CN102232960B

CN102232960B - 表儿茶素没食子酸酯与柔红霉素的组合物及其应用

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Publication number: CN102232960B
Application number: CN 201010155942
Authority: CN
Inventors: 余龙; 丁丽娅; 黄维雪; 黄强; 唐丽莎
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2030-04-23
Also published as: CN102232960A

Abstract

本发明属于医药及基因工程领域，涉及组合物表儿茶素没食子酸酯(ECG)与柔红霉素(DNR)及其应用。本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖组合物，该组合物含有表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素。该组合物用于制备抗肿瘤药物，可以大大降低DNR的心脏毒性，大大增强DNR的抗肿瘤效果，同时相对减少了DNR的用量及药物成本。由于ECG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。ECG作为DNR的辅助药物使用，为一种新的高效价廉抗肿瘤药物的配伍方案，提高了肿瘤的抑制率，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

表儿茶素没食子酸酯与柔红霉素的组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及组合物表儿茶素没食子酸酯(ECG)与柔红霉素(DNR)及其应用。

背景技术

蒽环类药物是最有效的抗肿瘤的药物之一，包括DNR(DNR)和阿霉素(DOX)，可以治疗多种癌症，包括白血病和实体瘤(Minotti，G.，et al.，Anthracyclines：molecular advancesand pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity.PharmacolRev，2004.56(2)：p.185-229)，具有一个蒽环平面，可通过它嵌合于DNA碱基对之间并紧密地结合到DNA上，因而使核酸中含有相当高浓度的药物，这种嵌合可导致DNA空间结构的障碍，从而抑制DNA及DNA依赖的RNA合成，对RNA的影响尤为明显，并可选择性作用于嘌呤核苷。为细胞周期非特异性药物，对增殖细胞各期均有杀伤作用，但对G₂期作用更为显著。

DNR是一种重要的蒽环类抗癌药物，分子式C₂₇H₂₉NO₁₀，分子结构式如图7所示。中文别名：正定霉素，柔毛霉素，红比霉素，红保霉素，佐柔比星，红比脘。外文名：Daunorubicin，Daunomycin，Daunoblastin，Rubidomycin，Rubomycin，Ondena，Cerubidine.外文缩写：DNR，DRB，DM，F.I.6339，NSC-82151，13057R.P。化学名：(1S，3S)-3-乙酰基-1，2，3，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-10-甲氧基-6，11-二氧-1-1萘基-3-氨基-2，3，6-三去氧-a-L来苏六吡喃糖甙。

DNR药物为橙红色针状结晶，易溶于水，其水溶液相当稳定，在0℃能保存3周，其活力不变，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、苯。是Str.peucetius或Str.coeruleorubidus菌种所产生的抗生素，是从我国河北正定县土壤中得到的放线菌菌株，故亦名正定霉素。

在临床化疗治疗中，由于肿瘤细胞对蒽环类化合物的天然或获得性的耐受性以及药物对正常组织的毒性，尤其是心脏毒性(突发性心动过速，呼吸困难，心脏扩大，急性心力衰竭，肺水肿等，能迅速导致死亡，病检可见多灶性心肌退行性变，心脏毒性发生率为2％～10％。)使得蒽环类药物在临床应用上受到限制。DNR和阿霉素在体内会被代谢成为DNR醇和阿霉素醇，蒽环霉素使用时引起的急性和慢性的心脏毒性，也被认为主要是由蒽环类药物的羟基代谢物引起的。而且羟基代谢物的抗癌活性和药物原形相比，抗癌活性较弱。

在人体中，羰基还原酶CBR1为主要的DNR的代谢酶，CBR1位于21q22.12-(NM_001757)，是人的CBR基因。CBR1的cDNA序列是Wermuth从胎盘CDNA文库中得到编码277个氨基酸，蛋白的分子量为30375Da。CBR1对DNR的代谢，导致肿瘤细胞对药物的耐受，以及产生心脏毒性。

