CN102150046A - 组织蛋白酶c的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织蛋白酶C的用途。本发明其它方面涉及用于筛选药物、用于诊断疼痛易感性和用于治疗疼痛的方法。
Description
本发明涉及组织蛋白酶C的用途。本发明其它方面涉及用于筛选药物、用于诊断疼痛易感性和用于治疗疼痛的方法。
在西方国家，慢性疼痛是损害数百万民众的健康和幸福的主要未解决的健康问题。慢性疼痛严重折磨经历疼痛的人的健康，其经常伴随有或随后出现植物性症状，从而常常导致抑郁。慢性疼痛使得个体痛苦，产生巨大程度的社会经济费用。现有的药理学疼痛疗法在功效和安全性两方面都不能普遍令人满意。
鉴于与疼痛治疗领域相关的严重缺陷，很有必要选择新的治疗持续疼痛和与慢性疼痛潜在发展有关的诊断及预测的方法。尤其是鉴于在快速发展的对疼痛神经生物学的了解和提供有效治疗而无现有治疗领域缺陷的未满足的临床需求之间的巨大鸿沟，有需要致力于发现新型止痛药类的新靶标。
因此，本发明目的是提供用于开发并提供调节疼痛的新型药物类别的新方法。
通过使用组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物以鉴定调节疼痛的化合物来达到本目的。
本发明基于发明人意想不到的发现，第一次证明在小鼠神经性疼痛模型中组织蛋白酶C的表达与疼痛易感性密切相关。
根据疼痛研究国际学会的定义，疼痛是与实际或潜在的组织损伤有关或根据所述损伤来描述的不愉快的感觉和感情经历。疼痛通常是感受伤害的神经系统激活的结果，其特化为检测并编码损伤或潜在组织损伤。因此，疼痛是启动使身体受到的实际或潜在损伤最小化的反应的身体报警系统的一部分。疼痛可为疾病状态的原发症状，或可为通常无任何生物学意义的疾病状态继发效应。
疼痛可为急性或慢性的。急性疼痛是表示潜在或实际损伤的生理信号。它伴随组织损伤、感染、炎症或其它急性起因而发生，在身体损伤或出现机能障碍后改变个体。若急性疼痛未受到适当的治疗，其可导致慢性疼痛。
慢性疼痛是起源、持续时间、强度和特定症状不同的疾病状态。
慢性疼痛可为感受伤害起源、炎症性或神经性的。根据与躯体或内脏疼痛敏感性神经纤维的持续激活的匹配判定感受伤害性疼痛。神经性疼痛是因对外周或中枢神经组织的任何种类的损伤而产生的疼痛；据认为其通过外周神经系统或中枢神经系统或二者的异常体觉过程而得以维持(对于疼痛机理的综述，参见例如Scholz和Woolf，2002；Julius和Basbaum2001；Woolf和Mannion，1999；Wood，J.D.，2000；Woolf和Salter，2000)。
慢性神经性疼痛因患者而异。最近的数据表明，对于个体所遭受的痛苦的量，个体的疼痛易感性起着重要作用，即对于疼痛有着重要的遗传倾向，尤其是对于神经性疼痛的发展。本发明基于本发明人在啮齿动物慢性疼痛模型中旨在鉴定疼痛易感性基因(即决定在既定的固定程度的组织损伤存在下感受的疼痛量的基因)的大量研究。发明人使用的啮齿动物模型和实验设置使得在不同个体之间具有以下实验条件：a)可精确控制神经损伤的性质和一致性；和b)可使遗传及环境的变化性最小化。
组织蛋白酶C(CTSC；别名：二肽基(氨基)肽酶I、DPPI；(EC3.4.14.1))为溶酶体蛋白酶。
组织蛋白酶C的基因座位于染色体11q14.1-q14.3(参见Rao等，1997)。在NCBI核苷酸数据库中组织蛋白酶C的基因组序列可根据以下公开获取：NW_925129(包含人组织蛋白酶C序列的基因组序列，SEQ ID NO：3)或NW_001030863(包含小鼠组织蛋白酶C的基因组DNA序列)。
可在NCBI核苷酸数据库中根据若干登记号公开获得组织蛋白酶C的编码多核苷酸序列，例如：NM_001814(人组织蛋白酶C转录变体1mRNA)、BC113897(人组织蛋白酶C的全编码序列(cds)，转录变体2，mRNA)、BC109386(人组织蛋白酶C，mRNA，全cds)、NM_009982(小鼠组织蛋白酶C mRNA)。技术人员知道如何从NCBI数据库中检索其它组织蛋白酶C(其它物种的组织蛋白酶C；如果存在的话组织蛋白酶C的突变体或不同的同工型)的编码序列。如果在下文提及组织蛋白酶C编码序列，则这可意指任何以上mRNA或编码序列；优选意指符合参考编号NM_001814(人)(SEQ ID NO：1)或NM_009982(小鼠)的序列。
可在NCBI蛋白质数据库中根据以下登记号公开获得组织蛋白酶C的蛋白序列，例如人(hs)：全cds：CAA6067、AAL48191、AAL48192、AAL38195、AAH54028、AAQ08887、AAI00893、AAI00894、AAI00892、AAI00895、AAI09387、AAI10072、AAI13851；hs同工型CRA_b：EAW59364；hs同工型CRA_a：EAW59363；hs组织蛋白酶C同工型前蛋白原：NP_001805；hs同工型b前体：AAI13898或NP_680475；鼠(小鼠)组织蛋白酶C：AAH67063；前蛋白原：NP_034112；同工型CRA-b(小鼠)：EDL06796；同工型CRA-a(小鼠)：EDL06795。此外，可在UniProtKB数据库(www.beta.uniprot.org)中根据以下登记号公开获得蛋白质序列：P53634(HUMAN_CATC，人组织蛋白酶C、SEQ IDNO：2)或P97821(CATC_MOUSE，鼠组织蛋白酶C)。如果在下文提及组织蛋白酶C蛋白或氨基酸序列，这可意味着任何以上蛋白质序列；优选符合参考编号P53634(对于人序列)或P97821(对于鼠序列)的序列。
NCBI为美国生物技术信息中心(通讯地址：National Centre for Biotechnology Information，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，MD 20894，USA；网址：www.ncbi.nhm.nih.gov)。在www.beta.uniprot.org的UniProtKB数据库中可检索更多序列(例如具有SwissProt或EMBL登记号的序列)。
Paris等，1995公开了人组织蛋白酶C的克隆；Pham等，1997发表了鼠组织蛋白酶C的克隆。Rao等，1997公开了5′侧翼区(启动子/增强子)(参见尤其是第10263页图4及该页的下部的详细正文，其在此引作参考；例如从-1127开始至多到+1的基因序列)。在肺、肾和胎盘中组织蛋白酶C以高水平表达，在其它多种器官包括免疫系统细胞中以较低程度表达(Rao等，1997)。
组织蛋白酶C为能够从蛋白质底物的氨基末端除去二肽的溶酶体蛋白酶。组织蛋白酶C涉及颗粒体丝氨酸蛋白酶的激活，颗粒体丝氨酸蛋白酶在来源于骨髓的免疫系统效应细胞中表达；组织蛋白酶C参与处理和激活T-淋巴细胞粒酶A(GZMA)和B(GZMB)和粒酶C；组织蛋白酶C的进一步的功能是加工不同溶酶体组织蛋白酶、通过除去抑制性的N-末端二肽残基激活不同的丝氨酸蛋白酶(类胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶)(例如以上粒酶、组织蛋白酶C本身、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶-3、肥大细胞靡蛋白酶和类胰蛋白酶(Toomes等，1999；Pham和Ley 1999；Turk等，2000；Henningsson等，2003；McGuire等，1993；Adkison等，2002；Wolters等，2001；Pham等，2004；DeHaar等，2004；Sheth等，2003，Methot等，2007))。一般而言，其功能包括：蛋白酶活性、肽酶活性(例如二肽基肽酶、肽链外切酶或肽链内切酶活性)；激活丝氨酸蛋白酶(例如一种或多种以下酶：弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和粒酶A和B、神经氨酸酶和因子XIII)。
