不包括在荧光蛋白X发出的荧光所具有的波长范围的区域，如后述，以便有效地除去自发荧光的荧光数据。

作为一例，图4表示荧光蛋白X发出荧光的光谱S、激光L的波长408nm、第一波段FL₁和第二波段FL_b。

自发荧光形成幅宽非常宽的宽幅光谱分布，其也分布在第一波段FL₁和第二波段FL_b上。因此，在第一波段FL₁可接收荧光蛋白X发出的荧光和自发荧光。另一方面，荧光蛋白X发出的荧光与自发荧光的光谱相比，其光谱分布狭窄。因此存在在第一波段FL₁中起到支配性作用的荧光蛋白X荧光的荧光强度小于细胞或缓冲液发出的自发荧光的荧光强度的区域，或者不存在荧光蛋白X荧光的波长的区域。该区域作为第二波段FL_b成为设定对象。

光电转换器27a、27b是包括如具有光电倍增管等传感器的、在光电面将接收到的光转换成电信号的受光元件。在此，由于所接收到的荧光是被以规定频率进行强度调制的激光激发的荧光，因此所输出的荧光信号也是强度根据规定频率发生变化的信号。该荧光信号被供给到控制和处理部28。

如图5所示，控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42和作为控制部的系统控制器44。

信号生成部40生成以规定频率f对激光L的强度进行调制的调制信号。

具体来说，信号生成部40包括振荡器46、功率分配器48和放大器50、52。在信号生成部40中，通过放大器50对所生成的、被功率分配器48进行分割的调制信号进行放大，然后将其供给到激光光源部22的激光驱动器34，同时将被功率分配器48分割且通过放大器52进行放大的调制信号供给到信号处理部42。将调制信号供给到信号处理部42的原因在于，如后所述，将上述调制信号作为用来对输出自光电转换器27a、27b的荧光信号进行检波的参照信号来使用。其中，调制信号作为具有规定频率的信号，被设定在10～200MHz的范围的频率。振荡器46对频率f的信号进行振荡以生成调制信号。

信号处理部42利用输出自光电转换器27a、27b的荧光信号，提取荧光蛋白X通过激光照射所发出的荧光的荧光数据和细胞等发出自发荧光的荧光数据。信号处理部42包括：放大器54a、54b、64、功率分配器56、IQ混频器58a、58b和低通滤波器62。

放大器54a、54b对输出自光电转换器27a、27b的荧光信号进行放大。IQ混频器58a、58b中，被放大的荧光信号分别与将调制信号作为参照信号的荧光信号相混合，其中，上述调制信号为供给自信号生成部40的正弦波信号。

功率分配器56将供给自信号生成部40的调制信号分成两个信号，并将其分配给IQ混频器58a和58b。

IQ混频器58a和58b是使供给自光电转换器27a、27b的荧光信号与将供给自信号生成部40的调制信号作为参照信号的荧光信号进行混合的器件。具体来说，在各个IQ混频器58a、58b中，对参照信号与荧光信号(RF信号)进行乘法计算，以便生成荧光信号中包括与调制信号同相成分的信号、且生成荧光信号中包括相对于调制信号相位发生90度位移的信号。包括同相成分的信号是通过混合调制信号和荧光信号来生成，含有包括相位发生90度位移的成分的信号是通过对相位发生90度位移的调制信号和荧光信号进行混合而生成。

低通滤波器62是对生成于IQ混频器58a、58b的信号的低频信号进行过滤的部分。通过该过滤，荧光信号中与调制信号同相的成分(Re成分)和相对于调制信号相位发生90度位移的成分(Im成分)作为荧光数据而被提取。被提取的Re成分和Im成分在放大器64进行放大后被输送到分析装置80。由于Re成分和Im成分在每个设定于光电转换器27a、27b的第一波段和第二波段中可以得到，因此第一波段的Re成分和Im成分组和第二波段的Re成分和Im成分组被输送到分析装置80。

系统控制器44除了使信号生成部40生成规定频率的调制信号以外，还给出控制各部分动作的指令，且对流式细胞仪10的整个动作进行管理。

在分析装置80中，对供给自信号处理部42的Re成分和Im成分进行A/D转换，然后根据AD转换的Re成分、Im成分求出荧光强度，进而求出相对于激光的荧光相位滞后角度，且由该相位滞后角度求出荧光弛豫时间常数(荧光弛豫时间)。具体来说，分析装置80包括A/D转换器66和分析部83。分析装置80由包括CPU81和存储器82的计算机构成，且读取存储于存储器82的程序并启动该程序，由此分析部83由软件模块形成。当然，也可以通过专用电路构成分析部83的各个部分。

图6是表示分析部83的概略构成的图。

分析部83包括：自发荧光除去部86、荧光强度计算部90、相位滞后计算部92和荧光弛豫时间计算部94。

自发荧光除去部86是采用以复数表示供给自控制部44的Re成分和Im成分的荧光数据，从第一波段FL₁和第二波段FL_b的荧光信息中除去样品12中细胞或缓冲液自身所发出的自发荧光信息的部分。具体来说，使预先设定的第一常数(复数)与所生成的第二波段FL_b的荧光数据相乘，然后从第一波段FL₁的荧光数据中减去上述相乘结果，由此从第一波段FL₁的荧光数据中除去自发荧光的荧光数据。