鉴于CBR对蒽环类药物的代谢能降低药物的毒性，引起肿瘤细胞的耐受性，因此，CBR抑制剂的开发具有两方面的益处，即可增加对肿瘤细胞的毒性，又可降低代谢产物引起的心脏毒性。抑制羰基还原可以通过两种方法来实现，一种是通过抑制代谢失活药物的酶的活性实现，另一种方法是通过对化疗药物的分子修饰，使它丧失与代谢酶的亲和力，而不能被酶代谢。通过抑制羰基还原可以增强DNR的抗肿瘤活性以及减弱心脏毒性，如何保护蒽环类药物的羰基不被还原一直是本领域的一个重要课题。

茶叶(tea，camellia sinensis)是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20％为绿茶、78％为红茶、2％为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目，大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，茶多酚是一种从茶叶提取的纯天然的复合物，占茶叶干重的30％左右，其中含有30种以上的酚性物质。按其化学结构可分为四类，即儿茶素、黄酮及黄酮醇、花白素及花青素、酚酸类和缩酚酸类。在这四类物质中，儿茶素含量最高，占茶多酚总量的60％-80％；其中(-)表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)占40-60％，(-)表儿茶素没食子酸脂(ECG)占10-20％，(-)表没食子儿茶素(EGC)占10-20％，(+)表儿茶素(EC)占4-6％。

ECG分子式C₂₂H₁₈O₁₀，FW 442.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称表儿茶素没食子酸酯。表儿茶素没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。由于ECG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。因此开发茶多酚的成分作为主要的或者辅助的抗肿瘤药物具有一定的市场前景。

到目前为止，还没有ECG与DNR联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新药物组合物：其含有表儿茶素没食子酸酯(ECG)与DNR(DNR)。

本发明的另一个目的是提供上述组合物的应用。

本发明提供了一种新的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，该组合物含有ECG和DNR；其中，ECG和DNR的质量比为600∶1～1∶2。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比较好为500∶1～10∶1。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比更好为200∶1～25∶1。

本发明中，没食子酸酯和DNR的质量比最好为100∶1～50∶1。

本发明还提供了上述组合物在制备抗肝细胞肿瘤药物中的应用。

本发明中，所述的肿瘤可以是肝癌。

本发明中(-)表儿茶素没食子酸脂(ECG)、(-)表没食子儿茶素(EGC)和(+)表儿茶素(EC)单独使用的抗肿瘤作用基本没有差别。

本发明中(-)表儿茶素没食子酸脂(ECG)与柔红霉素组合使用可以增强柔红霉素的抗肿瘤作用。(-)表没食子儿茶素(EGC)和(+)表儿茶素(EC)与柔红霉素组合使用不能明显增强柔红霉素的抗肿瘤作用。引起(-)表儿茶素没食子酸脂(ECG)、(-)表没食子儿茶素(EGC)和(+)表儿茶素(EC)的这种功能差异的是由于它们的结构差异。

本发明的ECG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖，而且其效果比单独使用效果的叠加更明显。另一方面，ECG和DNR联用，明显降低DNR的使用量，降低药物的毒副作用。

本发明中，将ECG与DNR的组合物用于肿瘤细胞(例如，肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721，来源中国科学院细胞库，上海岳阳路328号)，结果显示，与仅使用DNR相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。本发明的ECG和DNR组合物可以抑制肿瘤细胞增殖，而且其效果比单独使用两种化合物效果的叠加更明显。ECG和DNR联用，明显降低了DNR的使用量，其降低效果随着ECG用量的增加而更加明显。DNR有心脏毒性、消化道反应、骨髓抑制等毒副作用，降低DNR的用量就意味着降低药物的毒副作用。

ECG和DNR联用，与单独使用ECG或者DNR相比，在抑制肿瘤细胞生长面具有明显的增效作用，而且增效作用具有ECG浓度梯度效应。本发明的列举了ECG和DNR含量比为25∶1，50∶1，250∶1，300∶1，500∶1，10∶1，100∶1，200∶1等。实验表明，在两者含量为600∶1-1∶2的范围都是有效果的。

本发明中，所述的肿瘤细胞可以是CBR1表达量高的细胞。

在实验结果也显示，ECG对DNR的增效，在CBR1表达量高的细胞效果更明显。这也与ECG是通过作用CBR1而达到增效的内在机制符合。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，即在肿瘤细胞中加入ECG和DNR组合物，ECG和DNR的质量比为60∶1～1∶2。

