CN102162007A

CN102162007A - 牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法

Info

Publication number: CN102162007A
Application number: CN2010101132480A
Authority: CN
Inventors: 林祥梅; 贾广乐; 韩雪清; 吴绍强; 刘建; 梅琳; 王彩霞; 王慧煜
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2011-08-24

Abstract

本发明提供一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法，根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，设计引物及探针，其中，上游引物为5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探针为5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。本发明建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。

Description

牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种牛分枝杆菌检测方法，具体地说，涉及一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法。

背景技术

自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，分枝杆菌新菌种的发现、命名、分类及其演变都有很大的发展变化。在微生物分类学上，分枝杆菌归属于原核生物界、原壁菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌属成员均为好氧，平直或弯曲细长，革兰氏阳性杆菌。在一定情况下可产生菌丝，但这些菌丝在搅动后成为杆状或球形。

1898年，Smith首次将牛分枝杆菌(M.bovis)和其它的分枝杆菌明确区分开来。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物，包括有蹄动物、有袋动物、食肉类动物、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的50多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等20多种禽类，其中牛是最敏感的动物。

在核苷酸水平上，牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比，其同源性大于99.95％，表现出共线性，没有广泛的置换、复制或倒置现象。在牛分枝杆菌基因组全序列测定之前，一般是利用基于杂交原理(高度准确的序列鉴定)方法来比较结核分枝杆菌复合群之间的基因差别，发现牛分枝杆菌基因组中存在大小为1～12.7kb不等的片段缺失。在牛分枝杆菌中，仅有一个被称作TbD1的基因位点，在现有的大多数结核分枝杆菌中没有该基因的存在。因此，基因缺失在牛分枝杆菌基因组形成中可能起到了至关重要的作用。

实时荧光定量PCR(real-time fluorogenetic quantitative PCR)是在定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这种探针的长度为20-24bp，在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。该法利用Taq酶的5’-3’外切酶活性，当探针保持完整时，淬灭基团吸收发射基团的发射荧光。在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当达到探针后，TaqMan的外切酶活性将探针切断，荧光信号得以释放。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。

荧光定量PCR采用密封系统，将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化，在单一反应管中进行，自动化程度高，可避免在PCR期间及PCR之后产物受到污染，确保结果的准确性。荧光定量PCR在扩增过程中实时监控，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，计算每个样品Ct值。由于Ct值与起始模板浓度的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，根据标准曲线获得定量结果。Mishra等用巣式PCR对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌进行区分和检测，但是巣式PCR比荧光PCR步骤繁琐，而且及其不敏感。

研究发现，500bp基因片段为牛结核杆菌基因组所特有的基因，利用这个片段可以用于牛结核分枝杆菌的诊断和鉴别，但应用500bp基因片断进行的PCR检测并不能检出所有的牛分枝杆菌，存在漏检现象。Taylor等人对牛分枝杆菌基因数目可变区RD4侧翼序列设计引物，用SYBR Green荧光定量PCR方法进行检测，并和传统PCR方法比较，结果显示特异性提高，表明该序列可以对牛分枝杆菌进行特异性检测。但是很多研究都没有进行绝对定量，本发明根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供牛分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，利用Taqman荧光定量PCR检测方法的快速、敏感和特异性，准确检测并鉴定牛分支杆菌引起的牛结核病。

为了实现本发明目的，本发明提供一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其中，上游引物为：5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为：5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探针为：5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。

本发明还提供含有上述引物及探针的检测试剂盒。

本发明进一步提供利用上述引物及探针检测牛分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，其中，PCR上游引物为5’-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3’，下游引物为5’-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3；回收PCR扩增产物；

2)目的基因的克隆

将步骤1)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；

3)Taqman荧光定量PCR检测

以阳性重组质粒DNA为模板，利用引物及探针，其中，上游引物为5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探针为5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’，进行Taqman荧光定量PCR检测。