组织蛋白酶C是200kD的四聚体蛋白(Paris等，1995)，这与其它组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、H、L和S)为小的单体酶正好相反。组织蛋白酶C蛋白从其前原形式被加工成蛋白水解活性酶。组织蛋白酶C的成熟单体形式由重链、轻链和与活性酶连接的前肽残留(propeptide remaining)组成(Wolters等，1998；Cigic等，2000)；四个这样的组织蛋白酶C单体形成蛋白水解活性的200kD组织蛋白酶C四聚体。
Pham和Ley，1999公开了组织蛋白酶C敲除小鼠(Dppi-knock outmice)的产生(对于构建DPPI靶向载体和产生DPPI-/-小鼠，参见材料和方法部分，从第8627到8629页，尤其是第8627页右栏的第二部分到第8628页左栏的第一部分；也参见Heusel等，1994；Mansour等，1988和Soriano等，1991，对于Pham和Ley，1999，参阅胚胎干细胞产生)。
本发明用途使得可鉴定用于预防和/或治疗疼痛尤其是神经性疼痛的新型物质。本发明用途包括鉴定具有所需特性(即降低疼痛感觉)的化合物以及鉴定具有不需要的特性(即提高疼痛感觉)的化合物。此外，本发明使得可进一步表征已经被鉴定用于预防和/或治疗任何疾病或疾病状态的化合物。在这种情况下，本发明可例如用于排除具有不需要的副作用(即提高疼痛感觉)的已被鉴定的活性化合物：可就其对组织蛋白酶C(蛋白质和/或核酸、表达和/或功能等)的影响来例如分析用于既定疾病的候选化合物的特征。
用于本发明不同方面的化合物/测试化合物/活性化合物，可为借助生物化学或分子生物学方法纯化、部分纯化、合成或制备的任何生物学物质或化学物质或天然产物提取物。
认为在调节本发明不同方面的感觉中的疼痛中具有活性的化合物，可为对以下方面有影响的任何物质：组织蛋白酶C功能之一或细胞中组织蛋白酶C的量(蛋白质或核酸)、组织蛋白酶C表达、翻译后修饰(例如N-糖基化或加工(例如，在例如58或61位置裂解排除结构域(exclusion domain)))、单体的低聚反应、蛋白质折叠或激活。
为此，所述物质可调节组织蛋白酶C的任何功能(例如上面或下面列举的功能)。可通过物质例如直接与组织蛋白酶C多肽/蛋白质或其片段作用或干扰它们来调节组织蛋白酶C蛋白活性。所述物质亦可调节组织蛋白酶C表达，例如在转录水平(启动、延伸、加工等)上、转录稳定性、翻译方面来调节。此外，所述物质可在以下方面调节组织蛋白酶C：翻译后修饰，从无活性加工为活性形式(前原形式裂解为三个形成活性单体的多肽)；和/或从单体寡聚化为四聚体形式；以及蛋白质折叠等。所述物质可直接或间接发挥以上作用(间接的意思即通过干扰(正向或负向)对组织蛋白酶C的功能/蛋白活性/表达等有影响的天然信号转导级联)。
组织蛋白酶C的功能包含以上列举的功能，例如：蛋白酶活性；从一种或多种蛋白质底物的氨基末端除掉二肽的能力；与一种或多种蛋白质底物特异性作用的能力(蛋白质间的相互作用)，例如以上列举的那些；裂解和/或激活一种或多种蛋白质底物的能力，例如以上列举的那些；加工蛋白质底物的能力，例如以上列举的那些。
组织蛋白酶C的功能通常还包括组织蛋白酶C蛋白或核酸或其片段与其它分子(包括但不限于蛋白质、核酸、合成分子)相互作用的能力，优选涉及其相互作用的能力及裂解蛋白质底物的能力。
根据本申请，酶底物理解为可由酶修饰的任何分子。本发明范围内天然存在的底物为对应于其在天然生理学或病理学环境(例如颗粒体丝氨酸蛋白酶、GZMA、GZMB)中存在的形式并且亦能被相应的酶修饰的分子。
疼痛调节可为降低或升高。
根据本相关发明组的一个方面，可使用组织蛋白酶C的片段或衍生物。片段可为蛋白质、多肽或多核酸片段。
蛋白质或多肽片段为当与全长组织蛋白酶C比较时，携带一个或多个末端(n-和/或c-末端)和/或一个、两个或多个内部氨基酸缺失的蛋白质或多肽；片段包括例如：
1.在其氨基酸链中携带二肽Xaa-Yaa、Zaa-的n-末端缺失的组织蛋白酶C片段，当Xaa为Arg或Lys，或者Yaa或Zaa为Pro时特别除外；
2.其中信号肽(氨基酸链的1-24位氨基酸)缺失的组织蛋白酶C片段，或由25-463位氨基酸组成的组织蛋白酶C片段；
3.包含SEQ ID NO：2(二肽基-肽酶1排除结构域链)氨基酸链的25-134位或由其组成的组织蛋白酶C片段；
4.其中缺失前肽(135-230位氨基酸)的组织蛋白酶C片段；
5.包含二肽基肽酶1重链(231-394位氨基酸)或由其组成的组织蛋白酶C片段；
6.包含二肽基肽酶1轻链(395-463位氨基酸)或由其组成的组织蛋白酶C片段；
7.包含二肽基肽酶1轻链(395-463位氨基酸)和重链(231-394位氨基酸)的组织蛋白酶C片段；
8.包含二肽基肽酶1轻链(395-463位氨基酸)和重链(231-394位氨基酸)的组织蛋白酶C片段；
以上片段位置参考SEQ ID NO：2；以上片段的优选实例涉及SEQID NO：2的蛋白质片段。
组织蛋白酶C蛋白的功能片段为具有至少一种或多种全长蛋白功能特性(尤其是上文列举的特性)的该蛋白的任何片段。
多核苷酸片段为当与全长基因组或编码序列比较时，携带一个或多个末端(5’-和/或3’-末端)和/或一个、两个或更多个内部核苷酸缺失的多核苷酸或寡核苷酸。组织蛋白酶C核酸的功能片段为具有至少一种或多种全长多核酸(mRNA、基因组或编码序列)功能特性的任何片段。
术语组织蛋白酶C衍生物包括，与天然存在的形式比较，尤其是与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO2的组织蛋白酶C比较，组织蛋白酶C的除缺失外的任何修饰类型。组织蛋白酶C的功能衍生物为具有至少一种并优选两种或更多种未修饰的蛋白的功能特性的该蛋白的任何衍生物。衍生物包括例如氨基酸或核苷酸序列的修饰或任何其它种类的修饰，例如导致例如使多肽或多核苷酸稳定的化学或生物学修饰(例如核酸骨架的硫代磷酸修饰或氨基酸之间键的交换等)，或使多肽或多核苷酸特异性靶向某些细胞或促使其进入细胞或由细胞摄取的修饰(例如细胞渗透磷酸肽，邻位偶联于(ortho coupling)细胞渗透肽载体，例如基于触角(antennapedia)/渗透，基于TAT和信号-肽的序列；或偶联于针对特定转运蛋白或输入物(importer)的配体部分)。
本发明还包括组织蛋白酶C片段的功能衍生物。
本发明另一方面涉及异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的非人转基因动物用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
非人动物可为任何非人动物。优选为啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
转基因动物为在其基因组中携带特意转入其中的外源DNA的动物。可按照标准程序将外源DNA引入动物基因组(参见例如TransgenicAnimal Technology A Laboratory Handboook.C.A.Pinkert编辑；Academic Press Inc.，San Diego，California，1994(ISBN：0125571658)。
术语异源表达是指不同于在宿主生物体中正常基因表达的表达(涉及表达的基因的稳态水平、量、时机或组织分布，或涉及表达基因类型(即所述基因通常根本不在该宿主中表达))。异源表达可为组成型或诱导型。合适的诱导型表达系统在本领域众所周知(例如四环素(Tetracycline)诱导型系统等)。生物体可为细胞或非人动物。
另一方面，本发明涉及异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的非人转基因动物作为用于提高疼痛敏感性的模型系统的用途。
本发明又一方面涉及非人组织蛋白酶C敲除动物用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
敲除生物体(例如动物或细胞)是指其中部分或全部缺失基因表达或功能的生物体，包括基因组敲除以及功能敲除、诱导型敲除以及组成型敲除。敲除生物体的产生以及可用于产生敲除生物体的细胞或动物为本领域所熟知。组织蛋白酶C-敲除小鼠的产生阐述于Pham和Ley，1999中。
本发明再一方面涉及非人组织蛋白酶C敲除动物作为降低疼痛敏感性的模型系统的用途。
异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的细胞用于鉴定调节疼痛的化合物的用途是本发明另一方面。