本发明中，所述的肿瘤细胞可以是HepG2、SMMC-7721。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的ECG与DNR的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的ECG和DNR可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的ECG与DNR的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，ECG与DNR的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的ECG与DNR的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了一种新的组合物，该组合物含ECG和DNR。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。ECG和DNR联用，用于制备抗肿瘤药物，可以大大降低DNR的心脏毒性，大大增强DNR的抗肿瘤效果，同时相对减少了DNR的用量及药物成本。由于ECG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。ECG作为DNR的辅助药物使用，为一种新的高效价廉抗肿瘤药物的配伍方案，提高了肿瘤的抑制率，降低了肿瘤患者的治疗成本。

附图说明

图1ECG、EC、EGC的结构图

图2ECG抑制DNR的代谢酶CBR1活性

图3ECG、EC、EGC对HepG2细胞增殖的影响统计图

图4ECG、EC、EGC对SMMC7721细胞增殖的影响统计图

图5ECG对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞HepG2增殖效果的影响统计图。可见，加入了ECG后可以大大增强DNR的效果，而且加入的ECG越多，抑制肿瘤细胞的效果更明显。并且，ECG与DNR联用后，抑制肿瘤细胞增殖的效果不是简单的叠加，而是比分别加入相同剂量的药物的效果叠加后效果更明显。

图6ECG对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞SMMC7721增殖效果的影响统计图。与HepG2的结果相一致。ECG后可以增强DNR的效果并且具有浓度梯度效应。

图7EC对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞HepG2增殖效果的影响统计图。EC对DNR抑制肿瘤细胞HepG2增殖的增效作用不明显。

图8EC对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞SMMC7721增殖效果的影响统计图，结果与HepG2一致。

图9EGC对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞HepG2增殖效果的影响统计图。EGC对DNR抑制肿瘤细胞HepG2增殖的增效作用不明显。

图10EGC对柔红霉素(DNR)抑制肿瘤细胞SMMC7721增殖效果的影响统计图，结果与HepG2一致。

具体实施方式

实施例1ECG、EC、EGC的结构图

如图1所示，ECG与EC和EGC的结构差别主要是ECG比EC和EGC多一个G环。

实施例2ECG、EC、EGC抑制羰基还原酶CBR1的活性的差异

以吲哚满二酮为底物，NADPH为辅酶进行酶活性分析。辅酶NADPH在340nm处有最大吸光值，用紫外分光光度计进行时间扫描，检测波长340nm处的吸光度的改变量来反应酶促反应速度。反应体系为600μl，缓冲体系是0.1M磷酸盐缓冲液，酶适量，不同反应变化辅酶NADPH，底物是吲哚满二酮，抑制剂ECG的量。每个样品做3个平行管。EC和EGC对羰基还原酶CBR1的抑制作用明显低于ECG。ECG抑制CBR1的IC50为2.32μM(图2)，EC在200μM时的抑制率为23.6％，EGC在200μM时的抑制率为36.6％。

实施例3ECG、EC、EGC单独用药的抗肿瘤作用

ECG、EC、EGC单独用药时均没有显示出很好的抗肿瘤作用。分别用这三种药物浓度为10μM、20μM、40μM、80μM、160μM作用于肝癌细胞株HepG2(图3)和SMMC7721(图4)，结果显示它们的IC50值均超过160μM，也就表明它们并不是能够单独使用的强效的抗肿瘤药物，同时也表明三者的毒性较弱，可以作为辅助药或增效药。

实施例4ECG对DNR抑制肿瘤细胞增殖的增效

用MTT方法来检测ECG对DNR抑制肿瘤细胞增殖的效应的影响。选用的ECG的浓度20μM、40μM和80μM，此浓度下ECG单独使用时几乎不影响选用肿瘤细胞的生长。0.15μM的DNR作用HepG248小时后，细胞存活数为不加药的对照细胞的74.9％，分别和20μM，40μM，80μM的ECG联合使用，细胞存活数降为70.0％、70.5％和60.4％。在80μM时，ECG联合DNR跟DNR单独作用相比，对细胞增殖的抑制增多了14.5％。0.3μM的DNR作用HepG248小时后，细胞存活数为不加药的对照细胞的57.6％，分别和20μM，40μM，80μM的ECG联合使用，细胞存活数降为49.2％、48.2％和41.5％。可见，ECG对DNR增效显著，而且增效作用具有ECG浓度梯度效应(图5)。