前述的方法，其中Taqman荧光定量PCR检测的退火温度为50.5℃。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明应用blast对测序后的序列进行了同源性分析，其扩增序列与原序列完全一致，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其扩增的片段大小与预期大小一致，说明所扩增的片段为目的片段，可以用于对牛分支杆菌和结核分支杆菌的检测，用含有目的片段的质粒做标准质粒，并且通过计算得出其拷贝数，进行准确定量，提高了建立牛分支杆菌检测方法的准确性。

(2)本发明根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明牛分枝杆菌基因组DNA PCR扩增电泳结果，其中1为阴性对照，2为目的条带；

图2为本发明不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；

图3为本发明不同Mg²⁺浓度与荧光信号强度关系曲线；

图4为本发明不同浓度的引物和探针与荧光信号强度关系曲线；

图5为本发明不同浓度的rTaq酶与荧光信号强度关系曲线；

图6为本发明使用PCR Mix时不同退火温度与荧光信号强度关系曲线；

图7为本发明使用PCR Mix时不同浓度的引物和探针与荧光信号强度关系曲线；

图8为本发明使用单混PCR试剂时229bp标准质粒的扩增曲线；

图9为本发明使用单混PCR试剂时229bp标准质粒的标准曲线；

图10为本发明使用PCR Mix时229bp标准质粒的扩增曲线；

图11为本发明使用PCR Mix时229bp标准质粒的标准曲线；

图12为使用本发明探针检测牛分枝杆菌特异性实验结果曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1原料及试剂

牛分枝杆菌由中国检验检疫科学研究院提供。结核分支杆菌(M.tuberculosis)H37Rv标准株，结核分支杆菌分离株、BCG、禽分支杆菌(M.avium)，偶发分支杆菌(M.fortuit um)，胃分支杆菌(M.gastri)，龟分支杆菌、副结核分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、金黄色葡萄球菌、胞内分支杆菌的DNA核酸样品、灭活牛分支杆菌标准株菌液由武汉华中农业大学提供。

大肠杆菌(E.coli)菌种DH5a 北京全式金生物技术有限公司

PGEM-T easy载体美国Promega公司

Pfu DNA聚合酶美国Promega公司

T4 DNA连接酶美国Promega公司

IQ supermix 美国BIO-RAD公司

Plasmid mini kit I 美国Omega公司

Gel extraction kit 美国Omega公司

DL 2000 maker 宝生物工程(大连)有限公司

dNTP(10mM) 美莱博医学科技有限公司

Taq酶美莱博医学科技有限公司

1.1.2仪器

Epperdorf PCR扩增仪德国Eppendorf公司

微型紫外分光光度计(ND-1000) 美国NanoDrop公司

超级恒温循环器(YT-5B) 北京亚泰科技开发中心

电热恒温培养箱(DHG-9082) 上海一恒科学仪器有限公司

电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070A) 上海一恒科学仪器有限公司

恒温振荡器(THZ-C) 太仓市实验设备厂

Bio-Rad miniopticon荧光定量PCR仪美国BIO-RAD公司

Real Time PCR 8联管美国BIO-RAD公司

Real Time PCR 8联管盖子美国BIO-RAD公司

电子天平(AL-104) 瑞士METTLER TOLEDO公司

sigma离心机(2-16P) 美国sigma公司

直流电泳仪(DYY-7C) 北京六一仪器厂

金属恒温仪(CHB-100) 杭州博日科技有限公司

紫外凝胶成像系统(DYY-1000B) 上海天能科技有限公司

高压灭菌锅上海申安

涡旋仪Vortex 其林贝尔

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

根据GenBank中牛分支杆菌基因组独特的229bp序列(GenBankAccession No：AJ 003103)，应用Primer premer5.0软件设计引物和探针，使引物退火温度在55-65℃、GC含量40-60％，产物大小在100-250bp之间，引物的3’端避免使用碱基A、避免出现3个以上连续相同的碱基，探针位置尽可能地靠近上游引物，探针长度20-30bp，Tm值65-70℃，GC含量40-70％，探针5’端避免使用碱基G，碱基C的含量要高于G，设计好的引物和探针满足这些设计原则后，使用BLAST进行核实，确认各引物及探针的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