细胞可为任何原核或真核细胞，例如能够用核酸载体转染并表达报告基因的细胞。这些细胞包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，例如包含来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或酿酒酵母(s.cerevisiae))的细胞的真核细胞培养物，或原核细胞培养物(优选毕赤酵母属(Pichia)或大肠杆菌(E.coli))。可通过熟知技术获得来源于组织的细胞和样品，所述技术例如采血技术、组织穿刺技术或外科手术技术。
根据一个实施方案，使用与其未修饰状态相比具有较低组织蛋白酶C活性的修饰细胞。因此，如果待测化学化合物能够提高或回复降低的或全部废除的组织蛋白酶C活性，则例如可以对其进行试验。或者，在疼痛敏感性降低情况下，不管所述物质是否能实施其功能(例如疼痛调节或甚至是在另一疾病状态或疾病的情况中的功能)，都可对其进行试验。
修饰可为任何修饰类型(稳定或瞬时，优选稳定)，所述修饰导致降低组织蛋白酶C的活性、组织蛋白酶C转录稳态水平(即通过激活组织蛋白酶C转录或转录物稳定性)或组织蛋白酶C蛋白稳态水平(即通过激活组织蛋白酶C翻译或其翻译后加工；通过调节组织蛋白酶C翻译后修饰或通过激活其稳定或通过抑制其降解)。这可例如通过以下方法来实现：使用组织蛋白酶C的显性负向突变体、反义寡核苷酸、组织蛋白酶C的RNAi构建体，产生功能或基因组组织蛋白酶C敲除(其可例如为诱导型)或本领域已知的其它合适的技术。对于以上技术的综述，参见例如：Current protocols in Molecular biology(2000)J.G.Seidman，第23章，附录52，John Wiley和Sons，Inc.；Gene Targeting：a practical approach(1995)，编辑：A.L.Joyner，IRL Press；GeneticManipulation of Receptor Expression and Function，2000；Antisense Therapeutics，1996；Scherr等，2003。
按照一个实施方案，使用组织蛋白酶C敲除细胞。用于产生敲除的合适的细胞系在本领域内众所周知，参见例如Current protocols in Molecular Biology(2000)J.G.Seidman，第23章，附录52，John Wiley和Sons，Inc；或Gene Targeting a practical approach.(1995)编辑A.L.Joyner，IRL Press。Pham和Ley，1999(DPPI鼠胚胎干细胞敲除克隆的产生，参见第8628页，左栏，上部)亦公开了组织蛋白酶C(DPPI)敲除细胞的产生。
因此，本发明另一方面涉及组织蛋白酶敲除细胞用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
此外，组织蛋白酶敲除细胞作为降低疼痛敏感性的模型系统的用途是本相关发明组的另一方面。
按照本发明另一实施方案，与参考细胞(例如处于其未修饰状态的同样的细胞)比较，所述细胞可具有较高量的组织蛋白酶C。该细胞系统可用于模拟疼痛敏感性提高的状态，因为组织蛋白酶C的表达量与疼痛敏感性相联。
因此，本发明还涉及异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的细胞作为提高疼痛敏感性的模型系统的用途。
异源表达与组织蛋白酶C启动子和/或增强子或其功能片段表达上连接的报告基因的细胞用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
本发明以上方面基于本领域通常已知的典型报告基因测定。为此，将选择的启动子插入适于所选宿主细胞类型的表达载体中，以当启动子有活性时允许报告基因表达的方式位于所选报告基因上游。随后将构建体引入到所选宿主细胞中。合适的转化或转染方法以及用于细胞培养和报告基因表达检测的条件在本领域众所周知(参见例如以下所列标准文献)。合适的条件以及载体、报告基因和必要试剂(其亦可市购)在本领域众所周知。
载体为环形或线性多核苷酸分子，例如DNA质粒、噬菌体或粘粒，多核苷酸片段(例如从其它载体切下或通过PCR扩增并插入到克隆载体中的多核苷酸片段)借助其可在合适的细胞或生物体中特异性扩增。表达载体使得在宿主细胞或生物体中能够异源表达目的基因(例如报告基因)。所述细胞或生物体类型主要取决于目的并且对其选择是在技术人员知识范围内。用于扩增核酸的合适的生物体例如主要是具有高繁殖率的单细胞生物体，例如细菌或酵母。合适的生物体亦可为从多细胞组织分离和培养的细胞，例如从各式各样生物体产生的细胞系(例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera Frugiperda)的SF9细胞等)。合适的克隆载体为本领域所知，其购自不同的生物技术供应商，例如RocheDiagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratagene及其它更多。合适的细胞系例如购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
为了异源表达蛋白质或多肽，细胞可为能够用核酸载体转染并表达目的基因(例如报告基因)的任何原核或真核细胞。这些细胞包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，优选包含来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HEK293、RIN-5F、HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞的真核细胞培养物，或原核细胞培养物(优选毕赤酵母属或大肠杆菌)。可通过熟知技术获得来源于组织的细胞和样品，所述技术例如采血技术、组织穿刺技术或外科手术技术。
在本申请情况中，术语“转染”是指将核酸载体引入到宿主细胞(原核或真核)，因此包括术语“转化”。
转染可为稳定转染或瞬时转染。
组织蛋白酶C启动子是组织蛋白酶C基因的部分，若将所述部分引入合适的表达载体中位于编码基因产物的序列的上游，其能够驱动目的基因产物表达。优选组织蛋白酶C启动子包含由Rao等(1997)第10263页图4所公布的核苷酸序列-1127到+1或由其组成。组织蛋白酶C启动子的功能片段为组织蛋白酶C启动子的任何片段，若将所述片段引入合适的表达载体中位于编码基因产物的序列的上游，其能够驱动目的基因产物表达。优选片段包含由Rao等(1997)第10263页图4所公布的组织蛋白酶C启动子的功能片段。
报告基因可为可供容易地定量测定其基因产物的任何基因。大量用于真核或原核宿主的报告基因以及检测方法和必要试剂为本领域所知并可市购。这些报告基因包括例如β内酰胺酶(lacZ)、荧光素酶、绿色或蓝色荧光蛋白(GFP或BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1或LEU2或β-半乳糖苷酶等的基因。这些基因编码可借助可见(颜色或发光)反应容易地被检测的蛋白(例如lacZ、荧光素酶)。这些蛋白包括可借助可见(颜色或发光)反应或表达时赋予对抗生素例如氨苄青霉素(Ampicillin)或卡那霉素(Kanamycin)抗性的基因产物容易地被检测的基因产物。其它报告基因产物使得表达细胞能在某些条件下生长，例如营养缺陷型基因。
报告基因的功能片段是使得能容易地定量测定其基因产物的既定报告基因的任何片段。
报告基因的功能片段是使得能容易地定量测定其基因产物的既定报告基因的任何片段。
在本申请情况中，术语“转染”是指将核酸载体引入到宿主细胞(原核或真核)，因此包括术语“转化”。
转染可为稳定或瞬时转染。
细胞可为能够用核酸载体转染并表达报告基因的任何原核或真核细胞。这些细胞包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，优选包括来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞的真核细胞培养物，或原核细胞培养物(优选毕赤酵母属或大肠杆菌)。可通过熟知技术获得来源于组织的细胞和样品，所述技术例如采血技术、组织穿刺技术或外科手术技术。