在此，第一常数可以利用光源部22、受光部24、控制和处理部28对不附着有荧光蛋白X的细胞进行处理后得到。该第一常数是上述细胞发出的自发荧光中第一波段FL₁的荧光数据除以第二波段FL_b的荧光数据后得到的比值。

例如，将自发荧光的第一波段FL₁中的荧光数据用复数表示成a₁e^iθ1、将自发荧光的第二波段FL_b中的荧光数据用复数表示成a_be^iθb时，上述第一常数为a₁/a_b·e^i(θ1-θb)。

另外，将测量样品12时所求出的第二波段FL_b中的荧光数据用复数表示成A_be^iθb，将第一波段FL₁中的荧光数据用复数表示为A₁e^iθ1。此时，可计算出A₁e^iθ1-a₁/a_b·e^i(θ1-θb)·A_be^iθb的结果。该计算结果即为从第一波段FL₁的荧光数据中除去自发荧光的荧光数据后的荧光数据。

如此地，通过样品12的测量而得到的第二波段FL_b的荧光数据与第一常数相乘后得到a₁/a_b·e^i(θ1-θb)·A_be^iθb，由此能够推算出包括在第一波段FL₁的自发荧光的荧光数据。该第一常数被存储于分析装置80的存储器84中。

图7是说明自发荧光的除去方法的示意图。图中，纵轴为Im成分、横轴为Re成分，这些成分均由矢量来表示。第一波段FL₁中自发荧光的荧光数据B₁是第一常数乘以第二波段FL_b的荧光数据而得到的数据。从通过测量而得到的第一波段FL₁的荧光数据A₁’中减去上述荧光数据B₁，由此能够计算出在图中用虚线表示的、应求出的荧光数据A₁。

于是，被除去自发荧光的荧光数据的荧光数据被供给到荧光强度计算部90和相位滞后计算部92。

荧光强度计算部90是求出荧光数据A₁的复数绝对值以计算出荧光强度的部分。

相位滞后计算部92是对于荧光数据A₁将复数辐角(tan^-1(荧光数据的Im成分/荧光数据的Re成分))作为相位滞后θ来计算出的部分。

荧光弛豫时间计算部94是利用由相位滞后计算部92计算出的θ且根据式τ＝1/(2πf)·tan(θ)计算出荧光弛豫时间τ的部分。在此，f是用来调制激光L强度的频率。之所以能够通过式τ＝1/(2πf)·tan(θ)计算出荧光弛豫时间τ，这是因为荧光现象随着一次的弛豫过程发生变化的缘故。

所计算出的荧光强度、相位滞后θ和荧光弛豫时间τ作为结果信息而被输出到未图示的打印机或显示器。另外，该结果信息作为样品12每次通过管道30的测量点时的测量结果而成为统计处理的对象。

流式细胞仪10通过上述方式构成。

接下来，对流式细胞仪10中所进行的荧光检测方法进行说明。

首先，准备具有能够使荧光蛋白X吸收激光L、且相对于自发荧光发出较强强度荧光的波长的激光L，该激光L以频率f进行强度调制后从光源部22射出。

然后，对于被照射光照射后荧光蛋白X所发出的荧光，按照荧光蛋白X发出的荧光强度高于自发荧光发出的荧光强度的方式利用与荧光蛋白X相对应地进行设定的第一波段FL₁在受光部26接收光，同时通过与第一波段FL₁不同的第二波段FL_b接收细胞等发出的自发荧光。由此输出与第一波段FL₁和第二波段FL_b相对应的荧光信号。

在控制和处理部28，使所输出的各个荧光信号与频率f的调制信号进行混合，由此生成包括相对于调制信号的荧光信号的相位滞后和强度振幅的荧光数据A₁’。进而，通过混合第二波段FL_b的荧光信号和频率f的调制信号，生成包括相对于调制信号的荧光信号的相位滞后和强度振幅的荧光数据B₁’。

生成的荧光数据A₁’和荧光数据B₁’在分析装置80进一步进行自发荧光的除去处理。在该处理中，荧光数据B₁’与上述第一常数(复数)相乘，作为该相乘结果的B₁从荧光数据A₁’中被减掉，由此计算出除去自发荧光后的荧光数据A₁。该荧光数据A₁被输送到荧光强度计算部90和相位滞后计算部92，由此计算出荧光强度和相位滞后θ。进而，利用所计算出的相位滞后θ，在荧光弛豫时间计算部94计算出荧光弛豫时间τ。

其中，第一常数是细胞发出的自发荧光中波段FL₁的荧光数据除以细胞发出的自发荧光中第二波段FL_b的荧光数据后得到的比值(复数)。上述荧光数据是利用流式细胞仪10对没有附着(结合)荧光蛋白X的细胞进行处理后预先得到的荧光数据。