①229bp序列传统PCR引物：

上游引物：5’-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3’

下游引物：5’-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3’

扩增产物片段大小：752bp

②229bp序列荧光定量PCR引物和探针：

上游引物：5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’

下游引物：5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’

探针：5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’

扩增产物片段大小：145bp

1.2.2标准质粒的构建

1.2.2.1目的基因的扩增

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，用传统PCR引物，扩增目的片段。反应体系为50μL，在0.2ml PCR反应管中加入以下试剂：

试剂加样量(μL)

牛分枝杆菌基因组DNA 1

Pfu DNA聚合酶缓冲液 5

dNTP(2.5mmol/L) 4

上游引物(10mmol/L) 1

下游引物(10mmol/L) 1

Pfu DNA聚合酶 1

灭菌去离子水 37

混匀后放入PCR扩增仪进行扩增，反应程序如下：

1.95℃预变性5min

5.72℃延伸10min

反应结束后，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，与DNAMarker比较，如果与引物所限定的目的片段大小一致，则可进行后续实验。

1.2.2.2PCR产物的回收

用OMEGA公司的Gel extraction kit对传统PCR产物进行切胶回收，步骤如下：

(1)将PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳；

(2)在紫外透照台上将目的片段快速切下，放入已经称重的两个1.5mL Eppendorf管中，然后称重，得出胶块的重量；

(3)根据胶重按每毫克加一微升的量加入结合缓冲液，放55-60℃金属浴中加热直至胶完全溶解，期间每隔2-3min振荡混合，使之充分融化；

(4)吸取200μL Buffer GPS平衡缓冲液至装有Hibind DNA结合柱的2mL收集管，室温放置3-5min，室温下12000xg离心2min，弃掉收集管中滤液，将柱子重新装回收集管；

(5)将溶胶转入结合柱中，室温下10000xg离心1min；

(6)弃掉滤液，向结合柱加入300μL结合缓冲液，10000xg离心1min；

(7)弃掉滤液，向结合柱中加入700μL SPW洗涤缓冲液(含无水乙醇)，10000xg离心1min；

(8)弃掉滤液，重复(7)一次；

(9)弃掉滤液，13000xg离心2min，将液体甩干。

(10)将结合柱转移至一新的1.5ml Eppendorf管中，加入30μL ddH₂O或洗脱缓冲液于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心1min，弃掉结合柱，管中为回收的DNA片段。

(11)取2μL回收的DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度，剩余DNA置于-20℃保存备用。

1.2.2.3目的基因的克隆

(1)连接

将切胶回收目的片段连接在PGEM-T easy载体上，依次加入以下试剂，反应体系(10μL)如下：

试剂加样量(μL)

目的片段 3

2×快速连接缓冲液 5

PGEM-T Easy载体 1

T₄ DNA连接酶 1

置于4℃恒温水浴箱连接过夜。

(2)连接产物的转化

①将感受态细胞从-80℃冰箱中取出之后置于冰上融化；

②取3μL连接产物加入融化后的感受态细胞中，轻轻混匀；

③冰浴30min；

④42℃水浴热激90s，再在冰上冷激2min；

⑤加入80μL无抗性的经37℃预热的LB液体培养基，37℃150rpm震荡培养90min；

⑥3000rmp离心2min，弃掉部分上清，留下约100μL液体，然后重悬，加入7μL IPTG和40μL X-gal，用涂布棒涂布于有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养约12-16小时，然后进行蓝白斑鉴定。

1.2.2.4重组质粒的筛选与鉴定

①挑取白斑于5mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃200rmp振荡培养12-16个小时；

②以培养好的菌液为模板进行PCR鉴定；

③将PCR测定为阳性的菌液进行保菌，取700μL菌液加300μL灭菌甘油于1.5mL Eppendorf管中，混匀，标记后放入-80℃冰箱中保存待用；

④将PCR鉴定阳性的菌液进行测序，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.2.2.5重组质粒的提取