在本发明以上方面情况中，对照载体可为包含报告基因或其功能片段的任何合适的载体，但其中报告基因的表达不是由(功能性)组织蛋白酶C启动子驱动。这可例如意味着报告基因或其功能片段没有可操作地连接于功能性组织蛋白酶C启动子(即完全缺乏组织蛋白酶C启动子，包括无功能的组织蛋白酶C启动子或启动子片段或其中启动子和报告基因的连接不是功能性的)。另一可能性是报告基因或其功能片段可操作地连接于不同于组织蛋白酶C启动子的另一启动子(例如SV40或另一标准启动子)。还可将功能载体和对照载体转染到同一个细胞中，但在这种情况下报告基因需要有差异。
可例如按照下述或本领域已知测定来进行符合以上用途的化合物的鉴定。
测定为用于监测生物学过程的任何分析方法或系统类型。适宜地，在细胞或生物化学(体外)系统中重现代表生理代谢途径部分以及病理病况部分的分子级联及机制。因此，可根据其干扰或调节这些级联或机制的能力来测定潜在药物化合物的药理活性。
对于在药物筛选中的应用，尤其是对于新型药物化合物的高通量筛选，所述测定必须可重复，并还优选可升级改进及稳定。在本发明范围内，高通量筛选意指本发明方法用含几毫升乃至几纳升或甚至更少的极小体积的样品在极小范围例如在96、386或1536孔板上实施。因此，在短时间内可分析极大量的样品。高通量筛选主要包括借助一个单一测定来对大约500.000个不同化合物进行针对某种能力的筛选。所述测定优选适用于针对调节研究中的靶分子的活性的能力来高通量筛选化学物质。测定类型取决于例如所用靶分子的类型(例如多肽或多核苷酸)以及测定该靶分子活性所依据的“读出”即参数(参见下文)。
不同类型的所述测定通常为本领域所知，并且可从供应商处购买。
用于不同目的的合适的测定包括放射性同位素或荧光测定，例如荧光偏振测定(例如商业上由Panvera提供的测定)，或用于测量标记成员与非标记成员的相互作用(例如标记的蛋白与其未标记的蛋白-配体的相互作用)的Packard BioScience(HTRF；ALPHAScreenTM)。
更多实例包括基于细胞的测定，其中细胞系稳定(诱导型或非诱导型；染色体或附加型)或瞬时表达重组目的蛋白。这些测定包括例如报告基因测定，其中根据报告酶的活性来测量对某些启动子或信号转导级联成员的信号转导途径的调节，所述报告酶的表达在所述某些启动子的调控之下。对于这种类型的测定，重组细胞系需构建成含有受限定的启动子调控的报告基因，所述启动子本身正被研究或受研究中的信号转导级联调控。合适的报告酶通常为本领域所知，其包括萤火虫荧光素酶、海肾(renilla)荧光素酶(例如由Packard reagents市售)、β-半乳糖苷酶。合适的细胞系视测定目的而定，但通常包括易于转染和易于培养的细胞系，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
对于测定蛋白酶活性，已知典型的蛋白酶测定方式：例如用在底物的某一位置携带报告标签(例如发射冷光/荧光或其它信号的蛋白质/肽或实体)和在另一位置携带猝灭剂(实体(例如抑制报告标签信号发射的另一种肽，只要底物是完整/未裂解的即可))的底物；让底物与组织蛋白酶C在合适条件下孵育，使得底物裂解，从而导致可检测信号(例如光发射)因为猝灭剂和报告标签的分离而发射。
其它测定类型和其它“读出”类型在本领域内众所周知。
本发明测定涉及：
鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少两份样品；
b.让含有组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的一种样品与化合物接触；
c.在化合物存在下测定组织蛋白酶C的活性；
d.在缺乏化合物时测定组织蛋白酶C的活性；和
e.将c)的组织蛋白酶C活性与d)的组织蛋白酶C活性进行比较。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物与测试化合物接触；和
b.测定所述测试化合物是否调节组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的活性。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让具有可检测量或活性的组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的细胞与测试化合物接触；
b.测定该测试化合物是否能够调节细胞中存在的组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的量或活性。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让编码组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的核酸与测试化合物在转录活性系统中接触；和
b.测定在所述化合物存在下在所述系统中存在的编码组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的mRNA的量；和
c.测定该化合物是否能够调节所述系统中存在的编码组织蛋白酶C蛋白或功能片段或衍生物的mRNA的量。
转录活性系统为至少具有进行转录单元的转录反应能力的任何生物化学或细胞系统。所述系统为本领域熟知，包括市售细胞以及体外转录系统或试剂盒(例如基于细胞提取物)。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.提供用包含可操作地连接于报告基因或其功能片段的组织蛋白酶C基因或其功能片段的启动子的核酸载体转染的细胞；
b.提供用包含没有可操作地连接于功能组织蛋白酶C启动子的报告基因或其功能片段的对照载体转染的细胞；
c.测定在测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性；
d.测定在没有测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性。
用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.选择作为测试化合物调节组织蛋白酶C活性的化合物；和
b.将所述测试化合物给予感觉疼痛的受治疗者，以测定疼痛是否受到调节。
在受治疗者中鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
c.测定在一种或多种测试化合物存在下组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的生物学活性，以鉴定一种或多种调节组织蛋白酶C生物学活性的调节化合物；和
d.测定一种或多种调节化合物降低受治疗者疼痛、疼痛感觉或疼痛敏感性的能力。
本发明另外方面涉及用于给患者群分类并帮助医生调整/改进其对个体患者的治疗的药物基因组学方法，例如：
用于分析个体痛阈的方法，所述方法包括与一种或多种参考样品比较分析所采的所述个体样品中的组织蛋白酶C的量，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量，其中存在较高的量表明所述个体的疼痛敏感性增加，存在较低的量表明所述个体的疼痛敏感性降低。
用于调整预防和/或治疗个体疼痛的药物剂量的方法，所述方法包括检查所采的个体样品，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶CmRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量，所述剂量根据所采个体样品中的蛋白质和/或mRNA的量是否不同于一种或多种参考样品中的蛋白质和/或mRNA的量来调整，其中在所采个体样品中组织蛋白酶C的量较高表明需要较高剂量，在个体样品中组织蛋白酶C的量较低表明需要较低剂量。