由此，在本实施方式的荧光检测装置和荧光检测方法中，在按照第一荧光强度高于第二强度的方式进行设定的第一波段接收第一荧光和第二荧光以生成第一荧光信号，同时在与第一波段不同的第二波段接收第二荧光以生成第二荧光信号。在除去由自发荧光产生的荧光数据时，第一常数乘以通过样品12的测量而得到的第二波段FL_b的荧光数据，由此推算出被包括在第一波段FL₁的自发荧光的荧光数据，且只需对该荧光数据进行除法计算即可，因此能够迅速且容易地除去自发荧光。

特别是，由于将第二荧光作为由测量对象粒子来发出的、具有宽波段的峰宽光谱分布的自发荧光，因此能够从第一荧光中迅速且容易地除去自发荧光。

综上，对本发明的光检测装置和荧光检测方法进行了详细的说明，但本发明并不限定于上述实施方式，在不脱离本发明主题的范围内所进行的各种改良或改变均包括在本发明中。

Claims (10)

1.一种荧光检测装置，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对所接收的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括：

光源部，以设定好的频率对具有使测量对象物激发后发出荧光的波长的激光进行强度调制，并将其作为测量对象物的照射光进行发射；

受光部，包括：第一受光元件，按照测量对象物被照射光照射后发出的第一荧光强度高于测量对象物被激光照射后发出的第二荧光强度的方式在与所述第一荧光相对应地进行设定的第一波段接收所述第一荧光，并输出第一荧光信号；第二受光元件，在与所述第一波段不同的第二波段接收测量对象物发出的第二荧光并输出第二荧光信号；

第一处理部，其中，通过将被输出的所述第一荧光信号与以所述频率对激光进行强度调制的调制信号进行混合，由此生成包括所述第一荧光信号的、相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的第一荧光数据，且通过对被输出的所述第二荧光信号与所述调制信号进行混合，由此生成包括所述第二荧光信号的、相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的第二荧光数据；

第二处理部，包括：荧光除去部，从所述第一荧光数据中减去将所生成的所述第二荧光数据与预先规定的常数相乘后得到的结果，由此生成第三荧光数据；荧光强度计算部，利用所生成的所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光强度。

2.如权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述测量对象物按照在测量对象粒子上附着有荧光色素的方式构成；

所述第一荧光是所述荧光色素发出的荧光；

所述第二荧光是所述测量对象粒子发出的自发荧光，或者是悬浮有所述测量对象粒子的溶液发出的荧光。

3.如权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二波段被设定在不包括所述第一荧光所具有的波长范围的区域。

4.如权利要求2或3所述的荧光检测装置，其特征在于，

用于所述荧光除去部的所述常数是针对不附着有荧光色素的测量对象粒子利用所述光源部、所述受光部和所述第一处理部而得到的、测量对象粒子发出的自发荧光的所述第一波段中的荧光数据除以测量对象粒子发出的自发荧光的所述第二波段中的荧光数据后得到的比值。

5.如权利要求1～4中任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二处理部包括荧光弛豫计算部，其除了荧光强度以外，还利用所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光弛豫时间。

6.一种荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对所接收的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括下述步骤：

以设定好的频率对具有使测量对象物激发后发出荧光的波长的激光进行强度调制，并将其作为测量对象物的照射光进行发射；

按照测量对象物被照射光照射后发出的第一荧光强度高于测量对象物被激光照射后发出的第二荧光强度的方式在与所述第一荧光相对应地设定的第一波段接收所述第一荧光，并生成第一荧光信号，且在与所述第一波段不同的第二波段接收测量对象物发出的第二荧光，并生成第二荧光信号；

使所生成的所述第一荧光信号与以所述频率对激光进行强度调制的调制信号进行混合，由此生成包括所述第一荧光信号的、相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的第一荧光数据，且对所生成的所述第二荧光信号与所述调制信号进行混合，由此生成包括所述第二荧光信号的、相对于所述调制信号的相位滞后和强度振幅的第二荧光数据；

从所述第一荧光数据中减去将所生成的所述第二荧光数据与预先规定的常数相乘而得到的结果，由此生成第三荧光数据，利用所生成的所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光强度。

7.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，所述测量对象物按照在测量对象粒子上附着有荧光素色的方式构成；

所述第一荧光是所述荧光色素发出的荧光；

所述第二荧光是所述测量对象粒子发出的自发荧光，或者是悬浮有所述测量对象粒子的溶液发出的荧光。

8.如权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，所述第二波段被设定在不包括所述第一荧光所具有的波长范围的区域。

9.如权利要求7或8所述的荧光检测方法，其特征在于，所述常数是通过使用不附着有荧光色素的测量对象粒子的处理方法来获得；

所述处理方法包括下述步骤：

以所述频率对所述激光进行强度调制后作为所述测量对象物的照射光射出；

在所述第一波段接收所述自发荧光并生成第一自发荧光信号，且在所述第二波段接收所述自发荧光并生成第二自发荧光信号；

计算出所生成的所述第一自发荧光信号相对于所述第二自发荧光信号的比率并将其用作所述常数。

10.如权利要求6～9中任一项所述的荧光检测方法，其特征在于，还包括除了荧光强度以外，利用所述第三荧光数据计算出所述第一荧光的荧光弛豫时间的步骤。

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