将测序阳性的菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I进行阳性质粒的提取，步骤如下：

(1)取测序阳性的保存菌液200μL于3mL有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃200rmp振荡培养12-16个小时；

(2)取2mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，室温下10000xg离心1min；

(3)弃掉上层培养液，向细菌沉淀中加入250μL Solution I(含RNase A)，涡旋混匀；。

(4)加入250μL Solution II，上下颠倒4-6次，轻轻混匀，室温下温育2min；

(5)加350μL Solution III，轻轻混匀至出现白色絮状物，然后室温下13000xg离心10min；

(6)小心转移上清液到一个2mL的装有DNA结合柱的收集管中(DNA结合柱的平衡方法同切胶回收)，室温下10000xg离心1min；

(7)弃滤液，加500μL缓冲液HB，10000xg离心1min，除去蛋白；

(8)弃滤液，加700μL DNA洗涤缓冲液(含无水乙醇)，10000xg离心1min；

(9)弃滤液，重复(8)一次；

(10)弃滤液，13000xg离心2min，将液体甩干；

(11)将结合柱转移至一新的1.5ml Eppendorf管中，加入30μL ddH₂O或洗脱缓冲液于结合柱中，室温静置2min，13000xg离心1min，弃掉结合柱，管中为提取的质粒DNA，置于-20℃保存；

(12)取2μL质粒DNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度。

1.2.2.6质粒拷贝数的计算和倍比稀释

通过测出的阳性质粒浓度，计算重组质粒的拷贝数。公式如下：

拷贝数＝质粒浓度(g/μL)×加样体积×阿弗加德罗常数/(质粒总长度×一个碱基对的平均分子量)，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×10²³拷贝/mol，一个碱基对的平均分子量是660道尔顿，最后根据拷贝数将质粒进行10倍的倍比稀释。

1.3FQ-PCR方法的建立

取1μL提取的阳性质粒DNA作为模板，用229bp序列荧光定量PCR引物和探针，按照如下体系配置，设阴性对照时以无菌水代替质粒DNA模板进行。

使用单混PCR试剂时的反应体系(25μL)：

成分体积(μL)

10×PCR缓冲液(Mg²⁺ free) 2.5

MgCl₂(25mM) 2

dNTP(10mM) 0.5

rTaq酶 0.5

上游引物(10μM) 1

下游引物(10μM) 1

探针(10μM) 1

模板DNA 1

ddH₂O 15.5

使用PCR Mix时的反应体系(25μL)：

成分体积(μL)

2×PCR Taq Mix 12.5

上游引物(10μM) 1

下游引物(10μM) 1

探针(10μM) 1

模板DNA 1

ddH₂O 8.5

反应液配好后，瞬时离心，将样品管放入Bio-Rad公司的miniopticon PCR仪，用Opticon Monitor 3软件进行程序设置及结果分析，PCR反应程序如下：

第一步：95℃预变性5min

第四步：采集荧光

1.3.1PCR反应条件的优化

1.3.1.1退火温度的优化

根据引物Tm值，退火温度按48.0℃、48.9℃、50.5℃、52.8℃、55.4℃、57.6℃、59.2℃、60℃依次递增，确定最佳退火温度。

1.3.1.2Mg²浓度的优化

实验中将MgCl₂(25mmol/L)的量以0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL依次递增。从多次重复实验中选定最佳MgCl₂用量。

1.3.1.3引物和探针浓度的优化

将上游引物和下游引物(10μmol/L)按体积比1∶1混合，依次加0.6μL、1μL、1.4μL、2μL、2.6μL、3.4μL、4μL，探针(10μmol/L)依次加0.3μL、0.5μL、0.7μL、1μL、1.3μL、1.7μL、2μL同时进行优化，根据最大ΔRn值和最小Ct值确定最佳引物用量。