本文所用术语“所采样品”指采集自/分离自一个或多个个体生物体(人或非人动物)的生物样品。生物学材料和生物样品包括例如细胞、组织或器官的制备物或部分(例如大脑、血液、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、血管等)，优选来源于脊椎动物，更优选来源于哺乳动物，包括人。还包括来自细胞培养物的细胞，优选包含来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞的真核细胞培养物，或原核细胞培养物(优选毕赤酵母属或大肠杆菌)。可通过熟知技术获得来源于组织的细胞和样品，所述技术例如采血技术、组织穿刺技术或外科手术技术。重组分子的制备和来自细胞或组织的天然存在的分子的纯化以及细胞或组织提取物的制备为本领域技术人员所熟知(亦参见例如下文列举的标准文献)。
术语“参考样品”是指采集自具有已知既定疼痛表型的一个或多个个体的生物样品，或指体外生物样品(例如来源于体外细胞或组织培养物的样品(例如培养的细胞))，其在某些特性(例如组织蛋白酶C活性、量或表达水平)上对应于既定疼痛表型(例如高疼痛敏感性或低疼痛敏感性)。
本发明又一方面涉及用于检测组织蛋白酶C的工具(means)在用于通过分析采自待检个体身体的生物样品来测定个体提高的疼痛敏感性中的用途。
用于检测组织蛋白酶C的工具可为能够特异性检测生物样品中存在的组织蛋白酶C多肽/蛋白质或核酸的任何工具。
特异性检测组织蛋白酶C蛋白或多肽的工具也可为能特异性检测野生型组织蛋白酶C蛋白/多肽的任何工具，并且还可为特异性检测具有与野生型多肽/蛋白质相比一个或多个关于大小或氨基酸序列的突变的组织蛋白酶C蛋白/多肽的工具。所述工具的优选实例为能够特异性检测组织蛋白酶C蛋白的抗体，例如用于免疫组织学或免疫组织化学技术(例如检测在组织学组织切片中组织蛋白酶C蛋白或其某些突变或固定在合适载体例如膜、芯片、ELISA板等上的组织蛋白酶C蛋白)。组织蛋白酶C抗体可市购，例如山羊抗-人组织蛋白酶C，货号AF1071，R&D Systems(Minneapolis，USA)、山羊抗-小鼠组织蛋白酶C，货号BAF1034，R&D Systems(Minneapolis，USA)。
特异性检测组织蛋白酶C核酸的工具可例如为检测组织蛋白酶CmRNA/cDNA或基因组DNA(野生型或还具有与野生型组织蛋白酶C核酸相比关于其长度或其核酸序列的一个或多个突变)的工具。所述工具可例如为特异性检测和/或定量测定组织蛋白酶C mRNA的工具，并优选包括或为特异性组织蛋白酶C核酸探针或引物组，所述核酸探针或引物组能够扩增组织蛋白酶C DNA，或例如用于PCR测序(用于检测核苷酸序列中的突变)，或能够扩增组织蛋白酶C cDNA，例如用于RT PCR(用于检测和/或定量测定组织蛋白酶C mRNA的表达)。另一工具可例如为核酸探针，其能够在标准条件下与组织蛋白酶CmRNA或cDNA特异性杂交，例如用于RNA杂交或芯片杂交技术。
术语野生型是指在自然界或在既定生物体的标准实验室品种中发现的基因型或表型。根据一个优选实施方案，组织蛋白酶C的野生型序列为SEQ ID NO：1、2、3的序列。
合适的引物的设计和合成在本领域众所周知(亦参见以上)。按照本发明优选实施方案，所述工具为用于扩增组织蛋白酶C核酸(例如人组织蛋白酶C核酸)的引物组，优选引物组包含SEQ ID No.4和/或5的引物中至少之一。
根据本发明另一优选实施方案，所述工具为用于检测组织蛋白酶C核酸的探针，优选具有SEQ ID No.6的序列的探针。合适的探针的设计和合成在本领域众所周知(亦参见下文标准文献)。
根据本发明又一优选实施方案，所述工具为用于特异性检测组织蛋白酶C蛋白或多肽的抗体。合适的抗体或其功能片段的制备在本领域众所周知，例如通过在合适的情况下在例如弗氏佐剂和/或氢氧化铝凝胶存在下用组织蛋白酶C蛋白或其片段免疫哺乳动物例如兔(参见例如Diamond，B.A.等(1981)The New England Journal of Medicine：1344-1349)。可随后用熟知方法(例如借助柱色谱纯化)自血液分离作为免疫反应结果在动物中形成的多克隆抗体。可例如按照Winter &Milstein(Winter，G.& Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)的已知方法制备单克隆抗体。产生单克隆抗体的合适程序在本领域亦众所周知(参见例如以下所列标准方法的文献)。在本发明情况中，术语抗体或抗体片段也包括抗体或其抗原-结合部分，它们业已重组制备，在适当的情况下还可对其进行修饰，例如嵌合抗体、人源化抗体、多功能抗体、双特异性或多特异性抗体(oligospecific antibody)、单链抗体和F(ab)或F(ab)2片段(参见例如EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213或WO 98/24884)。
本发明另一方面涉及用于测定个体疼痛敏感性的诊断试剂盒，测试试剂盒包括至少一种用于检测生物样品中组织蛋白酶C的工具。
在本发明情况中，应该将测试试剂盒理解为在本申请中鉴定的组分的任意组合，它们在空间上联合共存于功能单元中，并可含有另外组分。
在本发明情况中，测试试剂盒至少包括用于检测生物样品中的组织蛋白酶C(例如量/或突变)的工具，其适当地连同用于实施检测反应(例如借助用于测定组织蛋白酶C活性的抗体、酶反应等来免疫学检测组织蛋白酶C)的合适的缓冲液和/或试剂、和/或样品制备物和任选的用于实施相应检测技术的操作手册。
本发明其它方面涉及治疗方法，例如：
用于治疗正经受疼痛的受治疗者疼痛的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的在所述受治疗者中降低组织蛋白酶C量或活性的组合物。这可为组织蛋白酶C的总量或总活性，或是在某些组织中的量或活性，例如在神经组织、在淋巴组织或免疫系统细胞(例如肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞(例如CD8+T-细胞)等)中的量或活性，其中治疗有效量包括足以改善个体疼痛感觉或敏感性的量。
本发明另一方面涉及用于降低受治疗者疼痛敏感性的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的降低所述受治疗者中(例如在淋巴组织或神经组织或免疫系统细胞中)的组织蛋白酶C的量(例如表达、半衰期)或活性的组合物。
此外，本发明涉及用于调节非人雌性受治疗者的后代中疼痛敏感性的方法，所述方法包括将赋予受调节的组织蛋白酶C表达的核酸转移(例如电穿孔)到受精卵中，将所述受精卵转移到非人代孕母体中，并选出符合其组织蛋白酶C表达特性(与野生型受治疗者例如小鼠相比组织蛋白酶C表达降低或取消)的后代。
本发明另一方面涉及能够降低组织蛋白酶C活性和/或表达的用于治疗疼痛的化合物。
组织蛋白酶C抑制剂为本领域所知，例如肽腈(peptide nitrile)抑制剂(参见例如Methot等，2007，其在此引作参考，尤其参见第20839页图1的不同的组织蛋白酶C-抑制剂结构，例如所述图的Gly-Phe-DMK、Gly4-(I)Phe-DMK和化合物1*和化合物2*)。
为了生产药物，可将本发明组织蛋白酶C调节剂与合适的添加剂或辅助物质一起调配，所述添加剂或辅助物质例如生理缓冲溶液，例如氯化钠溶液、软化水；稳定剂，例如蛋白酶或核酸酶抑制剂，优选抑肽酶、ε-氨基己酸或胃酶抑素A；或多价螯合剂，例如EDTA；凝胶制剂，例如白凡士林、低粘度石蜡和/或黄蜡等，视给药类型而定。
合适的另外的添加剂为例如去污剂，例如Triton X-100或脱氧胆酸钠；还有多元醇，例如聚乙二醇或甘油；糖，例如蔗糖或葡萄糖；两性离子化合物，例如氨基酸(例如甘氨酸或特别是牛磺酸或甜菜碱)和/或蛋白质(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。优选去污剂、多元醇和/或两性离子化合物。
生理缓冲液优选具有大约6.0-8.0的pH(尤其是大约6.8-7.8的pH，特别是大约7.4的pH)和/或大约200-400毫渗克分子/升、优选大约290-310毫渗透分子/升的同渗质量摩尔浓度。通常用合适的有机或无机缓冲液调整药物的pH，例如优选用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪子基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。各种缓冲液的选择通常视所需缓冲液摩尔浓度而定。磷酸盐缓冲液适用于例如注射溶液剂及输注溶液剂。