在SMMC7721(图6)，ECG显示出类似的增效作用的，DNR联合20μM ECG后，细胞存活从61.0％降低到51.4％，抑制效果增强了9.6％，DNR联合20μM ECG后，细胞存活从61.0％降低到41.5％，抑制效果增强了19.5％(P＜0.01)，同样具有ECG梯度效应。

ECG对DNR抑制肿瘤细胞的增效作用可以相对的降低DNR的用量，因此可以降低DNR的用量和毒副作用。ECG的价格明显低于柔红霉素的价格，降低用药成本。

实施例5EC和EGC联合DNR的抗肿瘤作用

在HepG2(图7、图8)和SMMC7721(图9、图10)细胞中，用同样的方法检测EC和EGC对DNR的增效作用。结果显示，EC和EGC在HepG2和SMMC7721均未能显著增效DNR的作用。

在HepG2细胞中，选用的EC和EGC的浓度40μM和80μM，此浓度下EC单独使用时几乎不影响选用肿瘤细胞的生长。0.15μM的DNR作用HepG248小时后，细胞存活数为不加药的对照细胞的73.7％，分别和40μM、80μM的EC联合使用，细胞存活率为69.59％和75.35％，没有显著差异。0.15μM的DNR分别和40μM、80μM的EGC联合使用，细胞存活率从71.28％改变为71.77％和73.50％，没有显著差异。

在SMMC7721细胞中，选用40μM和80μM的浓度，此浓度下EC和EGC单独使用时几乎不影响选用肿瘤细胞的生长。0.15μM的DNR作用SMMC7721细胞48小时后，细胞存活数为不加药的对照细胞的57.52％，分别和40μM、80μM的EC联合使用，细胞存活率为55.68％和58.75％，没有显著差异。0.15μM的DNR分别和40μM、80μM的EGC联合使用，细胞存活率从60.02％改变为58.72％和61.10％，没有显著差异。

本发明所用的实验材料及试剂

1.肝癌细胞株HepG2

物种：人类

来源：ATCC

组织：肝细胞癌

2.肝癌细胞株SMMC7721：

物种：人类

来源：中国科学院细胞库，上海岳阳路328号

组织：肝细胞癌

3.相关试剂和试剂盒

新生小牛血清和胎牛血清(GIBICO公司)

胰蛋白酶(上海华美生物工程公司)

细胞培养基：RPIM1640(GIBICO)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(GIBICO公司)

MTS试剂盒(PROMEGA公司)

4.细胞用试剂配方

1×PBS：Na2HPO4·12H2O 3.63g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO40.24g用0.1N NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1L，120℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

EDTA试剂：0.2g EDTA溶解于1×PBS中。

细胞冻存液：90％的完全培养基加5％的DMSO，10％相应血清。

裂解缓冲液(储备)：5×PBS 100ml；0.5M EDTA 5ml；Triton X-1002.5ml用ddH2O定容至500ml。4℃储存。

裂解缓冲液(实际用液)：在裂解缓冲液(储备)中加入0.1mM的PMSF，10μM的pepstainA，10μM的leupeptin和25μg/ml aprotinin。

5×胰酶：NaCl 4.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 0.06g，KH2PO40.03g，胰酶1.25g。过滤灭菌，-20℃储存。用时用EDTA试剂稀释。

100mg/ml G418溶液：1g的G418溶于10ml的ddH2O中，过滤灭菌，-20储存，使用时按所需浓度稀释。

5.主要的仪器设备

SW-CJ-1FD型净化工作台(吴江市金晓空调净化有限公司)

TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂)

微量加样器：1000μl/200μl/20μl(Gilson公司)

超速离心机(Heraeus和Beckman公司)

Microplate Reader(medel 550)(Bio-RAD公司)

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖组合物，其特征在于，该组合物含有表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素；所述的表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为600：1-1：2；所述的肿瘤是肝癌。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为500:1～10:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为200:1～25:1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表儿茶素没食子酸酯和柔红霉素的质量比为100:1～50:1。

5.权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖组合物在制备抗肝细胞肿瘤药物中的应用，其特征在于，在体外培养的肿瘤细胞的培养基中加入权利要求1所述组合物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞是CBR1表达量高的细胞。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞是HepG2或者SMMC-7721细胞。