1.3.1.4rTaq酶用量的优化

将Taq酶(5U/μL)以0.1μL、0.3μL、0.5μL、0.7μL、0.9μL、1.2μL、1.5μL递增，根据扩增曲线情况确定Taq酶最佳用量。

1.3.2敏感性检测

将10¹-10⁷拷贝/μL的浓度梯度的阳性重组质粒，在优化后的最佳反应条件下同时扩增，每个稀释度均作重复，由计算机自动绘制一条标准曲线。根据曲线的荧光信号强度、斜率和相关系数等判定敏感性。

2.3.3特异性检测

用以上菌液和核酸样品为模板，相同的条件下进行荧光定量PCR扩增，每次扩增设阴阳性对照，鉴定荧光定量PCR方法的特异性。

2结果与分析

2.1PCR扩增电泳结果

以提取的牛分枝杆菌基因组DNA为模板，用合成的传统PCR引物进行扩增，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000 DNA Marker为标准，结果如图1所示，从图1可以看出，扩增出的特异性片段，与预期的大小一致，229bp序列的传统PCR扩增产物大小是752bp，可以进行后续实验。

2.2质粒拷贝数计算结果

PGEM-T easy载体长度为3015bp，229bp序列的目的片段长度为752bp；

229质粒拷贝数＝189ng/μL×1μL×6.02×10²³/(3015+752)×660＝4.58×10¹⁰拷贝，根据拷贝数将质粒稀释成1×10¹⁰拷贝/μL，然后进行10倍的倍比稀释。

2.3FQ-PCR反应条件优化结果

本发明采用两种配制体系进行比较研究，通过比较结果判定试剂的优越性，为试剂盒的制作提供有利证据。

2.3.1单混PCR试剂时反应条件的优化

(1)退火温度的优化

退火温度对PCR反应有一定的影响，温度越高，反应的特异性越强，但是扩增效率则会下降；反之，温度降低，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却可能受到影响。PCR反应过程中，如果退火温度过低就会产生非特异性扩增，一般来讲，应选择较高的退火温度，以减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性。从表1和图2中可以看出，在本发明中，退火温度将轻微影响荧光信号的强度，而对扩增效率没有明显影响。本发明选择50.5℃作为实际采用的退火温度，目的是兼顾反应的特异性和扩增效率。

表1不同退火温度与对应Ct值

(2)Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺是Taq DNA聚合酶活性所必需的。因此，反应中优化Mg²⁺浓度是十分有益的。Mg²⁺浓度除影响酶活性和酶的忠实性外，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg²⁺浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg²⁺结合，降低Mg²⁺实际浓度。Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg²⁺。因此，PCR中Mg²⁺的加入量要比dNTP浓度高。Mg²⁺浓度降低时，反应的特异性加强，但是扩增效率明显下降；反之，Mg²⁺浓度升高，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却受到影响。从表2和图3中可以看出，对于荧光PCR而言，由于本身特异性较强，Mg²⁺浓度对扩增曲线的荧光信号强度有一定的影响。本发明选择Mg²⁺浓度2.5mmol/L作为扩增时实际采用的Mg²⁺浓度。

表2不同Mg²⁺浓度与对应Ct值

(3)引物、探针浓度的优化

引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加，还会使背景荧光值增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。如表3和图4所示，根据最大荧光信号强度和最小Ct值确定最佳引物用量为2.6μL，探针用量为1.3μL，即引物和探针的终浓度分别为1.04μmol/L和0.52μmol/L。