可以以常规方式给予药物，例如借助口服剂型(例如片剂或胶囊剂)；借助粘膜(例如鼻腔或口腔)；以皮下植入放置形式；借助注射剂、输注剂或凝胶剂，其含有本发明药物。为了治疗上述特定关节病，可表面或局部给予药物，若合适以脂质体复合物形式。此外，可借助透皮治疗系统(TTS)进行治疗，所述系统使得可在时间上控制药物释放。例如，可从EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1获知TTS。
若仅将相对少量(例如约1-约20ml)的溶液剂或混悬剂给予身体，则通常使用注射溶液剂。若给予大量溶液剂或混悬剂(例如1升或更多升)，则通常使用输注溶液剂。因为与输注溶液剂相比，在注射溶液剂情况下仅给予几毫升，所以在注射时血液或组织液的pH及渗透压的小差异本身并不能被注意到，或仅就疼痛感觉方面在不显著的程度上其本身可被注意到。因此，通常不必在使用前稀释本发明制剂。然而，在给予相对大量的情况下，应该在临给药前将本发明制剂简单稀释到获得至少大约等渗溶液的程度。等渗溶液实例为0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注情况下，可例如用无菌水进行稀释，同时可例如经由所谓分流术(bypass)进行给药。
根据本发明不同方面的一个优选实施方案，可作为分离的分子使用组织蛋白酶C、其衍生物或片段。
在本发明情况中，术语“分离的分子”(尤其提及组织蛋白酶C时)是指从天然来源纯化的组织蛋白酶C多核苷酸或多肽以及纯化的重组分子(其中术语纯化的包括部分纯化以及完全纯化)。
重组多肽或多核苷酸分子的制备和从细胞或组织纯化天然存在的分子以及细胞或组织提取物的制备为本领域技术人员众所周知(亦参见例如以下所列标准文献)。
它们包括例如基于所公布的基因组或编码多核苷酸序列经由聚合酶链式反应(PCR)来扩增所需长度的多核苷酸，随后将所产生的多核苷酸克隆到宿主细胞中(参见例如以下所列标准文献)。
在本发明情况中，术语“多肽”是指包含通过肽键彼此连接的氨基酸的分子，其含有以线性方式彼此连接从而形成多肽链的至少50个氨基酸。较短的这类分子称为肽。术语“蛋白质”是指包含至少一条多肽链的分子，但也可指包含不止一条彼此缔合或结合的多肽链的分子。因此，术语“蛋白质”包括术语“多肽”。
以下借助实施例更详细地解释本发明，并非意味着由实施例来限制本发明。
实施例
材料与方法
所用小鼠品系
使用5种不同的近交小鼠品系：AKR/J(AKR)、CBA/J(CBA)、C3H/HeJ(C3H)、C57BL/6J(B6)和C58/J(C58)。从Jackson实验室(BarHarbor，ME，USA)获得小鼠。业已证明这些小鼠品系就若干体内疼痛测量值方面而言显著不同(Mogil等1999)。
总RNA分离
用PicoPureTM RNA分离试剂盒(Arcturus)按照制造商使用说明从DRG(背根神经节)分离总RNA。用2100生物分析仪和RNA 6000NanoLabChipTM试剂盒(Agilent)评估RNA质量。
Affymetrix GeneChip
TM
微阵列
按照Baugh，L.R，Hill，A.A.，Brown，E.L.和Hunter，C.P.(2001)Nucleic Acids Res.29，e29用500ng含100pM T7-(dT)24寡聚体(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT24SEQ ID NO：4)的总RNA，并遵循制造商使用说明用SuperScript II逆转录酶合成第一链cDNA。合成双链cDNA，然后用苯酚-氯仿接着乙醇沉淀步骤提取。用BioArray高产RNA转录标记试剂盒(BioArray High Yield RNA Transcription Labeling kit)(Enzo)遵循制造商使用说明用双链cDNA样品实施体外转录反应。在37℃让转录反应物孵育16小时。用RNeasyTM Mini试剂盒(Qiagen)方案进行RNA清理来纯化cRNA，用分光光度计定量测定。用RNA片段化缓冲液(200mM Tris-乙酸、500mM KOAc、150mM MgOAc、pH 8.1)使生物素-标记的cRNA片段化。遵循制造商使用说明进行小鼠基因组430 2.0 GeneChipsTM(Affymetrix)杂交及染色。用GeneChipTM 3000扫描仪对微阵列扫描，输入扫描的数据并用Resolver v5.1表达数据分析软件(Rosetta Biosoftware)分析。
L5脊椎神经横切和sham外科程序
在麻醉小鼠中使左L5脊椎神经露出，然后部分去除横突(transverse process)。在与L4脊椎神经分开后，横切L5脊椎神经。Sham手术与L5脊椎神经横切手术相同，但不横切L5脊椎神经(参见DeLeo等2000)。
测定缩足阈值
用动态足底触觉测量仪(dynamic plantar aesthesiometer)评估缩足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)(参见Szabo等2005)。在小鼠适应金属网地板隔离间后，将刺激物放置在动物的后爪下，由电动执行器驱动的直金属丝触及足底面，施加逐渐加大的力，直到动物移开脚爪(缩足阈值，PWT)。评估经过手术的身体同侧后爪和身体对侧后爪的PWT。每只动物仅使用一次。在所有动物实验中，遵循意识清醒动物的研究伦理指导方针，并由当地伦理委员会批准该程序。
相关性分析
为了进行相关性分析，将每一只神经横切动物(Chung动物)的“疼痛表型”界定为C1-S1，其中C1＝ln(身体同侧PWT/身体对侧PWT)，S1＝平均同一品系的所有sham动物ln(身体同侧PWT/身体对侧PWT)。
对每一只Chung动物界定两个差异转录调控测量值，每个测量的基因基于其强度表达数据。对于各个基因及动物，采用“原始强度测量值”作为由Resolver表达数据分析软件(v5.1)计算的强度测量值。对特定基因和Chung动物，计算“log比率测量值”ln(C2/S2)，其中C2＝Chung表达强度，S2＝平均同一品系的所有sham动物Sham表达强度。
在计算相关性之前，过滤基因集合以排除表达低于噪声水平及无显著的Chung对比sham调节的基因。符合条件的基因应该在至少60％的绝对倍数变化≥1.5的Chung动物中或至少20％的绝对倍数变化≥2.0的Chung动物中被调控。此外，相应的基因表达应该在至少5只由各自强度p-值＜0.001界定的动物中为可检测(“存在”)的。
用R软件包(http://www.r-project.org/)来计算每一基因在疼痛表型分数与所界定的转录调节测量值之一之间的Pearson相关系数。基于这些，按照Storey等(2002)的方法产生统计显著性p-值及相应的假发现率(false-discovery rate，FDR)。认为在“log比率测量值”或“强度测量值”下具有FDR＜0.05的基因显著相关。
附图说明
图1：组织蛋白酶C-相关曲线
图1显示每一个体小鼠在L5DRG中其神经性疼痛表型(机械超敏感性，X-轴)和相应的组织蛋白酶C的基因调控(log比率(Chung对比Sham对照)，Y-轴)。根据所用品系对小鼠数据进行颜色编码。实施了Pearson相关性分析，显示疼痛表型和组织蛋白酶C基因调控这两个参数显著正相关。这意味着对于个体小鼠，在经过神经手术的Chung小鼠L5DRG中组织蛋白酶C表达越高，机械痛觉过敏越显著，其如行为测试所显示。这种显著的相关性表明组织蛋白酶C基因表达对于诱导神经性疼痛表型的因果关系。
图2：组织蛋白酶C-强度数据
在chung或sham手术后在AKR、CBA和C57品种的各个小鼠的L5神经节中组织蛋白酶C表达的绝对值。
图3：由Affymetrix探针组1416382_at(小鼠基因组4302.0微阵列)(SEQ ID NO.7)检测的小鼠组织蛋白酶C mRNA片段。
图4：NM_001814的组织蛋白酶C的cDNA序列(SEQ ID NO.1)。
图5：Swiss-Prot HUMAN_CATC P53634的组织蛋白酶C蛋白序列(SEQ ID NO.2)。