表3不同浓度的引物和探针与对应Ct值

(4)rTaq酶用量的优化

由表4和图5可以看出酶的用量为0.9μL时，荧光信号强度最大，说明产物的生成量最大，Ct值较小，说明敏感性较高，考虑用量的节约，将0.9μL定为酶的最佳用量。

表4不同rTaq酶浓度与对应Ct值

2.3.1使用PCR Mix时反应体系的优化

(1)退火温度的优化

由表5和图6可以判断出，最佳退火温度是55.4度。

表5使用PCR Mix时不同退火温度与对应Ct值

(2)引物、探针浓度的优化

如表6和图7可以判断出，引物的最佳用量是2.6μL，探针最佳用量1.3μL，引物和探针的最终浓度分别为1.04μmol/L和0.52μmol/L。

表6不同浓度的引物和探针与对应Ct值

2.4灵敏度检测

(1)使用单混PCR试剂时标准曲线的建立

如图8所示，为229bp标准质粒的扩增曲线，其中横轴代表Ct值，纵轴代表荧光值。图中曲线组由左向右所代表的起始浓度成10倍依次递减，最右边为空白对照。

如图9所示，为229bp标准质粒的标准曲线，其中横轴表示Ct值，纵轴表示起始模板浓度(1g)。将标准质粒进行10倍梯度稀释，取7个浓度的稀释样品做模板。

相关系数＝0.996(＞0.98)，表明不同梯度定量模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，由PCR扩增通式可知标准曲线的斜率为-log(1+E)，即扩增效率E＝10^-斜率-1＝10^-(-0.2897)-1＝0.95(1.2＞E＞0.8)，拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为Y＝-0.2897X+11.93。

表7 229bp序列质粒DNA不同稀释倍数与对应Ct值

由表7可以看出10个拷贝数的Ct值超出35个循环，经过重复验证表明是特异性扩增，并非假阳性。

(2)使用PCR Mix时标准曲线的建立

如图10所示，为229bp标准质粒的扩增曲线；图11为229bp标准质粒的标准曲线。

相关系数＝1，扩增效率＝99％，拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为Y＝-0.2991X+11.49

表8229bp序列质粒DNA不同稀释倍数与对应Ct值

由表8可知，使用PCR Mix比使用单混PCR试剂时的敏感性要高，相关系数和扩增效率都比较好，所以选用PCR Mix进行Taqman荧光定量PCR效果和准确率高，而且方便快捷，更适用于生活中牛分枝杆菌的检测。

2.5特异性检测

由图12所示，牛分枝杆菌标准株、牛分枝杆菌分离株和卡介苗呈阳性，其他试验样品呈阴性，证明了探针对牛分枝杆菌的专一性，将牛分枝杆菌与牛结核病的其他病原体进行明确区分。

使用本发明探针检测牛分枝杆菌特异性实验结果如表9所示。

表9特异性实验结果

试验样品	Ct值
		结核分支杆菌分离株	N/A
结核分支杆菌H37Rv标准株	N/A
		牛分枝杆菌分离株	22.76
牛分枝杆菌标准株	17.87
		卡介苗(BCG)	16.90
金黄色葡萄球菌	N/A
		副结核分枝杆菌	N/A
胞内分枝杆菌	N/A
		龟分枝杆菌	N/A
堪萨斯分枝杆菌	N/A
		胃分枝杆菌	N/A
偶发分枝杆菌	N/A
		禽分枝杆菌	N/A
阴性对照	N/A

3讨论

本发明应用blast对测序后的序列进行了同源性分析，其扩增序列与原序列完全一致。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其扩增的片段大小与预期大小一致，说明所扩增的片段为目的片段，可以用于对牛分支杆菌和结核分支杆菌的检测。用含有目的片段的质粒做标准质粒，并且通过计算得出其拷贝数，进行准确定量，提高了建立牛分支杆菌检测方法的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

序列表<110>中国检验检疫研究院<120>牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法<130>KHP10112159.0<160>5<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1tgaagtagta atgtgcgagc tgag 24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cgttgtaggc cactccaaga g 21<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列 <400>3cgcttctgca cgactacggc ttgtatga 28<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4atcgtgaatc gtcgagtgat g 21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5acccagaagg cgaacaga 18

Claims

1.一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其中，

上游引物为：5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；

下游引物为：5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；以及

探针为：5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。

2.一种含权利要求1所述引物及探针的检测试剂盒。

3.一种利用权利要求1所述的引物及探针检测牛分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，其中，PCR上游引物为5’-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3’，下游引物为5’-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3’，回收PCR扩增产物；

2)目的基因的克隆

3)Taqman荧光定量PCR检测

以阳性重组质粒DNA为模板，利用权利要求1所述引物及探针，进行Taqman荧光定量PCR检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中Taqman荧光定量PCR检测的退火温度为50.5℃。