图6：用于检测SEQ ID NO.1的人组织蛋白酶C cDNA的引物组(SEQ ID NO 4和5)。
图7：用于检测小鼠组织蛋白酶C cDNA的探针(SEQ ID NO.6)。
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标准实验方法文献
如果没有相反表示，那么按照或可按照以下标准文献实施标准实验室方法：
Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.第545页；
Current Protocols in Molecular Biology；regularly updated，例如第2000卷；Wiley & Sons，Inc；编辑：Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；定期更新；Wiley&Sons，Inc；编辑：Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；定期更新；Wiley & Sons，Inc；编辑：John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield.
Molecular Biology of the Cell；第三版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York & London，1994；
Short Protocols in Molecular Biology，第5版，by Frederick M.Ansubel(编辑)，Roger Brent(编辑)，Robert E.Kingston(编辑)，David D.Moore(编辑)，J.G.Seidman(编辑)，John A.Smith(编辑)，Kevin Struhl(编辑)，2002年12月，John Wiley & Sons，Inc.，New York；
Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook.C.A.Pinkert编辑；Academic Press Inc.，San Diego，California，1994(ISBN：0125571658)；
Gene targeting：A Practical Approach，第2版，Joyner AL编辑。2000.IRL Press at Oxford University Press，New York；
Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual.Nagy，A，Gertsenstein，M.，Vintersten，K.，Behringer，R.，2003，Cold Spring HarborPress，New York；
Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985(对于生理上耐受的盐(无机或有机)，参见尤其是第1418页)。
实验室方法标准文献
如果没有相反表示，那么按照或可按照以下标准文献所列出的标准方法实施实验室方法：
Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.第545页或Current Protocols in Molecular Biology；
Current Protocols in Molecular Biology；定期更新，例如第2000卷；John Wiley & Sons，Inc；编辑：Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；
Current Protocols in Human Genetics；定期更新，例如第2003卷；John Wiley & Sons，Inc；编辑：Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith；
Current Protocols in Protein Science；定期更新，例如第2003卷；John Wiley & Sons，Inc；编辑：John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；
Molecular Biology of the Cell；第3版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York & London，1994；
Gene Targeting：a practical approach(1995)，编辑：A.L.Joyner，IRL Press；
Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985。
Claims (58)
1.组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物用于鉴定调节疼痛的化合物的用途。
2.异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的非人转基因动物用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
3.异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的非人转基因动物作为用于提高疼痛敏感性的模型系统的用途。
4.非人组织蛋白酶C敲除动物用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
5.非人组织蛋白酶C敲除动物作为用于降低疼痛敏感性的模型系统的用途。
6.异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的细胞用于鉴定调节疼痛的化合物的用途。
7.异源表达组织蛋白酶C或其功能片段的细胞作为用于提高疼痛敏感性的模型系统的用途。
8.组织蛋白酶敲除细胞用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
9.组织蛋白酶敲除细胞作为用于降低疼痛敏感性的模型系统的用途。
10.异源表达与组织蛋白酶C启动子和/或增强子表达上连接的报告基因或其功能片段的细胞用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的用途。
11.鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少两份样品；
b.让含有组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的一份样品与化合物接触；
c.测定在化合物存在下组织蛋白酶C的活性；
d.测定在缺乏化合物时组织蛋白酶C的活性；和
e.将c)的组织蛋白酶C活性与d)的组织蛋白酶C活性进行比较。
12.用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物与测试化合物接触；和
b.测定所述测试化合物是否调节组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的活性。
13.用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让具有可检测的量或活性的组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的细胞与测试化合物接触；
b.测定所述测试化合物是否能够调节细胞中存在的组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的量或活性。
14.用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.让编码组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的核酸与测试化合物在转录活性系统中接触；和
b.测定在所述化合物存在下在所述系统中存在的编码组织蛋白酶C蛋白或其功能片段或衍生物的mRNA的量；和
c.测定所述化合物是否能够调节所述系统中存在的编码组织蛋白酶C蛋白或功能片段或衍生物的mRNA的量。
15.用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.提供用包含可操作地连接于报告基因或其功能片段的组织蛋白酶C基因或其功能片段的启动子的核酸载体转染的细胞；
b.提供用包含没有可操作地连接于功能组织蛋白酶C启动子的报告基因或其功能片段的对照载体转染的细胞；
c.测定在测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性；
d.测定在没有所述测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性。
16.用于鉴定或分析调节疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.选择作为测试化合物的调节组织蛋白酶C活性的化合物；和
b.将所述测试化合物给予感觉疼痛的受治疗者，以测定疼痛是否受到调节。
17.用于鉴定或分析在受治疗者中调节和/或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.测定在一种或多种测试化合物存在下组织蛋白酶C或其功能片段或衍生物的生物学活性，以鉴定一种或多种调节组织蛋白酶C生物学活性的调节化合物；和
b.检验所述一种或多种调节化合物降低受治疗者疼痛、疼痛感觉或疼痛敏感性的能力。
18.用于分析个体痛阈的方法，所述方法包括分析与一种或多种参考样品相比所采的所述个体样品中的组织蛋白酶C的量，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量，其中存在较高的量表明所述个体的疼痛敏感性增加，存在较低的量表明所述个体的疼痛敏感性降低。
19.用于调整预防和/或治疗个体疼痛的药物剂量的方法，所述方法包括检查所采的个体样品，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶CmRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白质的量，所述剂量根据所采个体样品中的蛋白质和/或mRNA的量是否不同于一种或多种参考样品的蛋白质和/或mRNA的量来调整，其中在所采个体样品中组织蛋白酶C的量较高表明需要较高剂量，在个体样品中组织蛋白酶C的量较低表明需要较低剂量。
20.用于检测组织蛋白酶C的工具在用于通过分析采自待检个体身体的生物样品来诊断个体疼痛敏感性提高中的用途。
21.用于诊断个体疼痛敏感性的测试试剂盒，所述测试试剂盒包括至少一种用于检测生物样品中组织蛋白酶C的工具。
22.用于治疗正经受疼痛的受治疗者现有的疼痛的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的在所述受治疗者中降低组织蛋白酶C的量或活性的组合物。
23.用于降低受治疗者疼痛敏感性的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的在所述受治疗者中降低组织蛋白酶C的量或活性的组合物。
24.用于在非人雌性受治疗动物后代中调节疼痛敏感性的方法，所述方法包括将赋予受调节的组织蛋白酶C表达的核酸转移到受精卵中，选择符合其组织蛋白酶C表达特性(受调节)的后代。
25.能够降低组织蛋白酶C活性和/或表达的用于治疗疼痛的化合物。
26.权利要求1-3、6、8及10中任一项的用途或权利要求11-17中任一项的方法，其中所述调节为降低、取消或预防疼痛。
27.权利要求1-3、6、8及10中任一项的用途或权利要求11-17中任一项的方法，其中所述调节为增加。
28.权利要求27的用途或方法，其中所述化合物为用于预防或治疗疼痛的化合物。
29.上述权利要求中任一项的用途、测试试剂盒或方法，其中组织蛋白酶C为哺乳动物组织蛋白酶C，优选人组织蛋白酶C。
30.上述权利要求中任一项的用途、测试试剂盒、方法或化合物，其中所述疼痛为急性或慢性疼痛，优选为慢性疼痛。
31.上述权利要求中任一项的用途、测试试剂盒、方法或化合物，其中所述疼痛为骨关节炎性、炎症性疼痛或神经性疼痛。
32.权利要求1-3、6、8及10中任一项的用途或权利要求11-17中任一项的方法，其中组织蛋白酶C作为分离的蛋白质或多核苷酸使用。
33.权利要求1-3、6、8及10中任一项的用途或权利要求11-17中任一项的方法，其中组织蛋白酶C为：
a.包含SEQ ID NO.2的序列或由其组成的多肽或其功能片段；或
b.由包含SEQ ID NO 1的序列或由其组成的多核苷酸编码的多肽；或
c.由能够在严格条件下与由SEQ ID NO.1组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽。
34.权利要求1-3、6、8及10中任一项的用途或权利要求11-17中任一项的方法，其中组织蛋白酶C为：
a.包含SEQ ID NO.1的序列或由其组成的多核苷酸；或
b.能够在严格条件下与由SEQ ID NO.1组成的多核苷酸杂交的多核苷酸；或
c.编码SEQ ID NO.2的组织蛋白酶C或其功能片段的多核苷酸。
35.权利要求13或14的方法，其中使用表达重组的组织蛋白酶C的细胞。
36.权利要求11-17中任一项的方法，其中组织蛋白酶C活性的测定涉及其蛋白酶活性。
37.权利要求6-10中任一项的用途或权利要求13或14中任一项的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞，优选为啮齿动物细胞。
38.权利要求2-5中任一项的用途或权利要求25的方法，其中所述非人动物为哺乳动物，优选为啮齿动物，更优选为小鼠。
39.权利要求10的用途或权利要求15的方法，其中所述报告基因为。
40.权利要求21的用途、权利要求19或20的方法或权利要求22的测试试剂盒，其中所述样品为哺乳动物样品，优选人样品。
41.权利要求21的用途、权利要求19或20的方法或权利要求22的测试试剂盒，其中所述样品为组织学样品、活检样品、细胞提取物、一个或多个细胞或所采集的体液。
42.权利要求21的用途或权利要求22的测试试剂盒，其中所述用于检测的工具为用于检测组织蛋白酶C DNA的工具。
43.权利要求42的用途或测试试剂盒，其中所述工具为引物或引物组、合适的探针或序列特异性抗-DNA抗体。
44.权利要求14、19或20中任一项的方法，其中优选用扩增组织蛋白酶C cDNA的一种或多种合适的引物或适于在标准条件下与组织蛋白酶C cDNA或mRNA杂交的一种或多种探针来分析mRNA量的变化。
45.权利要求44的方法，其中借助PCR、RNA杂交、阵列杂交或芯片杂交来分析mRNA的量。
46.权利要求21的用途或权利要求22的测试试剂盒，其中所述用于检测的工具为用于检测生物样品中存在的组织蛋白酶C mRNA和/或蛋白的工具。
47.权利要求46的用途或测试试剂盒，其中所述用于检测组织蛋白酶C蛋白的工具为抗体。
48.权利要求14、19或20中任一项的方法，其中测定组织蛋白酶C蛋白的量的变化。
49.权利要求48的方法，其中在至少一种抗体的帮助下检测所述蛋白质。
50.权利要求48或49的用途、方法或测试试剂盒，其中经由ELISA、蛋白质印迹或蛋白质芯片来实施所述检测。
51.权利要求48或49的用途、方法或测试试剂盒，其中借助免疫组织化学或免疫放射化学检测方法来实施检测。
52.权利要求17或18中任一项的方法，其中降低组织蛋白酶C的量。
53.权利要求52的方法，其中在神经组织中降低所述组织蛋白酶C的量。
54.权利要求17或18中任一项的方法，其中降低组织蛋白酶C的活性。
55.权利要求54的方法，其中所述降低的组织蛋白酶C活性为蛋白酶活性。
56.权利要求54的方法，其中在神经组织中降低组织蛋白酶C的活性。
57.权利要求19的方法，其中在神经组织或淋巴组织中调节所述表达。
58.权利要求22或23的方法或权利要求25的化合物，其中所述化合物为组织蛋白酶C的可逆的肽腈抑制剂，优选为组织蛋白酶C的二肽α-氨基乙腈抑制剂。
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